專利名稱：一種包封有絲狀支架的微膠囊及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物微膠囊，特別是涉及一種包封有絲狀支架的微膠囊及其制備和應用。
背景技術：
20世紀70年代末，Franklin Lim首次將微囊化固定化技術用于動物細胞的培養(yǎng)， 隨后，Damon Biotech公司將該技術固定化培養(yǎng)雜交瘤細胞和骨髓瘤細胞分別生產單克隆 抗體和重組蛋白，同時，該技術作為組織細胞或基因修飾細胞的免疫隔離和運載工具，也被 廣泛用于細胞移植。在眾多的微膠囊中，海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊使用較多，應用的也較 為成熟。通常，細胞在微囊內聚集成團狀，并貼附在微囊的內壁上，隨著細胞的增殖，細胞團 不斷增大，由于細胞團對營養(yǎng)物質，特別是溶解氧傳遞的阻力較大，處于細胞團中心的細胞 出現壞死現象。有報道稱當細胞團的粒徑超過100微米時，細胞團中心的細胞便開始出現 壞死。
發(fā)明內容
針對上述問題，本發(fā)明提供一種包封有絲狀支架的微膠囊及其制備和應用，微膠 囊內的支架在細胞生長增殖過程中限制其聚集形成大的細胞團，而是形成多個小細胞團。 在小細胞團內，營養(yǎng)物質能夠得到有效的傳遞，細胞的活性將不再受到影響。為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為一種包封有絲狀支架的微膠囊，在傳統(tǒng)的海藻酸鈉-聚賴氨酸或海藻酸鈉-殼聚 糖微膠囊內包封有絲狀支架，形成一種相互連通的、無規(guī)則的、網格狀空間結構，將微膠囊 內腔通過固態(tài)支架分割成體積更小的腔室，一方面提供更大的細胞貼壁表面，另一方面限 制細胞聚集形成大團，而是形成分散的多個小細胞團，改善了營養(yǎng)物質傳遞，利于細胞的生 長和生產。所述微膠囊的制備方法，1)組織工程用絲狀支架與海藻酸鈉溶液(質量濃度10_30g/L)按體積比 1 20-1 80的比例攪拌混合，絲的直徑在1-20 μ m，絲的長度為50 μ m-5000 μ m;形成均 勻混合的含有絲狀支架的海藻酸鈉漿液；2)然后再將含有絲狀支架的海藻酸鈉漿液與動物細胞(細胞濃度為105-107/ml) 混合，將該混合液通過微膠囊制備儀，形成200-1000 μ m粒徑可控、分布均勻的含有絲狀支 架的微膠囊。上述方法的具體操作過程如下1)絲狀支架的準備將組織工程用絲狀支架于溶液(例如生理鹽水，絲狀支架與 溶液的比例為1 5-1 100)中，于高速勻漿機(轉速為8000-24000rpm)勻漿，絲的直徑 在 1-20 μ m,絲的長度為 50 μ m-5000 μ m ；2)將絲狀支架與海藻酸鈉溶液(質量濃度10_30g/L)按體積比1 20_1 80混合，再按常規(guī)方法將動物細胞與該勻漿液(細胞濃度為IO5-IO7AiL)混合均勻形成混合液；3)通過微膠囊制備儀，將步驟2、的混合液在高壓靜電場作用下，滴入氯化鈣溶液 中，形成海藻酸鈣微膠珠，并與聚賴氨酸溶液或殼聚糖溶液(質量濃度分別為0. 5g/L和5g/ L)反應成膜，得微膠囊；用檸檬酸鈉溶液將制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠 囊內形成液體環(huán)境；即得產品。所采用的氯化鈣溶液濃度在0. 05-0. 3mol/L ；所述的海藻酸鈣膠珠與聚賴氨酸或 殼聚糖溶液反應成膜時間在10-60分鐘。所述包封有絲狀支架的微膠囊用于貼壁或懸浮培養(yǎng)的動物細胞的微囊化培養(yǎng)。本發(fā)明制備的微膠囊具有如下優(yōu)點與傳統(tǒng)的微膠囊相比，該支架將為微囊內的生長細胞提供附著支架，改善微囊化 細胞的生長分布趨勢，細胞在生長代謝過程中不會聚集形成大團，而是形成多個小細胞團， 在小細胞團內，營養(yǎng)物質能夠得到有效的傳遞，細胞的活性不再受到影響。
圖1為絲狀支架與海藻酸鈉溶液的體積比為1 20時，制備的微膠囊光學照片； (圖中標尺為IOOym)圖2為絲狀支架與海藻酸鈉溶液的體積比為1 50時，制備的微膠囊光學照片； (圖中標尺為IOOym)圖3為絲狀支架與海藻酸鈉溶液的體積比為1 80時，制備的微膠囊光學照片； (圖中標尺為IOOym)圖4為在有絲狀支架的微膠囊內培養(yǎng)CHO細胞時的細胞形態(tài)光學照片。圖5為在沒有絲狀支架的微膠囊內培養(yǎng)CHO細胞時的細胞形態(tài)光學照片。圖6為在有絲狀支架的微膠囊內培養(yǎng)McF7細胞時的細胞形態(tài)光學照片。圖7為在沒有絲狀支架的微膠囊內培養(yǎng)McF7細胞時的細胞形態(tài)光學照片。圖8為在有絲狀支架的微膠囊內培養(yǎng)HepG2細胞時的細胞形態(tài)光學照片。圖9為在沒有絲狀支架的微膠囊內培養(yǎng)HepG2細胞時的細胞形態(tài)光學照片。圖10為含有絲狀支架及沒有支架的兩組微膠囊培養(yǎng)CHO細胞時，細胞的生長曲 線。
具體實施例方式添加的絲狀支架是由天然高分子材料如殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸、硫酸軟 骨素或合成高分子材料如聚醚酰亞胺、聚賴氨酸通過靜電紡絲或流體紡絲的方法制 成(文獻 1 :Xie JW, Li XR, Xia YN. Putting ElectrospunNanofibers to Work for Biomedical Research. Macromol. Rapid Commun. 2008 ；29 :1775-1792.文獻2:馬小軍， 王建政，于煒婷，王為，謝威揚，黃曉波.海藻酸鈉/殼聚糖復合流體紡絲方法，國內專利， 申請?zhí)?00810013113. X.文獻 3 :Wang JZ，Huang XB, Jing X，et al. Hydro-spinning A noveltechnology for making alginate/chitosan fibrous scaffold. Journal of BiomedicalMaterials Research :PartA. Accepted.)；添加的海綿狀支架是由天然高分子材料如膠原、明膠等通過與海藻酸鈉溶液共混方式制備成水凝膠態(tài)海綿狀支架；實施例11)將組織工程用絲狀支架置于生理鹽水中(絲狀支架與溶液的比例為1 10)， 于高速勻漿機(轉速為24000rpm)勻漿5分鐘，然后離心(轉速5000rpm) 10分鐘，棄上清， 得斷裂后的支架，絲狀支架的直徑為5-10 μ m,長度為50-1000 μ m。2)將斷裂后的絲狀支架與海藻酸鈉溶液按1 20的體積比混合，形成均勻混合的 勻漿液，在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. lmol/L氯化鈣溶液中，并進行凝膠化 反應30分鐘，制備出粒徑在800 μ m的海藻酸鈣膠珠。3)將上述制得的海藻酸鈣膠珠與0. 5g/L聚賴氨酸溶液反應10分鐘成膜，形成微 膠囊，然后用生理鹽水清洗3遍。4)用55mmol/L檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝 膠液化，反應8分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出含有絲狀支架的微膠囊(見圖1)。實施例21)將組織工程用絲狀支架置于生理鹽水中(絲狀支架與溶液的比例為1 50)， 于高速勻漿機(轉速為20000rpm)勻漿5分鐘，然后離心(轉速5000rpm) 10分鐘，棄上清， 得斷裂后的支架，絲狀支架的直徑為5-10 μ m,長度為50-3000 μ m。2)將斷裂后的絲狀支架與海藻酸鈉溶液按1 50的體積比混合，形成均勻混合的 勻漿液，在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. lmol/L氯化鈣溶液中，并進行凝膠化 反應30分鐘，制備出粒徑在700 μ m的海藻酸鈣膠珠。3)將上述制得的海藻酸鈣膠珠與5g/L殼聚糖溶液反應10分鐘成膜，形成微膠囊， 然后用生理鹽水清洗3遍。4)用55mmol/L檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝 膠液化，反應6分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出含有絲狀支架的微膠囊(見圖2)。實施例31)將組織工程用絲狀支架置于生理鹽水中(絲狀支架與溶液的比例為1 80)， 于高速勻漿機(轉速為IOOOOrpm)勻漿5分鐘，然后離心(轉速5000r pm) 10分鐘，棄上清， 得斷裂后的支架，絲狀支架的直徑為5-20 μ m,長度為50-5000 μ m。2)將斷裂后的絲狀支架與海藻酸鈉溶液按1 80的體積比混合，形成均勻混合的 勻漿液，在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. Imo 1/L氯化鈣溶液中，并進行凝膠化 反應30分鐘，制備出粒徑在600 μ m的海藻酸鈣膠珠。3)將上述制得的海藻酸鈣膠珠與5g/L殼聚糖溶液反應10分鐘成膜，形成微膠囊， 然后用生理鹽水清洗3遍。4)用55mmol/L檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝 膠液化，反應5分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出含有絲狀支架的微膠囊(見圖3)。實施例41)將組織工程用絲狀支架置于生理鹽水中(絲狀支架與溶液的比例為1 100)， 于高速勻漿機(轉速為20000rpm)勻漿5分鐘，然后離心(轉速5000rpm) 10分鐘，棄上清， 得斷裂后的支架，絲狀支架的直徑為5-20 μ m,長度為50-3000 μ m。2)將斷裂后的絲狀支架與海藻酸鈉溶液按1 25的體積比混合，形成均勻混合的5勻漿液，再將中華倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)與該勻漿液混合均勻形成混合液，細胞的濃度 是 IXlOVmLo3)將混合液在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. lmol/L氯化鈣溶液中， 并進行凝膠化反應30分鐘，制備出粒徑在500 μ m的海藻酸鈣膠珠。4)將上述制得的海藻酸鈣膠珠與0. 5g/L聚賴氨酸溶液反應10分鐘成膜，形成微 膠囊，然后用生理鹽水清洗3遍。5)用55mmo 1/L檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝 膠液化，反應6分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出含有絲狀支架的微膠囊。6)將上述制備的微囊化細胞培養(yǎng)8天后，顯微鏡下觀察其形態(tài)(見圖4)，細胞在 微膠囊內聚集形成多個小細胞團。實施例51)將組織工程用絲狀支架置于生理鹽水中(絲狀支架與溶液的比例為1 100)， 于高速勻漿機(轉速為20000rpm)勻漿5分鐘，然后離心(轉速5000rpm) 10分鐘，棄上清， 得斷裂后的支架，絲狀支架的直徑為5-20 μ m,長度為50-2000 μ m。2)將斷裂后的絲狀支架與海藻酸鈉溶液按1 40的體積比混合，形成均勻混合的 勻漿液，再將乳腺癌McF7細胞與該勻漿液混合均勻形成混合液，細胞的濃度是2 X IOVmL03)將混合液在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. 15mol/L氯化鈣溶液中， 并進行凝膠化反應30分鐘，制備出粒徑在400 μ m的海藻酸鈣膠珠。4)將上述制得的海藻酸鈣膠珠與0. 5g/L聚賴氨酸溶液反應10分鐘成膜，形成微 膠囊，然后用生理鹽水清洗3遍。5)用55mmol/L檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝 膠液化，反應6分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出含有絲狀支架的微膠囊。6)將上述制備的微囊化細胞培養(yǎng)4天后，顯微鏡下觀察其形態(tài)(見圖6)，細胞在 微膠囊內聚集形成多個小細胞團。實施例61)將組織工程用絲狀支架置于生理鹽水中(絲狀支架與溶液的比例為1 100)， 于高速勻漿機(轉速為20000rpm)勻漿5分鐘，然后離心(轉速5000rpm) 10分鐘，棄上清， 得斷裂后的支架，絲狀支架的直徑為5-20 μ m,長度為50-2000 μ m。2)將斷裂后的絲狀支架與海藻酸鈉溶液按1 60的體積比混合，形成均勻混合的 勻漿液，絲狀支架的直徑5-15 μ m,長度為50-4000 μ m,再將肝癌細胞系H印G2細胞與該勻 漿液混合均勻形成混合液，細胞的濃度是2 X 106/mL。3)將混合也在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. 20mol/L氯化鈣溶液中， 并進行凝膠化反應30分鐘，制備出粒徑在600 μ m的海藻酸鈣膠珠。4)將上述制得的海藻酸鈣膠珠與0. 5g/L聚賴氨酸溶液反應10分鐘成膜，形成微 膠囊，然后用生理鹽水清洗3遍。5)用35mmol/L檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝 膠液化，反應6分鐘，生理鹽水清洗3遍后制備出含有絲狀支架的微膠囊。6)將上述制備的微囊化細胞培養(yǎng)9天后，顯微鏡下觀察其形態(tài)(見圖8)，細胞在 微膠囊內聚集形成多個小細胞團。
比較例1將濃度為15g/L海藻酸鈉溶液與中華倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)混合，細胞的濃 度是1 X IoVmL ；在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. 15mol/L氯化鈣溶液中，并進 行凝膠化反應30分鐘，制備出粒徑在600 μ m的海藻酸鈣膠珠；將制得的海藻酸鈣膠珠與 0. 5g/L聚賴氨酸溶液反應10分鐘成膜，形成微膠囊，然后用生理鹽水清洗3遍。用55mmol/ L檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，反應6分鐘，生 理鹽水清洗3遍后制備出微膠囊。將上述制備的微囊化細胞培養(yǎng)8天后，顯微鏡下觀察其 形態(tài)(見圖幻，細胞在微囊內聚集形成一個大細胞團。細胞生長曲線顯示，在相同細胞接種 密度，相同微膠囊粒徑前提下，細胞增殖速度和增殖量不如含支架微膠囊(見圖10)。比較例2將濃度為15g/L海藻酸鈉溶液與乳腺癌McF7細胞混合，細胞的濃度是2 X 106/mL ； 在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. 15mol/L氯化鈣溶液中，并進行凝膠化反應30 分鐘，制備出粒徑在500 μ m的海藻酸鈣膠珠；將制得的海藻酸鈣膠珠與0. 5g/L聚賴氨酸溶 液反應10分鐘成膜，形成微膠囊，然后用生理鹽水清洗3遍。用55mmol/L檸檬酸鈉溶液浸 泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，反應6分鐘，生理鹽水清洗3遍后 制備出微膠囊。將上述制備的微囊化細胞培養(yǎng)4天后，顯微鏡下觀察其形態(tài)(見圖7)，細胞 在微囊內聚集形成一個大細胞團，細胞生長實驗結果顯示，在相同細胞接種密度，相同微膠 囊粒徑前提下，細胞增殖速度和增殖量不如含支架微膠囊。比較例3將濃度為15g/L海藻酸鈉溶液與肝癌細胞系!fepG2細胞混合，細胞的濃度是 2X IOVmL ；在大功率微膠囊制備儀的高壓電場下滴入0. 15mol/L氯化鈣溶液中，并進行凝 膠化反應30分鐘，制備出粒徑在500 μ m的海藻酸鈣膠珠；將制得的海藻酸鈣膠珠與0. 5g/ L聚賴氨酸溶液反應10分鐘成膜，形成微膠囊，然后用生理鹽水清洗3遍。再用55mmol/L 檸檬酸鈉溶液浸泡微膠囊，將上述制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，反應6分鐘，生理 鹽水清洗3遍后制備出微膠囊。將上述制備的微囊化細胞培養(yǎng)9天后，顯微鏡下觀察其形 態(tài)(見圖9)，細胞在微囊內聚集形成一個大細胞團，細胞生長實驗結果顯示，在相同細胞接 種密度，相同微膠囊粒徑前提下，細胞增殖速度和增殖量不如含支架微膠囊。
權利要求
1.一種包封有絲狀支架的微膠囊，其特征在于在傳統(tǒng)的海藻酸鈉-聚賴氨酸或海藻 酸鈉-殼聚糖微膠囊內包封有絲狀支架，形成一種相互連通的、無規(guī)則的、網格狀空間結 構，將微膠囊內腔通過固態(tài)支架分割成體積更小的腔室，一方面提供更大的細胞貼壁表面， 另一方面限制細胞聚集形成大團，而是形成分散的多個小細胞團，改善了營養(yǎng)物質傳遞，利 于細胞的生長和生產。
2.—種權利要求1所述微膠囊的制備方法，其特征在于1)組織工程用絲狀支架與海藻酸鈉溶液按體積比1 20-1 80的比例攪拌混合，海 藻酸鈉溶液質量濃度10-30g/L，絲的直徑在1-20 μ m，絲的長度為50 μ m-5000 μ m ；形成均 勻混合的含有絲狀支架的海藻酸鈉漿液；2)然后再將含有絲狀支架的海藻酸鈉漿液與動物細胞混合，將該混合液通過微膠囊制 備儀，形成200-1000 μ m粒徑可控、分布均勻的含有絲狀支架的微膠囊。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于具體操作過程如下1)絲狀支架的準備將組織工程用絲狀支架置于溶液中，于高速勻漿機勻漿，絲的直 徑在1-20 μ m,絲的長度為50 μ m-5000 μ m ；2)將絲狀支架與海藻酸鈉溶液按體積比1 20-1 80混合，海藻酸鈉溶液質量濃度 10-30g/L,再按常規(guī)方法將動物細胞與該勻漿液混合均勻形成混合液，細胞濃度為IO5-IO8/ mL ；3)通過微膠囊制備儀，將步驟幻的混合液在高壓靜電場作用下，滴入氯化鈣溶液中， 形成海藻酸鈣微膠珠，并與質量濃度為0. 5g/L聚賴氨酸溶液或質量濃度5g/L殼聚糖溶液 反應成膜，得微膠囊；用檸檬酸鈉溶液將制得的微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內 形成液體環(huán)境；即得產品。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于所采用的氯化鈣溶液濃度在0. 05-0. 3mo 1/L ；所述的海藻酸鈣膠珠與聚賴氨酸或殼聚 糖溶液反應成膜時間在10-60分鐘。
5.一種權利要求1所述微膠囊的應用，其特征在于所述包封有絲狀支架的微膠囊用 于貼壁或懸浮培養(yǎng)的動物細胞的微囊化培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物微膠囊，特別是涉及一種包封有絲狀支架的微膠囊及其制備和應用，在傳統(tǒng)的海藻酸鈉-聚賴氨酸或海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊內包封有絲狀支架，形成一種相互連通的、無規(guī)則的、網格狀空間結構，將微膠囊內腔通過固態(tài)支架分割成體積更小的腔室。在傳統(tǒng)的微膠囊內，細胞聚集并生長形成較大的細胞團，由于細胞團內物質傳遞的限制，導致細胞出現壞死。本發(fā)明制備的微膠囊內的支架可以為細胞提供附著作用，并改善微囊內細胞的生長分布趨勢，使細胞在微囊內聚集形成多個細胞聚集體，既改善了營養(yǎng)物質傳遞，又滿足了細胞的類組織化三維培養(yǎng)。
文檔編號C12N11/10GK102051354SQ20091021962
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月4日 優(yōu)先權日2009年11月4日
發(fā)明者于煒婷, 張英, 王建政, 馬小軍, 黃曉波 申請人:中國科學院大連化學物理研究所