專利名稱：利用轉錄因子轉染牛體細胞成為誘導性多能干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種利用轉錄因子轉染牛體細胞成為誘
導性多能干細胞的方法。
背景技術：
2006年，日本學者Yamanaka[1]首次報道，利用小鼠轉錄因子0ct4， Sox2， c_Myc， Klf4組合共同轉染小鼠體細胞，獲得了小鼠的誘導性多能干細胞(inducted pluripotent stem cells, iPSCs)。隨后，世界范圍內掀起了誘導多潛能干細胞的研究熱潮。從動物品 種、轉錄因子種類和數量、轉錄因子組合方式以及外源基因導入方法等等許多方面都作了 研究。2007年Yamanaka[2]又利用同樣的轉錄因子成功得到人類的iPSCs ;同年，Yu(俞君 英)與Thomson[3]等人利用用另外四種轉錄因子(0ct3/4， Sox2，Nanog， Lin28)也獲得了人 類iPS細胞。隨后又有恒河猴[4]、大鼠[5]、豬[6]等動物iPSCs獲得成功的報道(Li et al.， 2009 ;Liao et al.，2009;Liu et al. ， 2008)。由于iPSCs與胚胎干細胞(ESCs)具有非常相 似的生物學特性，所以在現有的iPSCs的建立過程中都借鑒了 ES細胞的培養(yǎng)條件，例如應 用ESCs的培養(yǎng)液，應用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養(yǎng)層來提供多種生長因子以維持 iPSCs的多能性。但是，在家畜，例如豬、牛、羊等動物還沒有公認的建系的胚胎干細胞[7]， 從早期胚胎中分離這些胚胎干細胞非常困難，而且培養(yǎng)體系沒有完全確定?，F有的胚胎干 細胞培養(yǎng)條件，都是必須采用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為培養(yǎng)層，才能維持ESCs處于 未分化狀態(tài)。在ESCs培養(yǎng)體系中應用小鼠胚胎成纖維細胞，直接引入了異種動物細胞，結 果直接影響了 ESCs細胞的臨床應用，也增加了培養(yǎng)過程中的工作量與難度。自從1981年 小鼠胚胎干細胞[8]與1998年人類胚胎干細胞[9]建系以來，至今已經過去了二十多年，可是 家畜胚胎干細胞至今難以建系，則說明家畜要從早期胚胎材料分離獲得胚胎干細胞還存在 著許多技術上與理論上的制約因素。因此，利用基因工程原理，將多能性關鍵基因導入體細 胞，使其重編程為具有多能性的干細胞，不但解決了干細胞建系技術難題，豐富了體細胞重 編程與干細胞建系理論，而且為其他動物干細胞建系提供了理論依據和實驗基礎。
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發(fā)明內容
針對家畜干細胞建系中存在的上述現有技術難題與不足，本發(fā)明的目的在于提供 一種獲得誘導性多能干細胞(iPSCs)的方法，用該方法獲得細胞在細胞集落形態(tài)、生長特 性、干細胞表面標記、表達干性基因、主要干性基因啟動子序列區(qū)域甲基化模式、類胚體形 成與體外分化能力、畸胎瘤形成能力，以及參與嵌合體形成等八個方面都與胚胎干細胞特 性非常相似。 實現上述發(fā)明目的技術方案是一種利用轉錄因子轉染牛體細胞成為誘導性多能 干細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟
1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng) 以成年牛皮膚成纖維細胞(BDFs)和新生牛皮膚成纖維細胞(NDFs)經常規(guī)培養(yǎng)分
別獲得大量的成年牛皮膚成纖維細胞和新生牛皮膚成纖維細胞； 2)牛維持多能性轉錄因子基因的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建 從50-60日齡牛胎兒中分離生殖嵴，提取總RNA，經過逆轉錄反應得到cDNA ;以
cDNA為模板，經過PCR反應得到牛0ct4、Sox2、Nanog和Lin28四個基因擴增產物并經測序
驗證序列正確而后將目的基因插入到逆轉錄病毒載體pMSCVneo中，構建這4種基因的逆轉
錄病毒表達載體； 3)逆轉錄病毒的包裝與準備 將PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在含有15X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中， 應用脂質體將構建的逆轉錄病毒載體轉染進入包裝細胞PT67細胞；在應用脂質體包裝病毒顆粒前1小時，包裝細胞PT67的培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，將4-8iig 包含有轉錄因子基因的逆轉錄病毒質粒DNA和10-20 iil脂質體分別加入到500 ill Opti-MEM-I+GlutaMAX-I轉染優(yōu)化液進行稀釋，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘，然后將含有 脂質體lipofectamine2000的稀釋液緩慢滴入含有逆轉錄病毒質粒的稀釋液中，輕輕混 勻，室溫下再孵育20分鐘后，將上述混合液逐滴加入PT67包裝胞培養(yǎng)皿中；轉染24小時 后，每天更換含有病毒顆粒的的培養(yǎng)液一次，連續(xù)3天，收集病毒懸浮液，在4t:條件下經 25000轉/分，離心90分鐘后，10倍濃縮病毒上清液；將包含有0ct4， Sox2， Nanog和Lin28 基因病毒上清液進行等量混合，并加入8 ii g/mlPolybrene組成特定的基因組合，-S(TC保 存?zhèn)溆茫?4)逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得
將成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生公牛皮膚成纖維細胞NDFs按照常規(guī)方法培 養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80%融合時將包含0ct4、 Sox2、Nanog 和Lin28基因轉錄因子的逆轉錄病毒上清液分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中 感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按1 : 3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10天將細 胞以1 X 105細胞/孔的密度，轉移至預先鋪有人羊膜(HAM)6孔培養(yǎng)板上，用人羊膜代替MEF 作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內每天半量換 液，連續(xù)觀察20-28天，直到有細胞集落出現為止，記為0代，即為牛iPSCs。
所述的干細胞培養(yǎng)液的組成為每100ml溶液中含有82. 69ml的knockout-DMEM、 15ml FBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為10mM非必需氨基酸、200 yl濃度為55mM 13 -巰基乙醇、10 ii 1濃度為400ng/ml人重組堿性成纖維生長因子(bFGF) 、100 y 1濃度為 105U/ml白血病抑制因子(LIF)。 牛iPSCs傳代時，應用0. 05% trypsin+0. 02% EDTA消化液消化，經過中和、離心 與重懸再傳代至新的HAM支持物上，在37-381:，5%左右C02，飽和濕度條件下擴增培養(yǎng)，得 到牛iPS細胞株。牛iPSCs每隔3-5天傳代一次。液氮凍存，解凍后生長活力較好，約有 85% -90%存活率。 本發(fā)明還有一個目的是提供Nanog基因的重組逆轉錄病毒表達載體pMSCV-Nanog 及在基因工程中的應用。 本發(fā)明還有一個目的是提供Lin28基因的重組逆轉錄病毒表達載體pMSCV_Lin28 及在基因工程中的應用。 本發(fā)明利用誘導性多能干細胞和其制備方法的與現有技術相比，具有以下優(yōu)點 1、本發(fā)明中應用自主克隆牛的4種維持干細胞多能性關鍵基因，利用多種基因組
合方式，以干細胞逆轉錄病毒介導導如牛皮膚成纖維細胞，使其重編程為完全具有胚胎干
細胞生物特性的多能性干細胞。通過該方法所建立的多株多能型干細胞在體外已經傳代超
過25代，生長特性均表現正常。凍存與解凍試驗表明，它們仍具有良好的多能性。 2、本發(fā)明在培養(yǎng)條件中首次采用脫細胞人羊膜(HAM)作為支持物代替小鼠胚胎
成纖維細胞(MEF)來維持牛iPSCs體外增殖并長期保持未分化的多能性狀態(tài)，而且避免了
應用鼠胚胎成纖維細胞作為干細胞的飼養(yǎng)層所帶來的異種動物細胞污染問題。 3、本發(fā)明采用基因誘導產生多能性干細胞的方法，解決了家畜特別是牛多能性干
細胞難以獲得的技術難題，為其他動物干細胞建系提供了理論依據和實驗基礎。
圖1成年母牛皮膚成纖維細胞(BDFs)50X顯微鏡圖。圖2新生公牛皮膚成纖維細胞(NDFs)50X顯微鏡圖。圖3PT67包裝細胞50X顯微鏡圖。圖4電鏡下逆轉錄病毒顆粒10萬倍電鏡圖。圖5集落堿性磷酸酶染色100 X顯微鏡圖。圖6集落堿性磷酸酶染色200X顯微鏡圖。圖7TRA-1-60明視野顯微鏡圖。圖8TRA-1-60染色(+++)顯微鏡圖。圖9Nanog明視野顯微鏡圖。圖10Nanog染色(+++)顯微鏡圖。圖11囊腔樣類胚體結構顯微鏡圖。圖12代表外胚層細胞系的13 III-Tubulin染色陽顯微鏡圖。圖13代表中胚層細胞系的a -actin染色陽性顯微鏡圖。圖14代表內胚層細胞系的甲胎蛋白(a-fetoprotein)染色陽性顯微鏡圖。圖15腺體樣結構(內胚層)400X顯微鏡圖。圖16骨骼肌結構(中胚層)400X顯微鏡圖。圖17原始神經元結構(外胚層)400X顯微鏡圖。圖18EB的RT-PCR檢測結果凝膠電泳圖。圖19嵌合體山羊的各組織的PCR檢測結果凝膠電泳圖。
具體實施例方式
以下通過申請人給出的獲得牛iPSCs的具體方法以及經過多種試驗證明牛iPSCs
在集落形態(tài)、生長特性、干細胞表面標志、體內外分化能力與嵌合體形成等諸多方面都具有
與胚胎干細胞相似的生物學特性。 實施例1牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng) 成年牛皮膚成纖維細胞(female bovine dermal fibroblasts, BDFs)分離自雌 性Holstein奶牛耳緣皮膚。將組織清洗消毒后剪成細小組織塊，在常規(guī)培養(yǎng)條件下，用含 15% -20%胎牛血清(FBS) (Gibco公司產品)的高糖DMEM(Gibco公司產品)中培養(yǎng)。每 2-3天換養(yǎng)液1次，7-10天后就有成纖維細胞從組織塊邊緣移出，12-16天后大量成纖維細 胞緊密排布于組織塊周圍。用胰蛋白酶與EDTA混合消化液消化傳代，即獲得大量的成年牛 皮膚細胞，見圖1。新生公牛皮膚成纖維細胞(male newborn bovine dermal fibroblasts, NDFs)來自Holstein品種新生公牛耳緣皮膚，見圖2，分離和培養(yǎng)方法與上述母牛皮膚成纖 維細胞方法相同。為了保證細胞活力，本發(fā)明采用2 6代以內的細胞作為誘導前靶細胞。
實施例2牛維持多能性關鍵基因轉錄因子的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建
從50-60日齡荷斯坦(Holstein)品種奶牛的胎兒體內分離生殖嵴，組織勻漿后用 TRIzol LS Reagent提取總RNA，經過DNaseI(RNase free)處理以除去基因組DNA污染。經 反轉錄反應得到cDNA。然后以cDNA為模板，分別經PCR擴增0ct4、 Sox2、 Nanog和Lin28四種轉錄因子基因開放性閱讀框(0RF)全序列，基因克隆所用引物序列見表l所示。
表1擴增牛0ct4， Sox2， Nanog，和Lin28四個基因RT-PCR擴增引物信息
基因引物序列退火溫 度(。c)PCR產物 長度(bp)GenBank中參考基 因序列號
NanogF: 5'- GTTAACATGAGTGTGGGCCCAGCTT- 3' R: 5、GAAGATCTTTACAAATCTTCAGGCTGTATG-3'58903畫—001025344Oct4F: 5'- GGAATTCATGGCGGGACACCTCG- 3' R: 5，醫(yī)GAAGATCTTCAGTTTGCATGCATAGGGG- '3601083NM—174580
Sox2F: 5'- CCGGAATTCATGTACAACATGATGGAG- 3' R: 5'-GAAGATCTTCACATGTGCGAGAGGG-3'54963NM—001105463
Lin28F: 5'- GGAATTCATGGGCTCTGTGTCAAAC- 3' R: 5' -AAGATCTTCAATTCTGGGCCTCTGG -3'56618XM一866673 其中0ct4基因PCR擴增參數是94。C預變性5min，94。C變性45sec，60。C退火 45sec，72t:延伸lmin，循環(huán)35次，72"C再延伸10min，預期PCR產物長度應為1083bp。
Sox2基因的擴增參數是94。C預變性5min，94。C變性45sec，54。C退火30sec，72。C 延伸lmin，循環(huán)35次，72t:再延伸10min，預期PCR產物長度應為963bp。
Nanog基因擴增參數為94°C預變性4min， 94"C變35s， 58"C退火lmin，72t:延伸 lmin，共35個循環(huán)，72t:再延伸10min，預期PCR產物長度應為903bp。
Lin28基因擴增參數為94。C預變性4min， 94。C變性30s， 56。C退火45s， 72。C延伸 lmin，共30個循環(huán)，72t:再延伸10min，預期PCR產物長度應為618bp。
取上述PCR產物各5 iil ，在1 %瓊脂糖凝膠電泳以鑒定其大小，剩余PCR產 物-2(TC保存。電泳檢測結果顯示，PCR擴增產物長度與預期奶牛4種轉錄因子基因大 小完全一致，符合試驗設計要求。然后將4種PCR產物剩余部分分別經過DNA片段Gel Extraction kit純化、回收；回收產物與克隆載體pMD18-T以solution I混合連接，16°C 連接過夜。將連接產物轉化入感受態(tài)細胞TG I內進行克隆。經含Ampicillin(80iig/ml)、 X-gal與IPTG的LB平板上37。C篩選培養(yǎng)14-16小時。從4種培養(yǎng)物中分別挑取6_10個白 色菌落接種含氨芐青霉素(Ampicillin)的LB培養(yǎng)液中小量搖菌，并按照質粒抽提試劑盒 說明書步驟抽提微量質粒。包含0ct4， Sox2， Nanog， Lin28等4種基因的質粒經過雙酶切、 單酶切和質粒PCR鑒定。其中3種質粒經過BglII+EcoRI雙酶切和EcoRI單酶切以及質粒 PCR鑒定，以獲得pMD-18T-0ct4， pMD-18T-Sox2， pMD-18T-Lin28三種質粒的陽性克隆。由 于引物中引入的內切酶種類不同，包含Nanog基因的質粒經過H即I+Bgl11雙酶切和Bgl11 單酶切以及質粒PCR鑒定，以獲得pMD-18T-Nanog質粒陽性克隆。選送鑒定結果為陽性的 質粒到生物公司測序。測序結果應用DNAstart 7. 10軟件與GenBank中參考序列進行同源 性比較分析。分析結果表明，0ct4， Sox2， Nanog和Lin28基因序列與參考序列同源性分別 為99. 4%，99. 6%， 100%和100%。
將上述測序正確的pMD-18T-0ct4， pMD-18T-Sox2， pMD-18T-Lin28三種質粒回收 純化后與逆轉錄病毒pMSCVneo載體分別經過Bgl II+EcoRI雙酶切，質粒pMD-18T_Nanog 與逆轉錄病毒經過BglII+H即I雙酶切，純化與回收酶切后的目的基因片段和線性化 pMSCVneo載體。將線性化后反轉錄病毒載體pMSCVneo與回收的目的片段用DNALigation Kit Version 2. 0在16。C連接過夜，14-16小時后，連接產物轉化入JM109感受態(tài)細胞，經 過氨芐青霉素(Ampicillin，50iig/mL)LB平板上篩選出逆轉錄病毒質粒的陽性克隆。從4 個培養(yǎng)物板中，每一種重組質粒分別挑取6-10個菌落小量搖菌，微量方法提取重組的逆轉 錄病毒質粒。經過BglII+EcoRI(或者BglII+H即I)雙酶消化鑒定、質粒PCR擴增鑒定及 測序分析鑒定。四種重組逆轉錄病毒質粒經過雙酶切后，都可以獲得已知大小的目的基因 片段與逆轉錄病毒載體片段，說明我們所構建的重組逆轉錄病毒表達載體結構正確。通過 測序檢測，所有重組逆轉錄病毒質粒中所包含的4個目的基因的序列與PCR擴增序列完全 一致，也與GenBank中參考序列完全一致，表明在本專利中所構建得4種重組逆轉錄病毒 質粒過程中目的基因沒有發(fā)生閱讀框的移碼和堿基突變等情況，說明所應用的4種基因序 列完全正確。本專利中所構建的4種重組逆轉錄病毒表達載體分別命名為pMSCV-0ct4， pMSCV-Sox2， pMSCV-Nanog和pMSCV-Lin28。
實施例3逆轉錄病毒的包裝與準備 PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，待細胞達到70 % -80 % 匯合時，應用脂質體將4種逆轉錄病毒載體分別轉染進入包裝細胞PT67細胞，進行 病毒包裝以獲得具有感染性逆轉錄病毒顆粒。轉染前1小時，匿EM培養(yǎng)基換成無血 清培養(yǎng)液，4-8 ii g逆轉錄病毒質粒DNA和10-20 yl脂質體分別加入到2份500 y 1 Opti-MEM-I+GlutaMAX-I (Gibco公司產品)優(yōu)化轉染液中，輕柔混勻，室溫孵育，然后將稀 釋的質粒DNA和脂質體輕柔混勻，再室溫孵育。20分鐘后，將混合液逐滴加入PT67細胞培 養(yǎng)皿中。細胞在37t:，5XC02和飽和濕度條件下培養(yǎng)4-6h。之后，轉染液換成新的含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液。經過24小時轉染后，收集PT67細胞培養(yǎng)液上清，該上清中就包含感染 性逆轉錄病毒顆粒。上清液經過0.45ym孔徑的濾膜過濾。每24小時收集一次，連續(xù)收集 3天。病毒懸浮液在4t:下，經過25， 000轉/分，離心90分鐘，10倍濃縮病毒上清液，_80°C 保存。將0ct4、 Sox2、 Nanog和Lin28四種基因病毒上清液進行等量混合，并添加8 y g/ml polybrene，準備轉染牛皮膚成纖維細胞。 實施例4逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得及傳代
將成年牛皮膚成纖維細胞(BDFs)和新生公牛皮膚成纖維細胞(NDFs)按照常規(guī)方 法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80 %融合時將包含0ct4、 Sox2、 Nanog和Lin28基因轉錄因子的逆轉錄病毒上清液的混合液分別加入到成纖維細胞BDFs與 NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按l : 3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在 第6-10天將細胞以1 X 105細胞/孔的密度，轉移至預先鋪有人羊膜6孔培養(yǎng)板上，用HAM 代替MEF作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內每 天半量換液，連續(xù)觀察20-28天，直到有ES細胞樣集落出現為止，記為0代，即為牛iPSCs。
牛iPSCs傳代時，應用0. 05% trypsin+0. 02% EDTA消化液消化，經過中和、離心 與重懸再傳代至新的HAM支持物上，在37-381:，5%左右C02，飽和濕度條件下擴增培養(yǎng)，得 到牛iPS細胞。牛iPSCs每隔3-5天傳代一次。液氮凍存，解凍后生長活力較好，大約有
985% _90%存活率。 試驗例1建立的牛iPSCs系的鑒定 為了鑒定本發(fā)明中所建立的牛iPSCs與傳統(tǒng)意義上胚胎干細胞具有非常類似的
生物學特性，發(fā)明人在多個不同方面設計鑒定本發(fā)明所建立的牛的iPS細胞， 1.作為靶細胞的牛皮膚成纖維細胞形態(tài)，見圖1-2。 2. PT67包裝細胞與包裝后的逆轉錄病毒顆粒形態(tài)，見圖3_4。 3. iPSCs集落形態(tài)與AP染色陽性(紅色)鑒定，見圖5-6。 4. iPSCs集落的免疫熒光細胞化學染色鑒定，見圖7-10。 5.類胚體的形成于體外分化鑒定 利用牛iPSCs體外懸浮培養(yǎng)7天后就可以形成多個球形和囊腔樣類胚體 (Embryoid Body，EB)結構，見圖ll，其中A顯示為球形的類胚體結構，B顯示的是囊腔樣類 胚體結構。 利用牛iPSCs形成的類胚體(EB)，再經過貼壁培養(yǎng)14-21天，并通過添加誘導培 養(yǎng)基的方法使其定向分化，形成代表3個胚層的不同細胞形態(tài)。3個胚層代表細胞系，見圖 12-14所示。 6.畸胎瘤形成與三個胚層細胞的分化 將牛iPSCs注射到裸鼠臀部皮下，經過6-9周時間發(fā)育，則會在裸鼠注射部位皮下 形成腫瘤，即為畸胎瘤。將畸胎瘤采集、固定后制備成組織切片，染色后顯微鏡觀察，可以 觀察到3個胚層細胞形態(tài)同時存在畸胎瘤中切片，說明牛iPSCs具有發(fā)育的全能性。經過 H. E.染色后的畸胎瘤組織制備切片顯微鏡下可以觀察到清晰地三個胚層細胞同時存在。觀 察結果如下圖15-17所示(箭頭)。另外，對畸胎瘤組織提取總RNA，應用三個胚層細胞代 表基因引物進行RT-PCR擴增檢測，結果也顯示了三個胚層細胞的存在，同樣說明所建立的 牛iPSCs具有發(fā)育全能性。類胚體三個胚層細胞代表基因的RT-PCR檢測結果見圖18，圖中 泳道1 : P -Actin為內參；泳道2 :Nestin，泳道3 : P -tubulin (外胚層);泳道4 :GATA4，泳 道5:Actin alpha 2(中胚層)；泳道6 :Keratin-14，泳道7 :PDX-1，泳道8 :AFP (內胚層)， 所用引物見表2。 表2.檢測分化細胞代表基因PCR所用引物
胚層 基因 引物 PCR退火溫 PCR產物大小
10度(°C) (bp)
Loading controlp-actin5'-CAAGGACCTCTACGCCAACA-3' 5'-CTCGATCCAACCGACTGCT-3'54445
Keratin-145'"CCAGTCACGGATTTTCACCTC-3' 5'-AGCCGCATATCCTCCGTCCT-3'58396
EndodermPDX-15'-TGAATGCCAAGGGAGAAG—3' 5'"CACCATTGACTTCCACCC-3'54707
AFP5'"CCTTCCGAGCCATAACTG-3' 5'-CATCGGAGAATGGTGGAG-3'54
MesodermACTA25'-GCCCAGCCGAGAACTTTCAG-3' 5'-AGCCAGGTCCAGACGCATGA-3'58597
GATA45'"GGACGGGACGGGACACTAC-3' 5'—AGCAGAGAGGACCGGGTGG-3'58517
Ectoderm卩III-tubulin5'—AGGCGCTCTACGACATCTGC—3' 5'-CCCTCGCCCGTGTACCAGT-3'58529
Nestin5'—AGAGGAGAACGCTGAGTCATT—3' 5,-TCTGTAGGCTTTAGTGGTTCTG-3,54537 試驗例2利用牛iPSCs建立與"牛_山羊"嵌合體 應用妊娠58天薩能奶山羊做受體羊，采用剖腹手術經子宮壁觸摸胎兒，將一株牛 iPSCs(大約l. 1X106個細胞)注射到胎兒腹腔中。山羊妊娠足月后，共產生4只羔羊，其 中1只雄性羔羊全身皮毛發(fā)現大面積嵌合，從體表特征判定為牛_羊嵌合體，遺憾的是該羔 羊出生后2小時因為心肺功能衰竭而死亡。尸體經過剖檢后未發(fā)現器官異?，F象。山羊胎 兒腹腔注射牛iPS細胞制作嵌合體山羊，所生嵌合體羔羊皮毛有多處黑色花紋，這些花紋 與Holstein奶牛非常相似。該嵌合羔羊在體表多個部位有成片、成條的黑色皮毛，其中包 括胸部、背部、嘴唇、鼻端、眼臉、耳廓、四蹄、眼球、尾尖，陰囊等部位。應用牛的線粒體DNA 的D-L00P高變區(qū)序列設計引物對嵌合體山羊進行線粒體DNA檢測，有牛iPS細胞嵌合的組 織包括心、肝、脾、肺、腎、血液、血管、睪丸等多個組織，胰腺、小腸和骨沒有檢測到嵌合，證 實該羊羔是牛羊細胞嵌合體山羊。同時注射牛成體皮膚細胞(BDFs)與(NDFs)的對照羊沒 有出現牛細胞的嵌合現象。 電泳圖19中，1-30泳道代表嵌合體山羊的各組織器官1心，2血管，3心外膜， 4淋巴結，5血液，6肝，7胰腺(-)，8脾，9食管，10胃，ll小腸(-)，12大腸，13BDF細胞， 固F-iPS0細胞，15受體胎兒母親(_) ， 16腦，17脊髓，18角膜，19肺，20氣管，21腎，22睪 丸，23黑皮膚，24白皮膚，25骨骼肌，26軟骨(-)，27平滑肌，28BDF細胞，29BDF-iPS0細胞， 30受體胎兒母親(-)。
〈110〉西北農林科技大學 〈120〉利用轉錄因子轉染牛體細胞成為誘導性多能干細胞的方法
〈160>4
〈210>1
110090] 〈211>1083bp0091] 〈212>DNA0092] 〈213>0CT40093] 〈400〉10094]0095]0096]0097]0098]0099]0100]0101]0102]0103]0104]0105]0106]0107]0108]0109]0110]
0112] TGA0113] 〈210>2
0114]0115]0116]0117]0118]0119]0120]0121]0122]0123]0124]0125]0126]0127]0128]
〈211>963bp〈212>DNA〈213>Sox2〈400>2
12
TGA
〈210>3
〈211>903bp
〈212>DNA
〈213>NAN0G
〈400>3
TAA
〈210>4
〈211>618bp
〈212>DNA
〈213>LIN28
〈400>4
13
CCAGAGGCCCAGAATTGA 618
權利要求
一種利用轉錄因子轉染牛體細胞成為誘導性多能干細胞的方法，包括如下步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)以成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生牛皮膚成纖維細胞NDFs，經常規(guī)培后養(yǎng)分別獲得大量的成年牛皮膚細胞和新生牛皮膚成纖維細胞；2)牛維持多能性轉錄因子基因的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建從50-60日齡牛胎兒中分離生殖嵴，提取總RNA，經過逆轉錄反應得到cDNA；以cDNA為模板，經過PCR反應得到牛Oct4、Sox2、Nanog和Lin28四個基因擴增產物并經測序驗證序列正確而后將目的基因插入到逆轉錄病毒載體pMSCVneo中，構建這4種基因的逆轉錄病毒表達載體；3)逆轉錄病毒的包裝與準備將PT67包裝細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)在含有15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，應用脂質體將構建的逆轉錄病毒載體轉染進入包裝細胞PT67細胞；將8μg含有Oct4、Sox2、Nanog與Lin28不同基因的逆轉錄病毒表達載體質粒和4份20μl轉染試劑脂質體lipofectamine2000分別用500μlOpti-MEM-I+GlutaMAX-I轉染優(yōu)化液進行稀釋，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘，然后將含有脂質體lipofectamine2000的稀釋液緩慢滴入含有逆轉錄病毒質粒的稀釋液中，輕輕混勻，室溫下再孵育20分鐘后，將上述混合液逐滴加入PT67包裝胞培養(yǎng)皿中，4-6小時后換成常規(guī)細胞培養(yǎng)液；轉染24小時后，每天更換含有病毒顆粒的培養(yǎng)液一次，連續(xù)3天，收集病毒懸浮液，在4℃條件下經25000轉/分離心90分鐘后，10倍濃縮病毒上清液；將包含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因病毒上清液進行等量混合，并加入8μg/m1Polybrene組成特定的四因子基因組合，-80℃保存?zhèn)溆茫?)逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的iPS細胞的獲得將成年牛皮膚成纖維細胞BDFs和新生公牛皮膚成纖維細胞NDFs按照常規(guī)方法培養(yǎng)在60mm塑料培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞生長到70-80％融合時將包含Oct4、Sox2、Nanog和Lin28基因轉錄因子的逆轉錄病毒上清液的混合液分別加入到成纖維細胞BDFs與NDFs培養(yǎng)皿中感染成纖維細胞；細胞長滿培養(yǎng)皿后按1∶3常規(guī)傳代，視細胞生長情況在第6-10天將細胞以1×105細胞/孔的密度，轉移至預先鋪有人羊膜(HAM)6孔培養(yǎng)板上，用人羊膜代替小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)感染后的牛細胞，同時培養(yǎng)液更換成干細胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)孔內每天半量換液，連續(xù)觀察20-28天，直到有細胞集落出現為止，記為0代，即為牛iPSCs。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于在應用脂質體包裝病毒顆粒前1小時，將 包裝細胞PT67的培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)液，4_8 y g包含有轉錄因子基因的逆 轉錄病毒質粒DNA和10-20 ii 1脂質體分別加入到500 y 1 Opti-MEM-I+GlutaMAX-I優(yōu)化轉 染液中，輕柔混勻，室溫孵育，然后將稀釋的質粒DNA和脂質體輕柔混勻，再室溫孵育，20分 鐘后，將質粒_脂質體混合液逐滴加入PT67細胞培養(yǎng)皿中。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的干細胞培養(yǎng)液的組成為每100ml 溶液中含有82. 69ml的knockout-DMEM、15ml FBS、lml濃度為200mM谷氨酰胺、lml濃度為 10mM非必需氨基酸、200 ii 1濃度為55mM P -巰基乙醇UO y 1濃度為400ng/ml人重組堿性 成纖維生長因子、100iU濃度為105U/ml白血病抑制因子。
4. 權利要求1所述Nanog基因的重組逆轉錄病毒表達載體pMSCV-Nanog。
5. 權利要求4所述重組逆轉錄病毒表達載體pMSCV-Nanog在基因基因工程中的應用。
6. 權利要求1所述Lin28基因的重組逆轉錄病毒表達載體pMSCV-Lin28。
7. 權利要求6所述重組逆轉錄病毒表達載體pMSCV-Lin28在基因基因工程中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用轉錄因子轉染牛體細胞產生誘導多能干細胞(iPSCs)的方法，具體包括下列步驟1)牛皮膚成纖維細胞的分離與培養(yǎng)；2)牛維持多能性轉錄因子基因的克隆及其逆轉錄病毒載體的構建；3)逆轉錄病毒的包裝與準備；4)逆轉錄病毒感染牛皮膚成纖維細胞以及牛的誘導性多能干細胞的獲得。本發(fā)明首次采用脫細胞后人羊膜作為支持物代替小鼠胚胎成纖維細胞來維持牛iPSCs體外增殖并長期保持未分化的多能性狀態(tài)。這種采用基因誘導產生多能性干細胞的方法，不但解決了動物特別是如牛、羊、豬等家畜多能性干細胞難以獲得的技術難題，而且避免了應用鼠胚胎成纖維細胞作為干細胞的飼養(yǎng)層所帶來的異種動物細胞污染問題。
文檔編號C12N15/867GK101705247SQ200910218980
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月16日 優(yōu)先權日2009年11月16日
發(fā)明者呂長榮, 竇忠英, 辛曉玲, 陳冬梅 申請人:西北農林科技大學