專利名稱：：一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶及其制備方法以及其在制備止血或預(yù)防出血藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蛇毒類凝血酶(TLE)是從蛇毒中的一類具有類凝血酶活性的蛋白酶，能特異性地水解纖維蛋白原形成纖維蛋白單體而促使血液凝固。KornalicF等將以纖維蛋白原為底物的蛇毒酶按其作用機(jī)理分成三類1類是類凝血酶(Thrombin-likeenzyme,TLE)或凝血蛋白酶(Thrombicprotease)，它僅分解纖維蛋白原的α鏈和/或β鏈的N端肽鏈，釋放A肽(α鏈)和/或B肽(β鏈)，使血液凝固。II類是纖維蛋白原裂解酶(Fibrinogenolyticenzyme)，它直接從纖維蛋白原三條肽鏈(α，β和γ)的C端水解，將纖原分解成碎片，血液不被凝固。III類是纖溶酶原激活酶(Enzymeactivatingplasminogen)，它是纖維蛋白溶解的間接激活劑，它通過激活纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶，來裂解纖維蛋白或纖維蛋白原。國內(nèi)外已經(jīng)批準(zhǔn)用于止血的類凝血酶藥物主要是立芷雪。由瑞士巴塞素高大藥廠研制的商品名為立芷雪Oteptilase)的止血藥物是從巴西蛇毒Bathropsatrox中提取的類凝血酶。由于立芷雪療效確切，副作用小，臨床適應(yīng)癥廣，優(yōu)于其它止血藥等特點(diǎn)，于1996年進(jìn)入中國國家基本藥物目錄，所以我國每年需從瑞士進(jìn)口大量立芷雪用于臨床。自從立芷雪Oteptilase)進(jìn)入中國以來，國內(nèi)許多研究者都嘗試過尋找類似的止血成分。2001年，由沈陽賽諾科技發(fā)展有限公司、長(zhǎng)春市斯達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司和北京賽生科技發(fā)展有限公司聯(lián)合，在國內(nèi)成功地使用進(jìn)口巴西Bathropsatrox蛇毒生產(chǎn)立芷雪產(chǎn)品，市場(chǎng)名巴曲停，英文名Hemocoagulase。2005年遼寧錦州醫(yī)學(xué)院牟萍等自長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(Agkistrodonblomhoffiiussurensis)蛇毒中提取35.5KDa的具有止血活性的類凝血酶，該類凝血酶N端15個(gè)氨基酸殘基與立芷雪相同，該類凝血酶仿制立芷雪，被發(fā)展成商品名為邦停上市。尖吻蝮蛇(Deinagkistrodonacutus)又稱五步蛇或蘄蛇，分布在華南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性較低，無神經(jīng)毒和激肽釋放酶活性。在其組份中，以纖維蛋白原為底物的酶分布十分豐富，這些酶在體外能使人血漿和牛纖原凝結(jié)，但在體內(nèi)卻引起各種不同的生理效應(yīng)如降纖抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的研究，最早是1967年的ChengHC和OuyangC等，他們于1971年和1972年相繼分離出兩個(gè)類凝血酶組份，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，它們均有不同程度抗凝作用，其中的Acutin分子量41KDa，后被發(fā)展成降纖酶。肖昌華等從1988年起和管錦華等從1992年起，也多次嘗試從尖吻蝮蛇蛇毒中分離使動(dòng)物凝血時(shí)間縮短的組份。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有止血活性或者預(yù)防出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的方法。本發(fā)明經(jīng)過以下步驟從尖吻蝮蛇蛇毒中制備尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶a)尖吻蝮蛇蛇毒用磷酸鹽緩沖液溶解，離心，上清液上S印hadexG_75凝膠柱，磷酸鹽緩沖液洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰；b)將a)步驟收集的含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰上第一次DEAE-SepharoseFastFlow柱，用含有0_0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰；C)將b)步驟收集的含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰用磷酸鹽緩沖液透析，透析樣上第二次DEAE-S^haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰；d)將C)步驟收集的含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰用磷酸鹽緩沖液透析，透析樣上第三次DEAE-S印haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰，收集的有效峰經(jīng)脫鹽，凍干后即為該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶純品。上述制備方法的優(yōu)選條件為a)步驟中所述的尖吻蝮蛇蛇毒是用0.01M,pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液溶解，離心條件為6000rpm和20min，SephadexG-75凝膠柱是用0.01M,PH值為6.8的磷酸鹽緩沖液洗脫；b)步驟中含有0-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液，緩沖液濃度為0.01M、pH值為6.8；c)步驟中的所述用磷酸鹽緩沖液透析是用0.01M，pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液，緩沖液濃度為0.01M、pH值為6.8；d)步驟中的所述用磷酸鹽緩沖液透析是用0.01M,pH值為7.8的磷酸鹽緩沖液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液，緩沖液濃度為0.01M、pH值為7.8，所述的脫鹽是用S印hadexG-25凝膠柱脫鹽。制備出的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶經(jīng)N端氨基酸殘基測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其N端44個(gè)氨基酸殘基為VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC(具體如SEQIDNO.1所示)；SDS-PAGE(TC=123.9)法測(cè)定的分子量為37KDa；用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得其精確分子量為31084Da；等點(diǎn)電4.28；最適溫度37°C；最適pH6.6；血漿凝結(jié)比活約為560單位/毫克。與現(xiàn)有的幾種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶與現(xiàn)有的幾種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶分子大小和結(jié)構(gòu)都不同。BLAST比較發(fā)現(xiàn)，與其同源性最高的為Dav-X蛋白酶，同源性為35/44(80%)。由此可見，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶是一種新的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶。動(dòng)物藥效試驗(yàn)表明，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶能夠顯著縮短新西蘭大耳兔的全血凝固時(shí)間，使血纖維蛋白原含量減少，對(duì)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、血小板數(shù)量和釋放活性、優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)都沒有明顯影響。由此表明，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)具有止血功能，不影響血液中凝血因子II、VIII和血小板，無血栓形成危險(xiǎn)。毒理學(xué)研究表明，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的毒性極低。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶在制備止血或預(yù)防出血藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種止血或預(yù)防出血的藥物，該藥物含有本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶作為活性成份。該藥物可以含有一種或者多種藥學(xué)上可以接受的輔料。本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)作為一種新的蛋白類止血藥，其作用方式與立芷雪Oteptilase)相似，能使人血漿和牛纖維蛋白原在體外凝固，不激活凝血因子VIII和II，產(chǎn)生可溶性非交聯(lián)纖維蛋白單體。在傷口處，該單體與其它凝血因子相互作用加速止血效應(yīng)，在完整血管內(nèi)，該單體有幾分鐘半衰期，可迅速被纖溶酶降解清除。該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)在體外使檸檬酸化血漿凝固，在體內(nèi)可使出凝血時(shí)間顯著縮短，同時(shí)又不造成血栓形成，達(dá)到傷口部位的止血或預(yù)防出血之目的，并且其毒性非常低，因此可以作為一種安全有效的止血藥物，適于臨床上各種類型的出血性疾病的預(yù)防和治療。圖1是尖吻蝮蛇蛇毒的S印hadexG_75凝膠洗脫峰圖。圖2是對(duì)SephadexG-75凝膠洗脫峰的有效峰上第一次DEAE-S印haroseFastFlow離子交換柱的洗脫峰圖。圖3是經(jīng)第一次透析后，樣品上第二次DEAE-S印haroseFastFlow離子交換柱洗脫峰圖。圖4是經(jīng)第二次透析后，樣品上第三次DEAE-S印haroseFastFlow離子交換柱洗脫峰圖。圖5是尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的SDS-PAGE分析圖，泳道1、2、3、4分別代表尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)上樣量60μg、40μg、30μg、10μg，泳道5為Acutin，泳道6為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(14.497.4KDa)。圖6是尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)凝膠正相HPLC圖。圖7是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(BiflexIII型MALDL-T0F質(zhì)譜儀，BrukerDaltonicsCo)測(cè)尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)精確分子量的圖譜。圖8是尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的等電聚焦電泳圖，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)等電點(diǎn)蛋白；泳道2為尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)；泳道3為牛血清白蛋白(BSA)。圖9是該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的溫度_活性曲線圖。圖10是該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的pH-活性曲線圖。圖11:A是尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)裂解牛纖維蛋白原的SDS-PAGE圖，其中1為未加尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的牛纖維蛋白原對(duì)照，2、3、4、5分別為尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)與牛纖維蛋白原混合后，保溫lh、2h、3h、4h后的樣品；B是豬凝血酶裂解牛纖維蛋白原的SDS-PAGE圖，其中1為未加豬凝血酶的牛纖維蛋白原對(duì)照，2、3、4、5分別為豬凝血酶與牛纖維蛋白原混合后，保溫lh、2h、3h、4h后的樣品。具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的制備10gX2尖吻蝮蛇蛇毒干粉(購自廣州市新源蛇毒經(jīng)銷部)溶解于200ml0.OlM磷酸鹽緩沖液中(pH6.8)，6000rpm離心20min。上清液上S印hadexG-75凝膠柱(7XIOOcm層析柱)，實(shí)驗(yàn)條件洗脫用0.OlM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)，流速為6ml/min，收集蛋白洗脫峰，如圖1所示，有效峰為洗脫峰2(Fraction-2)。收集的有效峰上第一次DEAE-S^haroseFastFlow離子交換柱(3X20cm層析柱)，實(shí)驗(yàn)條件洗脫用含0-0.05MNaCl的0.OlM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)線性梯度洗脫，流速為30ml/min，梯度杯2000mlX2，收集蛋白洗脫峰，如圖2所示，有效峰為洗脫峰3(Fraction-3)。有效峰經(jīng)0.OlM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)透析24h后，透析樣品上第二次DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱，實(shí)驗(yàn)條件洗脫用含0.025-0.05MNaCl的0.OlM磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)線性梯度洗脫，流速為30ml/min，梯度杯2000mlX2，收集蛋白洗脫峰，如圖3所示，有效峰為洗脫峰1(Fraction-I)。有效峰經(jīng)0.OlM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)透析24h后，透析樣上第三次DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱，實(shí)驗(yàn)條件洗脫用含0.025-0.05MNaCl的0.OlM磷酸鹽緩沖液(PH=7.8)線性梯度洗脫，流速為30ml/min，梯度杯2000mlX2，收集蛋白洗脫峰，如圖4所示，有效峰為洗脫峰1(Fraction-Ι)，該洗脫峰即為純化的樣品。將純化的樣品經(jīng)S印hadexG-25柱脫鹽和凍干后，即獲得終純品。終純品的檢測(cè)SDS-PAGE(TC=124.9)檢測(cè)，如圖5所示，樣品的電泳帶為單一條帶。如圖6所示，凝膠正相HPLC(色譜柱BI0SEPSEC-S2000,Phenomenx型號(hào)，7.8X300mm，Pharmacia-LKBCo.；色譜儀島津LC-IOA)，洗脫為0.2M磷酸鹽緩沖液(ρΗ6·8)，lml/min流速和280nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，檢測(cè)為單一峰。表明經(jīng)過上述方法獲得的終純品是只含有單一蛋白的純品，即為尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶純品。1單位的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)是指在37°C保溫條件下，使0.2ml人新鮮血漿在60士5秒凝結(jié)的酶量。按照上述定義，測(cè)得尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的酶活為580U/mg。制備過程總結(jié)如表1所示表1制備工藝的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、生物化學(xué)參數(shù)以及結(jié)構(gòu)特征(本部分的測(cè)定方法都為本領(lǐng)域技術(shù)人員的通用方法，可參考中國藥典以及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)等教科書)以上工藝制備的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)，通過SDS-PAGE法測(cè)其分子量為37kDa，如圖5所示；正向凝膠HPLC成單峰，如圖6所示；用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(BiflexIII型MALDL-T0F質(zhì)譜儀，BrukerDaltonicsCo)，測(cè)得其精確分子量為31084Da，如圖7所示；通過等電聚焦電泳研究，其等點(diǎn)電為4.28，如圖8所示；對(duì)尖吻蝮蛇類蛇毒凝血酶(Agacutase)進(jìn)行溫度-活性實(shí)驗(yàn)，凝結(jié)實(shí)驗(yàn)條件0.2ml人拘櫞酸化血漿+0.2ml尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)溶液(0.2U)，不同溫度保溫測(cè)活，如圖9所示，其最適溫度為37°C；對(duì)尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)進(jìn)行pH_活性實(shí)驗(yàn)，凝結(jié)實(shí)驗(yàn)條件0.2ml人拘櫞酸化血漿+0.2ml不同pH的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)溶液(0.2U)，37°C保溫測(cè)活，如圖10所示，測(cè)得其最適pH為6.6；血漿凝結(jié)比活約為560單位/毫克，實(shí)驗(yàn)條件0.2ml含一定濃度的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)+0.2ml人拘櫞酸化血漿，37°C保溫測(cè)活，計(jì)算出一毫克酶的血漿凝結(jié)活性單位數(shù)；對(duì)該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(A-gacutase)的N端進(jìn)行測(cè)序，其N端44個(gè)氨基酸殘基為VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC(具體如SEQIDNO.1所示)。本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶與現(xiàn)有的幾種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶具有明顯不同的分子大小和結(jié)構(gòu)。BLAST比較顯示，與其同源性最高的為Dav-X蛋白酶，有35/44(80%)的同源性。由此表明，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶是一種新的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶。3、藥效學(xué)試驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)材料用以上工藝制備的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)制成凍干粉劑成品，每支成品含1單位尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)和(質(zhì)量分?jǐn)?shù))右旋糖苷40。新西蘭白兔，2_3kg體重，雌雄兼有，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。立芷雪(R印tilase)，批號(hào)770604，市售，1單位/瓶，瑞士巴塞爾素高大藥廠生產(chǎn)。(2)實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果(a)含有尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)制成凍干粉劑成品與作為陽性對(duì)照的立芷雪Oteptilase)粉劑，分別用滅菌注射用水溶解。然后從新西蘭白兔耳靜脈注射給藥，實(shí)驗(yàn)采用三個(gè)劑量組，即0.03U/kg，0.06U/kg，0.12U/kg，在給藥前和藥后的10min，2h，4h，8h，24h，直接心臟取血，檢測(cè)全血凝固時(shí)間、血纖維蛋白原含量、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、血小板計(jì)數(shù)和釋放活性、優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下列表所示表2尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)對(duì)新西蘭全血凝固時(shí)間的影響G士s，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>^P<0.05，給藥前后的Dunnett氏t檢驗(yàn)表3尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)對(duì)新西蘭白兔血纖維蛋白原含量的影口向(E±s，η=6)靜脈給藥前后血纖維蛋白原含量(g/1)組別(U/kg)給藥前IOmin2h4h8h24hF值A(chǔ)gacutase0.033.89士0.593.24土0.693.53士0.892.55士0.712.78土0.653.65±0.992.56Agacutase0.063.12士0.233.30土0.542,61士0.423.09士0.212.32±0.663.61士0.712.60Agacutase0.123.41±0.512.99士0.763.12±0.692.91士0.222.53士0.612.77士0.322.24Reptilase0.063.18士0.323.23土0.703.01士0.563.31±0.773.14±0.654.U士0.912.23表4尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)對(duì)新西蘭白兔APTT的影響(I士s，n=6)靜脈給藥前后的APTT(秒)組別(U/kg)給藥前IOmin2h4h8h24hF值A(chǔ)gacutase0.0315.8士2.114.9士2.415.9土2.116.5±1.917.1±1.817.8士2.00.87Agacutase0.0615.9士1.714.5±1.5*14.8士1.6*I4.0±0.6*15.7士2.113.1±1,3*8.23Agacutase0.1215.9士2.015.3士2‘114.9士3.113.2士1.515.2±1.615.6士2.22.34ReptiIase0.0617.5士2.〗13,7士1.5*13.7士1.0*14.0士1.3*14.4±1.1*14.5土2.34.89*P<0.05，給藥前后Dunnett氏t檢驗(yàn)表5尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)對(duì)新西蘭白兔PT的影響(I士s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*P<0.05，給藥前后的Dunnett氏t檢驗(yàn)表6尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)對(duì)新西蘭白兔TT的影響6[士s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*P<0.05，給藥前后Dunnett氏t檢驗(yàn)表7尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶對(duì)家兔血小板聚集率的影響(％)G士s，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表8尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶對(duì)新西蘭白兔血小板數(shù)量的影響G士s，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表9尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶靜注對(duì)新西蘭白兔優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的影響G士S，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)能顯著縮短全血凝固時(shí)間(見表2)，能不同程度減少血纖維蛋白原含量(見表3)，對(duì)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)(見表4)幾乎不影響，對(duì)凝血酶原時(shí)間(PT)(見表5)、凝血酶時(shí)間(TT)(見表6)、血小板數(shù)量(見表8)和釋放活性(見表7)、對(duì)優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)(見表9)都沒有明顯影響。由此說明，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)具有止血功能，并且不影響血液中凝血因子II、IV和血小板，無血栓形成危險(xiǎn)。與陽性對(duì)照立芷雪(Iteptilase)比較，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)止血藥效時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)，而立芷雪僅為8小時(shí)，效果明顯好于立芷雪Oteptilase)(b)將尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)溶于50mM的Tris-HCl(pH6.6)中，配置成ΙΟυ/ΙΟΟμ1的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)溶液，然后將100μ1尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)溶液與100μ1的牛纖維蛋白原1μg/μ1，溶解于50mM的Tris-HCl(pH6.6)緩沖液中混合，37°C保溫，分別在1、2、3、4小時(shí)后取樣用SDS-PAGE(ΤC=83.9)鑒定，以豬凝血酶(lU/ΙΟΟμΙ)在相同處理?xiàng)l件下的牛纖維蛋白原作為對(duì)照。如圖11所示，圖IlA是用尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)處理，圖IlB是用豬凝血酶處理，由上述圖結(jié)果可看出，本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)只裂解牛纖維蛋白原的α鏈，對(duì)β和Y鏈沒影響，而豬凝血酶裂解牛纖維蛋白原的α鏈和β鏈。由此可見，尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)是通過分解纖維蛋白原的α鏈形成纖維蛋白肽A而引起止血反應(yīng)的。(C)小鼠剪尾出血時(shí)間的測(cè)定取小白鼠隨機(jī)分成3組，每組6只，一組為尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)實(shí)驗(yàn)組，一組為立芷雪(R印tilase)陽性對(duì)照組，一組為生理鹽水組做對(duì)照，靜脈注射后，在距離鼠尾尖約0.5cm處快速剪斷，立即按表計(jì)時(shí)，用濾紙片隨機(jī)吸取流出的血液，直到出血停止。出血時(shí)間的計(jì)算是從剪尾開始至無出血為止。表10尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)對(duì)小鼠剪尾出血時(shí)間的影響(^士s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*P<0.05，與生理鹽水組相比的t檢驗(yàn)結(jié)果如表10所示，尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)能夠顯著縮短小鼠剪尾出血時(shí)間，與立芷雪(R印tilase)比較，其出血時(shí)間明顯縮短。4、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)(a)最大耐受劑量將尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)溶液靜脈注射小白鼠(17_22g，雌雄兼有)，受試動(dòng)物觀察兩周，有無死亡。試驗(yàn)以立芷雪(R印tilase)作對(duì)照，結(jié)果如下表11小白鼠對(duì)尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)最大耐受劑量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如表11所示，尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的最大耐受劑量為60U/kg，而立芷雪(R印tilase)的最大耐受劑量為35U/kg，表明尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的毒性明顯低于立芷雪(R印tilase)。(b)過敏反應(yīng)將6只豚鼠分別在1、3、5天腹腔注射一定劑量的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)，在第一次注射后的第14天和21天，分別取3只豚鼠，一次性靜脈注射酶溶液，注射劑量翻倍，觀查豚鼠有無過敏反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)以立芷雪(R印tilase)、0.9%NaCl溶液和牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表12過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>如表12所示，當(dāng)尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的致敏劑量到4U/kg時(shí)候才會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，而立芷雪(R印tilase)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過敏劑量是0.25U/kg。由此可見，其尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)的毒性非常低。毒理學(xué)研究表明本發(fā)明的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)是一種非常安全的止血藥物。序列表<110>唐松山<120>一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶及其制備方法和應(yīng)用<160>1<210>1<211>44<212>PRT<213>(Deinagkistrodonacutus)<400>1VallieGlyGlyAsnGluCysAspThrAsn1510AlaAlaPhePheThrSerArgProTrplie2025ThrLeulieHisGluGluTrpValLeuAla3540GluHisArgPheLeu15PheGinCysAlaGly30AlaAlaHisCys4權(quán)利要求一種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶，其特征在于該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶為單肽鏈，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得其精確分子量為31084Da，SDS-PAGE法測(cè)得其分子量為37KDa，其N端44個(gè)氨基酸殘基序列為VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC，等點(diǎn)電為4.28，最適溫度37℃，最適pH6.6，血漿凝結(jié)比活為560單位/毫克。2.權(quán)利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶在制備止血或預(yù)防出血藥物中的應(yīng)用。3.—種止血或預(yù)防出血藥物，其特征在于該藥物含有權(quán)利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶作為活性成份。4.一種制備權(quán)利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的方法，其特征在于包括以下步驟a)尖吻蝮蛇蛇毒用磷酸鹽緩沖液溶解，離心，上清液上S印hadexG_75凝膠柱，磷酸鹽緩沖液洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰；b)將a)步驟收集的含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰上第一次DEAE-S印haroseFastFlow柱，用含有0-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰；c)將b)步驟收集的含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰用磷酸鹽緩沖液透析，透析樣上第二次DEAE-S^haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰；d)將c)步驟收集的含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰用磷酸鹽緩沖液透析，透析樣上第三次DEAE-S^haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫，收集含該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的有效峰，收集的有效峰經(jīng)脫鹽，凍干后即為該尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶純品。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于a)步驟中所述的尖吻蝮蛇蛇毒是用0.01M，pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液溶解，離心條件為6000rpm和20min，SephadexG-75凝膠柱是用0.01M，pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液洗脫；b)步驟中含有0-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液，濃度為0.01M、pH值為6.8；c)步驟中的所述用磷酸鹽緩沖液透析是用0.01M,pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液，緩沖液濃度為0.01M、pH值為6.8；d)步驟中所述用磷酸鹽緩沖液透析是用0.01M，pH值為7.8的磷酸鹽緩沖液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸鹽緩沖液，緩沖液濃度為0.01M、pH值為7.8，所述的脫鹽是用Si^phadexG-25凝膠柱脫鹽。全文摘要本發(fā)明公開了一種具有止血活性或者預(yù)防出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶。該類凝血酶為單肽鏈，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得其精確分子量為31084Da、SDS-PAGE測(cè)得分子量為37KDa，其N端44個(gè)氨基酸殘基序列為VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC，等點(diǎn)電4.28，最適溫度37℃，最適pH6.6和血漿凝結(jié)比活560單位/毫克。它具有止血功能，不影響血液中凝血因子II、VIII和血小板，無血栓形成危險(xiǎn)。毒理學(xué)研究顯示，與立芷雪比較，其毒性非常低?？梢宰鳛榘踩行У闹寡幬?，適用于臨床出血性疾病的治療和預(yù)防。文檔編號(hào)C12N9/64GK101812436SQ20091021439公開日2010年8月25日申請(qǐng)日期2009年12月30日優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日發(fā)明者唐松山申請(qǐng)人:唐松山