專(zhuān)利名稱(chēng)：食品中大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光pcr定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及對(duì)食品中大 豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
食品過(guò)敏現(xiàn)已成為一個(gè)新興的公眾性健康問(wèn)題，調(diào)查顯示全世界范圍內(nèi)有 2%的成年人對(duì)食品過(guò)敏，而低于三歲的兒童中有8%以上對(duì)食品過(guò)敏。過(guò)敏反應(yīng)產(chǎn)生蕁麻 疹、濕疹、哮喘、鼻炎、嘔吐、腹瀉和過(guò)敏性休克等癥狀。嚴(yán)重的食物過(guò)敏可導(dǎo)致死亡。對(duì)于 食物過(guò)敏治療尚無(wú)特效方法，嚴(yán)格避免食用含有過(guò)敏成分的食品是最有效的療法。近年來(lái)，一些國(guó)家和國(guó)際組織通過(guò)嚴(yán)密的科學(xué)調(diào)查和立法論證，相繼修改和出臺(tái) 規(guī)范了食品中過(guò)敏原成分標(biāo)識(shí)的法律法規(guī)，對(duì)食品標(biāo)簽上過(guò)敏原成分的標(biāo)識(shí)作出嚴(yán)格規(guī) 定。美國(guó)、歐盟、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國(guó)家將常見(jiàn)大豆過(guò)敏原、花生、奶、蛋、魚(yú)、堅(jiān)果、 麩質(zhì)和甲殼類(lèi)動(dòng)物等成分必須在食品標(biāo)簽中標(biāo)識(shí)。大豆是一種常見(jiàn)的過(guò)敏原成分，美國(guó)、歐盟、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國(guó)要求在 食品標(biāo)簽中強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)。由于大豆具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其作為一種食品原料被廣泛用于 各類(lèi)食品的制作。更重要的是，大豆蛋白(大豆?jié)饪s蛋白、大豆分離蛋白等)、大豆卵磷脂等 大豆制品是一種重要的食品添加劑(作為乳化劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、凝固劑等)被廣泛應(yīng)用 于食品工業(yè)，如嬰兒配方食品、肉類(lèi)產(chǎn)品、面包點(diǎn)心、乳制品和各種可食用產(chǎn)品。大豆作為配料中一個(gè)組成成分，可能在標(biāo)簽標(biāo)識(shí)中不能體現(xiàn)，它是一種潛在的過(guò) 敏原，其危害性更大。所以，建立食品中大豆過(guò)敏原成分的特異、靈敏和可定量的檢測(cè)方法， 對(duì)保護(hù)消費(fèi)者健康和知情權(quán)，對(duì)食品標(biāo)簽過(guò)敏原標(biāo)識(shí)提供技術(shù)保障，為保障出口企業(yè)的國(guó) 際貿(mào)易順利進(jìn)行等方面具有十分重要的意義，是迫在眉睫要解決的食品安全問(wèn)題和檢驗(yàn)檢 疫問(wèn)題。然而，在食品中大豆過(guò)敏原成分檢測(cè)存在諸多難點(diǎn)，這主要是因?yàn)槭称返某煞謴?fù) 雜，干擾因素多，對(duì)檢測(cè)方法帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。目前對(duì)大豆成分的檢測(cè)，主要是采用轉(zhuǎn)基因 大豆檢測(cè)的內(nèi)源基因(Lectin基因)。針對(duì)過(guò)敏原基因的檢測(cè)，主要是對(duì)P34蛋白的普通 PCR檢測(cè)和SYBR green的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，但檢測(cè)靈敏度僅0. 01 %。檢測(cè)靈敏度難以滿(mǎn) 足檢測(cè)需要，此外，尚沒(méi)有對(duì)主要過(guò)敏原基因的TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法和定 量檢測(cè)方法。綜上所述，鑒于目前尚沒(méi)有特異性好、靈敏度高的食品中大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí) 熒光檢測(cè)方法。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)高特異性、高靈敏度的食品中大豆過(guò)敏原成分的 實(shí)時(shí)熒光PCR定性定量檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的食品中大豆過(guò)敏原 成分的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。
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本發(fā)明的另一目的在于提供食品中大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑
盒o本發(fā)明的再一目的在于提供食品中大豆過(guò)敏原成分檢測(cè)相關(guān)引物和探針。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，它包括步驟在聚合酶反 應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物 對(duì)和大豆過(guò)敏原成分特異性探針，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有大豆P34蛋白編碼 基因的中部區(qū)域的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的大豆P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域指SEQ ID NO 5的第 1600-2500位的核苷酸序列，較佳地指SEQ ID NO 5的第1700-2100位的核苷酸序列，更佳 地指SEQ ID NO 5的第1790-1942位的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物對(duì)包括SEQ IDN0:1 和SEQ ID NO :2所示的引物。在另一優(yōu)選例中，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性探針是Taqman探針。在另一優(yōu)選例中，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性探針具有選自下組的核苷酸序 列SEQ ID NO :3。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中或之后，檢測(cè)大 豆過(guò)敏原成分特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)體系中含有來(lái)自食品的待檢測(cè)的核酸樣品。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)試劑盒，它含有以下試劑(a)擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物對(duì)，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有 大豆P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域；(b)大豆過(guò)敏原成分特異性探針。在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物對(duì)包括SEQ IDN0:1 和SEQ ID NO :2所示的引物。在另一優(yōu)選例中，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性探針是Taqman探針。在另一優(yōu)選例中，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性探針具有選自下組的核苷酸序 列SEQ ID NO :3。在另一優(yōu)選例中，提供了一種用于檢測(cè)食品中大豆過(guò)敏原成分的檢測(cè)試劑盒，其 含有(a)針對(duì)大豆過(guò)敏原成分設(shè)計(jì)的特異性引物，所述的特異性引物對(duì)特異性地?cái)U(kuò)增 大豆過(guò)敏原成分P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域的一段序列；(b) Taqman探針，所述的Taqman探針與對(duì)應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合；(c)任選的標(biāo)準(zhǔn)參照物；在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)參照物是大豆過(guò)敏原成分DNA或含大豆過(guò)敏原成分 擴(kuò)增目的片段的質(zhì)粒DNA或大豆粉；在另一優(yōu)選例中，所述的特異性引物選自下組
其中，F(xiàn)AM，表示熒光報(bào)告基團(tuán)，Eclipse表示淬滅基團(tuán)。在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明第二方面所述的試劑盒的用途，它們被用于 檢測(cè)在食品中是否存在大豆過(guò)敏原成分。在本發(fā)明的第四方面，提供了一系列寡核苷酸片段，它們具有選自SEQ IDN0. 1-3 的核苷酸序列。在本發(fā)明的第五方面，提供了本發(fā)明上述特異性擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引 物對(duì)和大豆過(guò)敏原成分特異性探針的用途，它們被用于制備用于檢測(cè)在食品中是否存在大 豆過(guò)敏原成分的試劑盒。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具 體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
--累述。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
圖1顯示了大豆成分的物種特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)圖。其中，擴(kuò)增曲線(xiàn)從左到
右分別是黃大豆，黑大豆，青大豆。圖2顯示了大豆DNA濃度比的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度圖。其中，擴(kuò)增曲線(xiàn)從左 到右分別是10ng/ii L 大豆 DNA ； lng/y L 大豆 DNA ；0. lng/y L 大豆 DNA ；0. Olng/y L 大豆 DNA ；0. OOlng/ u L 大豆 DNA。 圖3顯示了大豆粉重量比的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度圖。其中，擴(kuò)增曲線(xiàn)從左到 右分別是10%大豆粉；大豆粉；0. 大豆粉；0. 01%大豆粉；0. 001%大豆粉。圖4顯示了大豆DNA濃度的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)直線(xiàn)回歸方程。圖5顯示了大豆粉重量比的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)直線(xiàn)回歸方程。圖6顯示了大豆P34蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。圖7顯示了大豆P34蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO :5)。其中，SEQ ID NO 1位 于第1790-1814位(方框表示)；SEQ ID NO :2位于第1942-1918位(方框表示)；SEQ IDNO 3位于第1916-1892位(方框表示)。圖8顯示了另一實(shí)施例中大豆粉重量比的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度圖，其中擴(kuò)增 曲線(xiàn)從左到右分別是10%大豆粉；大豆粉；0. 大豆粉。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)對(duì)大豆過(guò)敏原成分的各種基因序列的廣泛而深入的研究，認(rèn)為大豆 過(guò)敏原成分的P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域序列特別適合用于檢測(cè)和鑒定大豆過(guò)敏原成 分。針對(duì)該區(qū)域不僅可以設(shè)計(jì)出特異性擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的引物，還可設(shè)計(jì)出大豆過(guò)敏 原成分特異性探針。這樣，在一次PCR反應(yīng)中，通過(guò)檢測(cè)探針的熒光信號(hào)，就可快速簡(jiǎn)便地 鑒定大豆過(guò)敏原成分。本發(fā)明的檢測(cè)大豆過(guò)敏原成分的方法不僅具有物種特異性，而且靈敏度則顯著提 高到可檢測(cè)低至0.001% (重量)的大豆粉。此外，本發(fā)明方法的ct值與模板拷貝數(shù)之間 的線(xiàn)性關(guān)系量化，可以用于定量檢測(cè)。大豆過(guò)敏原成分本發(fā)明選擇大豆的Gly m Bd 30k蛋白(也被稱(chēng)為P34蛋白)作為檢測(cè)大豆過(guò)敏 原成分的靶目標(biāo)。具體地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大豆過(guò)敏原成分的P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域 序列(SEQ ID NO 5的第1790-1942位)特別適合用于檢測(cè)和鑒定大豆過(guò)敏原成分。Gly m Bd 30k 蛋白(英文Glycine max gene for Bd 30K)是大豆的主要過(guò)敏蛋 白，實(shí)驗(yàn)表明65%的大豆過(guò)敏癥狀都是由Gly m Bd 30k引起的。Gly m Bd 30k蛋白在目 前所有6000余種的大豆品種中都存在。本發(fā)明方法以G1 y m Bd 30k蛋白基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法， 建立食品中大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)方法。引物如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大豆過(guò)敏原成分特異性探針”指這樣的引物(對(duì))，它擴(kuò)增出 的擴(kuò)增產(chǎn)物具有的P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域的核苷酸序列(例如SEQ ID N0:5中第 1790-1942位所示核苷酸序列)。在引物設(shè)計(jì)上，為了能夠更好地滿(mǎn)足目前對(duì)大豆過(guò)敏原成分檢測(cè)的需要。本發(fā)明 人選擇了大豆過(guò)敏原成分P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域作為檢測(cè)靶序列。同時(shí)，本發(fā)明人 對(duì)已公布大豆過(guò)敏原成分的DNA序列進(jìn)行比對(duì)和分析，選擇相對(duì)保守的一段序列設(shè)計(jì)引物 和探針。一種優(yōu)選的、適用于大豆過(guò)敏原成分的引物對(duì)具有SEQ ID NO :1和2所示的序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性引物”，指長(zhǎng)度通常為22士5Nt的寡核苷酸鏈，其與大豆 過(guò)敏原成分P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域的DNA序列完全互補(bǔ)或者相同。探針如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大豆過(guò)敏原成分特異性探針”指能夠結(jié)合于大豆過(guò)敏原成分的 擴(kuò)增產(chǎn)物，但不結(jié)合于其他物種(如蠶豆、豌豆等)的擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。更佳地，所述的大 豆過(guò)敏原成分特異性探針特異性結(jié)合于大豆過(guò)敏原成分的、在SEQ ID N0:5中所示的P34 蛋白編碼基因的中部區(qū)域的核苷酸序列。一種優(yōu)選的、適用于大豆過(guò)敏原成分的探針具有SEQ ID NO 3所示的序列。
可用于本發(fā)明的探針沒(méi)有特別限制，可以包括(但并不限于)Taqman探針和 Taqman-MGB 探針。TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)利用Taq酶5' -3'外切酶活性，在延伸的過(guò)程中實(shí)現(xiàn) 對(duì)雜交探針的切斷，消除探針3'端熒光基團(tuán)對(duì)5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)信號(hào)的淬滅作用。 熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比，檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)檢測(cè)熒光可推測(cè)PCR產(chǎn)物的數(shù)量。本發(fā)明采用的以Eclipse作為淬滅基團(tuán)的Taqman探針不同于以往以TAMRA作為 淬滅集團(tuán)的Taqman探針。TAMRA為熒光染料，在淬滅熒光報(bào)告基團(tuán)的同時(shí)，自身會(huì)發(fā)射熒 光，探針熒光本底相對(duì)較高。而Eclipse為非熒光染料，淬滅熒光報(bào)告基團(tuán)，自身不發(fā)身熒 光，因此探針本底低，信噪比更大，可以使得檢測(cè)靈敏度更高。參照物本發(fā)明還提供了用于食品中大豆過(guò)敏原成分檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)參照物。所述的標(biāo)準(zhǔn)參照 物是大豆過(guò)敏原成分DNA或含大豆過(guò)敏原成分?jǐn)U增目的片段的質(zhì)粒DNA。優(yōu)選的標(biāo)準(zhǔn)參照 物是P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域的DNA或其擴(kuò)增目的片段的質(zhì)粒DNA。這些標(biāo)準(zhǔn)參照物 可用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備。檢測(cè)方法本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)大豆過(guò)敏原成分的方法。例如，將SEQ ID NO :1和2所示的特異性引物和SEQ ID NO 3所示的特異性Taqman 探針混合作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物和探針。實(shí)時(shí)熒光PCR是密閉擴(kuò)增檢測(cè)方法，擴(kuò)增體系加樣完畢后，即可進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)， 不需擴(kuò)增后再進(jìn)行分析；不僅減少環(huán)境污染的可能性，還由于有引物對(duì)與探針共同雜交，比 普通PCR特異性更高。TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)利用Taq酶5' -3'外切酶活性，在延伸的過(guò)程中實(shí)現(xiàn) 對(duì)雜交探針的切斷，消除探針3'端熒光基團(tuán)對(duì)5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)信號(hào)的淬滅作用。 熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正比，檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)檢測(cè)熒光可推測(cè)PCR產(chǎn)物的數(shù)量。本發(fā)明方法中優(yōu)選的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榇蠖惯^(guò)敏原成分P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域 的核苷酸序列，該區(qū)域是大豆過(guò)敏原成分特有的，可用于檢測(cè)大豆過(guò)敏原成分。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計(jì)和合成引物以及大豆過(guò)敏原成分 特異性探針，并用于熒光實(shí)時(shí)PCR定性定量檢測(cè)技術(shù)。在本發(fā)明中，除了檢測(cè)所針對(duì)的靶序列以及相應(yīng)采用的引物(對(duì))和探針等與現(xiàn) 有技術(shù)不同之外，諸如從樣品總抽提DNA、PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)等步驟的條件可與現(xiàn)有技術(shù) 相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以用常規(guī)的條件進(jìn)行上述各種步驟。當(dāng)然，也可采用本申請(qǐng)實(shí) 施例中所給出的優(yōu)選條件。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物對(duì) 能對(duì)大豆過(guò)敏原成分的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果表明，僅在含大豆過(guò)敏原成分的 標(biāo)本表現(xiàn)陽(yáng)性，達(dá)到了預(yù)期的效果。這表明，通過(guò)合理選擇出的大豆過(guò)敏原成分特異性探針 是極為有效和特異的。使用定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)時(shí)，根據(jù)熒光標(biāo)記物(FAM、TET)的不同，可在 530nm或640nm等波長(zhǎng)檢測(cè)。在一優(yōu)選例中，本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)的引物和探針，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)和鑒定食品中大豆過(guò)敏原成分。在反應(yīng)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)參照物可發(fā)出明顯的可檢測(cè)信號(hào)及空白 對(duì)照無(wú)可檢測(cè)信號(hào)情況下，根據(jù)樣品實(shí)施實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增是否有明顯的可檢測(cè)信號(hào)判斷 樣品是否受大豆過(guò)敏原成分污染。在另一優(yōu)選例中，一種食品中大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)方法，可 具體包括如下步驟①.食品中大豆過(guò)敏原成分DNA的提??；②.以DNA為模板，用(a)所述特異性引物和(b)所述Taqman探針?lè)謩e進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并測(cè)定產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)。其中，所述的特異性引物對(duì)特異性地?cái)U(kuò)增大豆過(guò)敏原成分 P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域的一段序列，所述的Taqman探針與對(duì)應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增產(chǎn) 物特異性結(jié)合；③.根據(jù)收集的可檢測(cè)信號(hào)分析測(cè)定數(shù)據(jù)，從而定性或定量地確定和檢測(cè)出食品 樣品是否含有大豆過(guò)敏原成分。在另一優(yōu)選例中，步驟②中，測(cè)定可檢測(cè)信號(hào)是在實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，探針 的報(bào)告基團(tuán)FAM所產(chǎn)生的熒光信號(hào)；在步驟②中還包括將標(biāo)準(zhǔn)參照物和雙蒸水作為模板， 用(a)所述特異性引物和(b)所述Taqman探針?lè)謩e進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；并且在步驟③中包括 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)參照物和雙蒸水的擴(kuò)增測(cè)定和收集可檢測(cè)信號(hào)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，所述的標(biāo)準(zhǔn) 參照物是大豆過(guò)敏原成分DNA或含大豆過(guò)敏原成分?jǐn)U增目的片段的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)可簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)和鑒定食品中的大豆過(guò)敏原成分。(2)基于P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域的引物對(duì)可有效地特異性擴(kuò)增大豆過(guò)敏原 成分的核酸序列，而大豆過(guò)敏原成分特異性探針則可更特異性地區(qū)分大豆過(guò)敏原成分。(3)檢測(cè)結(jié)果線(xiàn)性好，可用于定量分析。(4)檢測(cè)方法靈敏度非常高，可檢測(cè)食品中低至低0. 001% (重量)的大豆粉。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)。實(shí)施例11.實(shí)驗(yàn)材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)材料黃大豆、黑大豆、青大豆、白蕓豆、花蕓豆、紅小豆、赤豆、綠豆、扁豆、豌豆、蠶豆、鷹 嘴豆、四季豆、大米、燕麥、大麥、小麥、番茄、馬鈴薯、玉米、油菜籽、棉花、牛肉、羊肉、豬肉、 雞肉和魚(yú)肉等22種植物材料和5種動(dòng)物材料。50個(gè)歐盟、美國(guó)、馬來(lái)西亞、日本等國(guó)家進(jìn)口的餅干、面包和面條等食品樣品，50 個(gè)國(guó)內(nèi)流通食品樣品購(gòu)自上海大型超市。30個(gè)出口食品樣品獲自上海出口食品加工企業(yè)。1. 2 試齊[J(1)液氮；(2)植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，DP305-02，天根生化科技(北京)有限公司；(3)異丙醇；(4) 70% 乙醇；(5)TE 緩沖液，pH8.0 ；(6)ABI TaqMan Universal PCR Master Mix(Part Number 4304437)；(7)超純水(ddH20)；(8)引物和探針S0Y-F 5' -ATGAAGAAGTAAGAAAGGTGATTGG-3，(SEQ ID NO 1)SOY-R 5' -AGGCATAAATTTTGTGTCATCTCTC-3，(SEQ ID NO 2)SOY-P :5，-(FAM)CCCTCTCCCTCCACTCATCTTCTCT(Eclipse)-3，(SEQ IDNO 3)其中，Eclipse表示淬滅基團(tuán)(暗淬滅劑)。1.3儀器設(shè)備(l)ABI 7300 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀；(2)天平；(3)移液槍?zhuān)?4)離心機(jī);(5)恒溫孵育器；(6)冷凍碾磨機(jī)；(7) DNA冷凍干燥離心機(jī)；(8)核酸蛋白濃度分析儀；(9) Eppendorf 離心管；(10)PCR 反應(yīng)管。1.4樣品的制備1.4. 1樣品的研磨用冷凍研磨機(jī)將上述植物材料和動(dòng)物材料樣品研磨成粉狀?？刹捎盟姆址s樣， 縮樣至200g左右，用點(diǎn)取法取100mg左右樣品提取DNA。對(duì)于很均勻的樣品，也可將樣品 進(jìn)一步混勻后，直接用點(diǎn)取法取50mg樣品提取DNA。對(duì)于液體樣品，如果樣品均質(zhì)，直接取 50mg左右樣品提取DNA ；如果有固體顆粒沉淀，磨碎成均質(zhì)后，取50mg左右樣品提取DNA。1.4. 2樣品配制使用冷凍研磨機(jī)將大豆和小麥磨成粉末狀，并60°C烘干6h。用小麥粉配成大豆粉 含量為10%、1%、0. 1%、0. 01%、0. 001%和 0. 0001% (W/W)的混合樣品。1.OTNA 的提取按常規(guī)方法，根據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，DP305-02)提取上述樣 品 DNA。1. 6DNA濃度測(cè)定及配制用德國(guó)Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白分析儀測(cè)定抽提樣品DNA的濃度。用小麥DNA溶液(濃度100ng/ u L)將抽提的大豆DNA溶液(濃度100ng/ u L) 稀釋成10ng/ii L、lng/ii L、0. lng/y L、0. Olng/y L、0. OOlng/y L 和 0. OOOlng/y L 混合液。1.7PCR 測(cè)試
1.7. 1PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系見(jiàn)表1。表1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系 1. 7. 2PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù):50°C,2min ；95°C，10min ；95°C，15s，60°C，lmin，40
個(gè)循環(huán)。1.8靈敏度測(cè)試L0D是指檢出概率超過(guò)95 %的時(shí)候所能檢測(cè)的最低樣品濃度?？梢酝ㄟ^(guò)建立一系 列不同濃度的樣本進(jìn)行足量的重復(fù)檢測(cè)，或者通過(guò)反復(fù)檢測(cè)一系列不同目的基因模板含量 的參照物質(zhì)，以確定LOD。L0D的表述形式可以是DNA分子的拷貝數(shù)、DNA分子的相對(duì)百分 比或者DNA的質(zhì)量。本實(shí)施例以DNA濃度和重量百分比作為靈敏度測(cè)試的表述形式。2.結(jié)果2. 1大豆過(guò)敏原成分的物種特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)使用引物和探針S0Y-F/S0Y-R/S0Y-P對(duì)黃大豆、黑大豆、青大豆、白蕓豆、花蕓豆、 紅小豆、赤豆、綠豆、扁豆、豌豆、蠶豆、鷹嘴豆、四季豆、大米、燕麥、大麥、小麥、番茄、馬鈴 薯、玉米、油菜籽、棉花、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和魚(yú)肉等22種植物材料和5種動(dòng)物材料DNA 樣品進(jìn)行檢測(cè)。其中黃大豆、黑大豆與青大豆出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，而在其它24個(gè)物種DNA 樣品中均無(wú)擴(kuò)增，這說(shuō)明該檢測(cè)方法具有物種特異性(圖1)。2. 2大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度使用引物和探針S0Y-F/S0Y-R/S0Y-P對(duì)10倍系列稀釋大豆DNA含量的大豆小麥 DNA 混合液進(jìn)行檢測(cè)。在 10ng/ u L、lng/ u L、0. lng/ u L、0. Olng/ y L 和 0. OOlng/ u L 大豆 DNA出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)，而0.000lng/iiL大豆DNA未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖2)。實(shí)驗(yàn)表明，在DNA濃度的水平上，該方法的檢測(cè)靈敏度為0. OOlng/uL大豆DNA。使用引物和探針S0Y-F/S0Y-R/S0Y-P 對(duì) 10 %、1 %,0. 1 %,0. 01 %,0. 001 % 和 0.0001%大豆粉含量的大豆小麥混合樣品(W/W)進(jìn)行檢測(cè)。在10%、1%、0. 1%、0.01%和 0. 001 %大豆粉出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)，而0. 0001 %大豆粉未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖3)。實(shí)驗(yàn)表明，在重量百分比水平上，該方法的檢測(cè)靈敏度為0. 001%大豆粉(W/W)。2. 3大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)使用引物和探針S0Y-F/S0Y-R/S0Y-P 對(duì) 10ng/u LUng/u L,0. lng/y L、0. Olng/ ii L和0. OOlng/ ii L大豆DNA含量的大豆小麥DNA混合液進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)Ct值見(jiàn)表2，定
10量檢測(cè)的直線(xiàn)回歸方程見(jiàn)圖4。 表2大豆成分DNA濃度的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)Ct值
結(jié)果表明，在DNA濃度的水平上，Ct值與模板拷貝數(shù)之間的線(xiàn)性關(guān)系良好，可定量 檢測(cè)大豆DNA濃度。使用引物和探針S0Y-F/S0Y-R/S0Y-P 對(duì) 10%U%>0. 1 %、0. 01 %和 0. 001 %大豆 粉含量的大豆小麥混合樣品(W/W)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)Ct值見(jiàn)表3，線(xiàn)性回歸方程見(jiàn)圖5。表3大豆成分重量比的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)Ct值 實(shí)驗(yàn)表明，在重量百分比水平上，Ct值與模板拷貝數(shù)之間的線(xiàn)性關(guān)系良好，可定量 檢測(cè)大豆含量。3.結(jié)論本發(fā)明以檢測(cè)大豆Gly m Bd 30k蛋白基因?yàn)閷?duì)象的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法具有 特異性強(qiáng)、靈敏度高和可定量檢測(cè)的特點(diǎn)，適用于食品中大豆過(guò)敏原成分的檢測(cè)，能應(yīng)用于 日常檢驗(yàn)檢疫工作。實(shí)施例2檢測(cè)Gly m Bd 30k蛋白基因的5，端區(qū)域在本實(shí)施例中，方法同實(shí)施例1，不同點(diǎn)在于，選擇大豆P34蛋白基因的3’端區(qū)作 為擴(kuò)增對(duì)象。采用的熒光探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR引物探針為S0Y-1F :5，-TGTCATCACCCAAGTAAAGTACCA-3，(SEQ ID N0:6，對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO 5 的第 5081-5104 位)S0Y-1R :5，-CAAGGTCTCCTGTTGCTATTGC-3，(SEQ ID NO :7，對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO :5 的 第 5542-5521 位)S0Y-1P 5‘- (FAM) TGCTGCTTCTATGGCTCCCGTGGC (Eelipse) -3‘ (SEQID NO :8，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 5 的第 5517-5494 位)應(yīng)用S0Y-1F/S0Y-1R/S0Y-1P引物探針的檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果如下1、大豆過(guò)敏原成分的物種特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)使用引物和探針S0Y-1F/S0Y-1R/S0Y-1P對(duì)黃大豆、黑大豆、青大豆、白蕓豆、花蕓 豆、紅小豆、赤豆、綠豆、扁豆、豌豆、蠶豆、鷹嘴豆、四季豆、大米、燕麥、大麥、小麥、番茄、馬 鈴薯、玉米、油菜籽、棉花、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和魚(yú)肉等22種植物材料和5種動(dòng)物材料 DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。其中黃大豆、黑大豆與青大豆出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，而在其它24個(gè)物種 DNA樣品中均無(wú)擴(kuò)增，這說(shuō)明該檢測(cè)方法具有物種特異性。2大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度使用引物和探針S0Y-1F/S0Y-1R/S0Y-1P對(duì)10倍系列稀釋大豆DNA含量的大豆 小麥DNA混合液進(jìn)行檢測(cè)。在10ng/ii L、lng/ii L、0. lng/ u L大豆DNA出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)，而 0. 01ng/ii L、0. OOlng/ii L和0. 000lng/ii L大豆DNA未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)表明，在DNA濃 度的水平上，該方法的檢測(cè)靈敏度為0. lng/ y L大豆DNA。使用引物和探針S0Y-1F/S0Y-1R/S0Y-1P 對(duì) 10%,1%>0. 1%,0. 01%,0. 001%和 0. 0001%大豆粉含量的大豆小麥混合樣品(W/W)進(jìn)行檢測(cè)。在10%、1%、0. 大豆粉出現(xiàn) 擴(kuò)增曲線(xiàn)，而0.01%、0. 001%和0.0001%大豆粉末出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖8)。實(shí)驗(yàn)表明，在重 量百分比水平上，該方法的檢測(cè)靈敏度為0. 大豆粉(W/W)。上述結(jié)果表明，S0Y-F/S0Y-R/S0Y-P的檢測(cè)靈敏度顯著高于S0Y-1F/S0Y-1R/ S0Y-1P，即P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域比P34蛋白編碼基因的3端區(qū)域更適合用于檢測(cè)?，F(xiàn)有技術(shù)中有SYBR染料法實(shí)時(shí)熒光PCR法，檢測(cè)原理是利用熒光染料(SYBR Green I)與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，其缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)， 只要有雙鏈DNA出現(xiàn)，如PCR過(guò)程中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增或引物二聚體等，均有擴(kuò)增信號(hào)，造 成假陽(yáng)性結(jié)果。與之相反，本發(fā)明采用熒光探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR法，其檢測(cè)原理是利用熒光標(biāo)記 的特異性探針來(lái)識(shí)別模版，其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)。實(shí)施例3對(duì)食品的檢測(cè)按實(shí)施例1相同方式，用引物(SEQ ID NO 1和2)結(jié)合SEQ ID NO 3所示的探針 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，分別對(duì)購(gòu)自市場(chǎng)上的130批食品樣品進(jìn)行大豆過(guò)敏原成分實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測(cè)。130批食品樣品中，50批為進(jìn)口食品樣品，30批為出口食品樣品，50批為國(guó)內(nèi) 流通食品樣品。結(jié)果在50個(gè)進(jìn)口食品中，30個(gè)樣品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)含有大豆過(guò)敏原成分，20個(gè)樣品標(biāo)簽未標(biāo) 識(shí)含有大豆過(guò)敏原成分。用本發(fā)明建立的檢測(cè)方法對(duì)這50個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與樣 品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)相符。在30個(gè)出口食品中，10個(gè)樣品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)含有大豆過(guò)敏原成分，20個(gè)樣品標(biāo)簽未標(biāo) 識(shí)含有大豆過(guò)敏原成分。用本發(fā)明建立的檢測(cè)方法對(duì)這30個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，10個(gè)標(biāo)識(shí)含有 大豆過(guò)敏原成分樣品的檢測(cè)結(jié)果與樣品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)相符，而在2個(gè)未標(biāo)識(shí)含有大豆過(guò)敏原成分的樣品中檢出大豆過(guò)敏原成分。對(duì)這2份標(biāo)識(shí)不符合的樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，大豆DNA含 量分別為 3. lng/ ii L 和 2. 6ng/ u L。在50個(gè)國(guó)內(nèi)流通食品中，5個(gè)樣品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)含有大豆過(guò)敏原成分，45個(gè)樣品標(biāo)簽 未標(biāo)識(shí)含有大豆過(guò)敏原成分。用本發(fā)明建立的檢測(cè)方法對(duì)這50個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，5個(gè)標(biāo)識(shí) 含有大豆過(guò)敏原成分樣品的檢測(cè)結(jié)果與樣品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)相符，而在15個(gè)未標(biāo)識(shí)含有大豆過(guò) 敏原成分的樣品中檢出大豆過(guò)敏原成分。對(duì)不符合標(biāo)簽標(biāo)識(shí)的2個(gè)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，大 豆DNA含量分別為0. 8ng/ y L和5. 7ng/ u L。因此，本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)體系適于食品中大豆過(guò)敏原成分的檢 測(cè)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110>上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>食品中大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)方法<130)094842<160>8<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>1atgaagaagt aagaaaggtg attgg25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>2aggcataaat tttgtgtcat ctctc25<210>3 <211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>探針
<400>3
ccctctccct ccactcatct tctct
<210>4
<211>379
<212>PRT
<213> 大豆(Glycine max)
<400>4
Met Gly PheLeuValLeuLeuLeuPheSerLeuLeuGlyLeuSerSer
151015
Ser Ser SerlieSerThrHisArgSerlieLeuAspLeuAspLeuThr
202530
Lys Phe ThrThrGinLysGinValSerSerLeuPheGinLeuTrpLys
354045
Ser Glu HisGlyArgValTyrHisAsnHisGluGluGluAlaLysArg
505560
Leu Glu liePheLysAsnAsnLeuAsnTyrlieArgAspMetAsnAla
65707580
Asn Arg LysSerProHisSerHisArgLeuGlyLeuAsnLysPheAla
859095
Asp lie ThrProGinGluPheSerLysLysTyrLeuGinAlaProLys
100105110
Asp Val SerGinGinlieLysMetAlaAsnLysLysMetLysLysGlu
115120125
Gin Tyr SerCysAspHisProProAlaSerTrpAspTrpArgLysLys
130135140
Gly Val lieThrGinValLysTyrGinGlyGlyCysGlySerGlyTrp
145150155160
Ala Phe SerAlaThrGlyAlalieGluAlaAlaHisAlalieAlaThr
165170175
Gly Asp LeuValSerLeuSerGluGinGluLeuValAspCysValGlu
180185190
Glu Ser GluGlyCysTyrAsnGlyTrpHisTyrGinSerPheGluTrp
195200205
Val Leu GluHisGlyGlylieAlaThrAspAspAspTyrProTyrArg210
Ala Lys 225
lie Asp Gly
Glu Gly Arg
Tyr Glu 245 Ala
Cys 230 Thr
215
Lys Ala Asn Lys
Leu lie Met
Glu Thr Glu Gin 260
Val Ser lie Asp Ala Lys Asp
Ser 250 lie
lie 235 Asp
220
Gin Asp
Asp
Leu 305 Asn
Gly 290 Val
lie 275
Glu Asn
Gly Ser Trp
Arg Asn Thr
Ser Tyr
Pro 355 His
Tyr
Gly
Gly 340 Thr
Cys Thr Gly
Glu
Phe Leu Ser Ala lie Leu Glu Gin 265
Phe His Leu Tyr Thr Gly 280285
Pro Tyr Gly lie Asn His
Lys Val Ser Thr
Glu 325 Asn
Ser 310 Asp
Ser 295
Ala Asp Gly Val Trp Gly Glu
Leu Leu
Lys Glu Glu Arg Arg Val
Lys Gly 370 <210>5 <211>6675 <212>DNA
<213> 大豆(Glycine max) <400>5
Asp 375
Gly Val 345 Ser Glu 360
His Ser
Asp 330 Cys
Asp 315 Gly
Asn 300
Tyr
Pro 270 Gly
Phe
lie
Glu 255 lie
Thr 240
Ser
Ser
Trp Tyr lie Trp Gly Met Asn
lie Tyr Val Leu Ala
Thr Leu Val
Pro Leu
Ser 365
Tyr 350 Ala
lie 335 Phe
Lys 320 Gin
Ala Arg Valggatccaaagaaaaactggtcataaagtgggagtatgtgggatgaatttttttgcttctt60
ggccaaccaaagagaaatcagcaacactcgtgtctgctcgtgttaaagctgatcaaagag120
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15
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<210>6
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<212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
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〈223〉引物
〈400>6
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<212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
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〈223〉引物
<400>7
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<212>DNA
<213>人工序列
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<221>misc_feature
<223>探針
<400>8
tgctgcttct atggctcccg tggc2權(quán)利要求
一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于，它包括步驟在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物對(duì)和大豆過(guò)敏原成分特異性探針，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有大豆P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物 對(duì)包括:SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性探針是 Taqman 探針。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性探 針具有選自下組的核苷酸序列SEQ ID NO :3。
5.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈 式反應(yīng)過(guò)程中或之后，檢測(cè)大豆過(guò)敏原成分特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
6.一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有以下試劑(a)擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物對(duì)，并且所述引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物具有大豆 P34蛋白編碼基因的中部區(qū)域；和(b)大豆過(guò)敏原成分特異性探針。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引 物對(duì)包括SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性探針是 Taqman 探針。
9.如權(quán)利要求6-8中任一所述的試劑盒，其特征在于，所述的大豆過(guò)敏原成分特異性 探針具有選自下組的核苷酸序列SEQ ID NO :3。
10.如權(quán)利要求6所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于檢測(cè)在食品中是否存在大豆 過(guò)敏原成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及食品中大豆過(guò)敏原成分的實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)方法。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)大豆過(guò)敏原成分的方法，在聚合酶反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增大豆過(guò)敏原成分的特異性引物對(duì)和大豆過(guò)敏原成分特異性探針。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明可靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)和鑒定大豆過(guò)敏原成分。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101851669SQ20091019814
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日
發(fā)明者張佳誼, 張舒亞, 李妮, 高琴 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心