水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法

專利名稱：：水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及水稻紋枯病菌融合群判定的鑒別方法。
背景技術(shù)：
："民以食為天，食以稻為先"。水稻是我國主要的糧食作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用。近年來，由于各種水稻病害流行小種的爆發(fā)及其致病力的變異，危害程度加重，嚴(yán)重威脅水稻的生產(chǎn)安全。水稻紋枯病是世界上水稻產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、危害嚴(yán)重的世界性病害之一。隨著矮稈、多蘗雜交稻組合的大力推廣、施肥量及種植密度的提高以及氣候變暖等因素，水稻紋枯病在我國的發(fā)生及危害日益嚴(yán)重。20世紀(jì)70年代以前，該病在我國僅為零星發(fā)生；70年代后迅速蔓延，并于80年代在我國水稻種植區(qū)大面積爆發(fā)；90年代以后，該病的發(fā)生為害更為猖獗，南方稻區(qū)的發(fā)病面積普遍超過50%以上。據(jù)報(bào)道，1982年水稻紋枯病在全國的發(fā)病面積約為1000萬hm、損失稻谷約為3.5Xl(fkg;1995年發(fā)病面積擴(kuò)大到近1600萬hi^，損失稻谷超過11X109kg。近幾年，水稻紋枯病在我國發(fā)病面積為15002000萬hm、每年損失稻谷約6X109kg，一般發(fā)病田塊導(dǎo)致減產(chǎn)15%20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)60%70%，占水稻病蟲害損失的40%50%。目前在我國南方大多數(shù)水稻種植區(qū)，紋枯病已經(jīng)成為最重要的水稻病害，無論是發(fā)生面積或造成的為害損失均居病害之首，成為制約水稻生產(chǎn)的重要障礙之一。水稻紋枯病的病原菌為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，是絲核菌屬真菌中最復(fù)雜、最龐大同時(shí)也是研究比較深入的一個(gè)集合種。R.solani是水稻、玉米、大豆、草坪草和高粱等作物的紋枯病和立枯病的致病菌，還能引起馬鈴薯黑痣病、油菜菌核病、甜菜爛根病、豌豆莖腐病以及許多作物(如大豆、花生和蠶豆)的網(wǎng)斑或葉枯病等主要病斑(陳延熙1985、喻大昭2000)。目前，主要根據(jù)菌絲融合群的方法來劃分R.solani在生理上特異的菌株。0goshi等(1987)、李華榮(1999)研究認(rèn)為當(dāng)兩個(gè)絲核菌分離物配對(duì)培養(yǎng)時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到菌絲生長和交疊。如果發(fā)生菌絲融合，觀察到菌絲間的吸引和融合細(xì)胞的壞死，便稱這兩個(gè)分離物為相同的融合群；如果不發(fā)生融合，或不發(fā)生菌絲壞死，便不屬于相同的融合群。根據(jù)菌絲融合與否，現(xiàn)已將R.solani分為14個(gè)融合群(AG-1AG-13，AG-BI)。融合群又可以分為融合亞群，如0goshi等根據(jù)AG-1融合群內(nèi)的菌株致病性將其分為AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC三個(gè)亞群。李華榮等(1990)對(duì)四川省東、南稻區(qū)采集的108個(gè)水稻紋枯病菌按菌絲融合的方法進(jìn)行菌系鑒定，其中水稻紋枯病菌隸屬于AG-1為97X，AG-4為1X，AG-Bb為2%。楊艮華等(2002)對(duì)來自云南省20多個(gè)縣市采集的水稻紋枯病樣本進(jìn)行分離得到54個(gè)菌株，按照菌絲融合將水稻紋枯病菌分為AG-1IA、AG-1IC、AG-6GW、AG-Bb和AGI-II5個(gè)菌系。由于AG-1IA的致病力最強(qiáng)且分離獲得比例最高，目前普遍認(rèn)為AG-1IA是水稻紋枯病的主要致病菌。0goshi等(1987)和李華榮等(1999)認(rèn)為，菌絲融合群分類法是當(dāng)前絲核菌最成功的分類手段，但其不能提供R.solani融合群或亞群間以及融合群內(nèi)或亞群內(nèi)更多的遺傳信息。因此，隨著分子生物學(xué)及其相關(guān)科學(xué)的快速發(fā)展，以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)為解決立枯絲核菌的鑒定診斷提供了最有力的工具。直接測(cè)定立枯絲核菌的遺傳物質(zhì)(DNA)成為了分子診斷最有力的工具。在真菌的分子診斷和鑒定中，最有價(jià)值的基因組區(qū)域之一是核糖體DNA(ribosomalDNA，rDNA)重復(fù)單元，這是由于rDNA在基因組中有多個(gè)拷貝(100500)，并且每個(gè)單位的rDNA基因其保守區(qū)和可變區(qū)摻雜分布。White等(1999)公布的真菌rDNA特異性擴(kuò)增的通用引物序列更是起了巨大的推動(dòng)作用。在真菌分子分類研究過程中，rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacerRegion，ITS)序列常作為種級(jí)分類群及種下個(gè)體差異研究的PCR選擇區(qū)域。目前ITS-5.8SrDNA序列分析技術(shù)在R.solani融合群內(nèi)和融合群間的分子特征及分子診斷研究中得到廣泛的應(yīng)用。K皿inaga等(1997)對(duì)隸屬10個(gè)融合群17個(gè)亞融合群的45個(gè)立枯絲核菌的ITS-5.8SrDNA序列進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，同一亞融合群不同菌株間的同源性達(dá)96%以上，不同亞融合群之間的同源性為66%100%，不同融合群之間的同源性為55%96%。結(jié)果說明，ITS-5.8SrDNA序列分析方法可對(duì)立枯絲核菌在融合群、融合亞群、甚至是亞亞群等分類單元進(jìn)行有效的劃分。Boysen等(1996)對(duì)AG-1和AG-4融合群的菌株進(jìn)行rDNA-ITS序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其序列差異較大。Takeshi等(2004)認(rèn)為ITS-5.8SrDNA序列能將AG-1ID與AG-1的其它融合亞群進(jìn)行有效區(qū)分。Salazar等(2000)利用ITS-5.8SrDNA序列分析法，對(duì)AG_2不同亞群及AG-2-2亞群的不同亞亞群進(jìn)行了研究，表明ITS-5.8SrDNA序列分析能對(duì)這兩個(gè)分類單元進(jìn)行有效劃分。上述結(jié)果證明，ITS-5.8SrDNA序列分析方法在立枯絲核菌不同級(jí)別的分類、鑒定中具有不可取代的地位。因此，利用立枯絲核菌ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析后再設(shè)計(jì)特異性引物，可以對(duì)該病原菌引起的病害進(jìn)行診斷和檢測(cè)，這將對(duì)病害的防治具有實(shí)際的生產(chǎn)意義。特異性引物PCR或多重PCR技術(shù)是近年來真菌分子診斷取得的重要進(jìn)展。通過PCR擴(kuò)增就可以在混合樣本中特異性地檢測(cè)出病原菌?；诤颂求wDNA(rDNA)而構(gòu)建的特異性引物進(jìn)展較快，在診斷病原真菌上取得了突破性進(jìn)展。US5585238號(hào)專利針對(duì)ITS區(qū)分別設(shè)計(jì)了鑒定S印toria，Pseudocercosporella禾口Mycosphaerella的特異性弓l物。US5800997號(hào)專利針對(duì)ITS區(qū)設(shè)計(jì)了鑒定Cercospora，Helminthosporium，Kabatiella和Puccinia的特異性引物。W095/29260號(hào)專利針對(duì)ITS區(qū)設(shè)計(jì)了鑒定Fusarium的特異性引物。在絲核菌(Rhizoctonia)檢測(cè)方面，US6485907號(hào)專利針對(duì)ITS序列，設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)的特異性引物。Carling等(2002)根據(jù)立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)AG2融合群內(nèi)rDNAITS序列差異，分別設(shè)計(jì)了特異性引物檢測(cè)AG-2-l、AG-2-2IIIB、AG-2-2VI、AG-2-2LP、AG-2-3和AG-2-4。Andrea等(1998)根據(jù)與水稻紋枯病有關(guān)的3種真菌復(fù)合體Rhizoctoniasolani、Rhizoctoniaoryzae和Rhizoctoniaoryzae-sativae的ITS序列分析結(jié)果，從ITS1和ITS2區(qū)域的差異中設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，利用這些引物可以快速、準(zhǔn)確地區(qū)分這3種病原菌。然而，水稻紋枯病菌是個(gè)集合種，現(xiàn)有的對(duì)水稻紋枯病菌的鑒別方法是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，尚需要新的技術(shù)進(jìn)一步補(bǔ)充完善。傳統(tǒng)的菌絲融合判定標(biāo)準(zhǔn)具有較多的主要因素，不利于客觀準(zhǔn)確的判斷水稻紋枯病菌的融合群類型?，F(xiàn)時(shí)的分子技術(shù)只能判定少數(shù)融合群類型，無法區(qū)別多個(gè)融合群類型。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種快速、準(zhǔn)確判定水稻紋枯病菌融合群類型的技術(shù)方案。本發(fā)明根據(jù)ITS-5.8SrDNA序列設(shè)計(jì)不同菌絲融合群鑒別的特異性引物，作為水稻紋枯病菌融合群判定的鑒別引物，并通過水稻紋枯病菌DNA提取，利用特異性鑒別引物和-對(duì)通用引物配對(duì)，進(jìn)行一步雙重PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳圖譜鑒定水稻紋枯病菌的融合群類型。所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征包括以下步驟1)隸屬于立枯絲核菌不同菌絲融合群AG-lIA、AG-lIB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8和AG-BI的標(biāo)準(zhǔn)菌株RlR8，分別采用改良的CTAB法提取其基因組總DNA;2)設(shè)計(jì)判定水稻紋枯病菌融合群類型的特異性引物以步驟1)得到的不同融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，以ITSl和ITS4為通用引物，分別進(jìn)行各個(gè)菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS-5.8SrDNA序列的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后均得到單一的700bp的擴(kuò)增條帶，序列測(cè)定分析后，得到立枯絲核菌不同融合群菌株ITS區(qū)的核苷酸序列，找到區(qū)分不同菌絲融合群菌株ITS-5.8SrDNA序列的特異性堿基位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出判定水稻紋枯病菌融合群類型的特異性鑒別引物。ITSl核苷酸序列如SEQNo.1所示，ITS4核苷酸序列如SEQNo.2所示，菌絲融合群AG-1IA標(biāo)準(zhǔn)菌株Rl的ITS苷酸序列如SEQNo.3所示，菌絲融合群AG-1IB標(biāo)準(zhǔn)菌株R2的ITS苷酸序列如SEQNo.4所示，菌絲融合群AG-2-1標(biāo)準(zhǔn)菌株R3的ITS苷酸序列如SEQNo.5所示，菌絲融合群AG-4標(biāo)準(zhǔn)菌株R4的ITS-5酸序列如SEQNo.6所示，菌絲融合群AG-5標(biāo)準(zhǔn)菌株R5的ITS-5酸序列如SEQNo.7所示，菌絲融合群AG-6標(biāo)準(zhǔn)菌株R6的ITS-5酸序列如SEQNo.8所示，菌絲融合群AG-8標(biāo)準(zhǔn)菌株R7的ITS-5酸序列如SEQNo.9所示，菌絲融合群AG-BI標(biāo)準(zhǔn)菌株R8的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.10所示，菌絲融合群AG-1IA標(biāo)準(zhǔn)菌株Rl的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.11所示，全序列包括了3'端18SrDNA小亞基的部分核苷酸序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列(18S與5.8S之間)、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列(5.8S與28S之間)、以及5'端28SrDNA大亞基的部分序列；菌絲融合群AG-1IB標(biāo)準(zhǔn)菌株R2的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.12所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-2-1標(biāo)準(zhǔn)菌株R3的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.13所示，-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-4標(biāo)準(zhǔn)菌株R4的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.14所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-5標(biāo)準(zhǔn)菌株R5的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.15所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-6標(biāo)準(zhǔn)菌株R6的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.16所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-8標(biāo)準(zhǔn)菌株R7的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.17所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-BI標(biāo)準(zhǔn)菌株R8的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.18所示；全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列。3)從水稻紋枯病感病莖桿或葉片中分離、純化水稻紋枯病菌；4)采用改良的CTAB法提取水稻紋枯病菌的總基因組DNA;5)以步驟4)得到的水稻紋枯病菌DNA為PCR模板，用步驟2)中區(qū)分不同菌絲融合群菌株AG-lIA、AG-lIB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的特異性鑒別引物作為水稻融合群判定的鑒別引物，同時(shí)加入通用引物ITS4和ITS1，進(jìn)行一步雙重PCR，若能同時(shí)擴(kuò)增出500bp和700bp的兩條特異性片段，即可判斷出水稻紋枯病菌隸屬于對(duì)應(yīng)的菌絲融合群；若只能擴(kuò)增出700bp的單一條帶，即可判斷出水稻紋枯病菌不屬于該菌絲融合群。所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于步驟1)和步驟4)中立枯絲核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或水稻紋枯病菌基因組DNA采用改良的CTAB法提取取O.2g菌絲，液氮研磨后加入800iiLDNA提取液，65。C下水浴保溫30min，10000g離心10min;取上清液用等體積的氯仿/異戊醇(V:V=24:1)抽提，10000g離心10min;用氯仿/異戊醇(V:V=24:1)抽提再抽提1次；上清液加入等體積的DNA沉淀液，充分混勻，10000g離心10min;棄上清，在沉淀中加入1MNaCl300iiL，重新溶解，再加入等體積的氯仿/異戊醇(V:V=24:1)抽提，10000g離心10min;取上清液加入2.5倍體積的冷凍異丙醇，置于冰上30min沉淀DNA，4t:下10000g離心10min，棄上清液，用70%的酒精清洗，抽干后加TE緩沖液充分溶解，即得到菌株的基因組總DNA，在-201:下保存?zhèn)溆?。所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于步驟2)中不同菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS-5.8SrDNA序列的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25yL總體積中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM引物ITS1，10iiM引物ITS4，標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA100ng，0.5UTaqDNApolymerase,加ddH20補(bǔ)足體積至25iiL。PCR反應(yīng)條件為:94"C預(yù)變性4min;94。C變性50s，55。C退火50s，72。C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72t:再延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.5yL的10Xloadingbuffer于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用1XTAE作為電泳緩沖液，100V下電泳40分鐘，經(jīng)EB染色后在紫外凝膠透射儀下觀察結(jié)果。所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于步驟5)中水稻紋枯病菌融合群判定的雙重PCR反應(yīng)體系25iiL總體積中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10yM水稻紋枯病菌融合群判定的特異性鑒別引物，10yM引物ITSl，10iiM引物ITS4，水稻紋枯病菌DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,加ddH20補(bǔ)足體積至25iiL，PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性4min;94"變性50s，55"退火50s，72"延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72t:再延伸10min。PCR擴(kuò)增后擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.5yL的10Xloadingbuffer于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用1XTAE作為電泳緩沖液，100V下電泳40分鐘，經(jīng)EB染色后在紫外凝膠透射儀下觀察結(jié)果。所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于所述的DNA提取液為1L溶液中含有20gCTAB、1.4MNaCl、100mMTris-HCl、20mMEDTA禾口lmlP-巰基乙醇，pH值為8.0。所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于所述的DNA沉淀液為1L溶液中含有10gCTAB、50mMTris-HCl和10mMEDTA，pH值為8.0。本發(fā)明利用特定的重復(fù)多拷貝ITS-5.8SrDNA序列，通過ClustalX分析軟件對(duì)立枯絲核菌不同菌絲融合群菌株的ITS-5.8SrDNA序列分析比較。結(jié)果顯示，不同菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS-5.8SrDNA序列之間有較大的差異。通過分析比較得到的變異位點(diǎn)為鑒別引物，能很好地區(qū)分各個(gè)菌絲融合群類型，并且有效地判定水稻紋枯病菌隸屬的菌絲融合群。該發(fā)明會(huì)使水稻紋枯病用PCR技術(shù)進(jìn)行田間早期診斷，有利于及早掌握病原菌田間發(fā)生的類型及發(fā)展情況。使水稻紋枯病的研究向定性檢測(cè)方向發(fā)展，能夠利用特異性引物定性檢測(cè)出田間紋枯病菌的病原菌類型，對(duì)水稻紋枯病菌的檢疫檢驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐中的識(shí)別提供快速準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法，為制定引起的水稻紋枯病的病原物的綜合治理策略提供理論參考，對(duì)進(jìn)出境其它由絲核菌引起重要的檢疫性真菌病害的分子檢測(cè)具有實(shí)際借鑒意義。本發(fā)明設(shè)計(jì)了8條特異性鑒別引物，用雙重PCR的擴(kuò)增圖譜辨別水稻紋枯病菌的融合群類型，具有準(zhǔn)確快捷、公正客觀、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。圖1為不同菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITS-5.8SrDNA擴(kuò)增電泳圖；圖2為水稻紋枯病菌融合群判定的一步雙重PCR擴(kuò)增電泳圖。圖中M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(100bp);1為陰性對(duì)照(H20);2_9分別為隸屬于融合群AG-BI、AG-8、AG-6、AG-5、AG-lIA、AG-4、AG-2-l和AG-1IB的標(biāo)準(zhǔn)菌株R8、R7、R6、R5、R1、R4、R3禾PR2。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)選用的材料大田自然發(fā)病的水稻紋枯病樣品，以及實(shí)驗(yàn)室保存的分別隸屬于不同菌株融合群AG-1IA、AG-1IB、AG-2-l、AG-4、AG_5、AG_6、AG_8、AG-BI的標(biāo)準(zhǔn)菌株Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8。8主要試劑10XTaqreactionbuffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、ddH20、lOObpDNAmarker、DNA凝膠回收試劑盒(TAKARA)、E.coliDH5a、X-gal、IPTG、pMD18_TeasyVector(TAKARA)、弓|物均由上海生物工程有限公司合成。實(shí)施例1從感病的水稻莖桿上分離、純化水稻紋枯病菌從中國水稻研究所浙江富陽試驗(yàn)基地水稻田，采集感紋枯病的國稻六號(hào)雜交稻的水稻莖桿，帶回實(shí)驗(yàn)室。將病桿組織經(jīng)無菌水沖洗3次，用滅菌過的濾紙吸干組織表面的水分。再將病組織剪成長寬為5mm的小塊，將其放置于2%水瓊脂(瓊脂20g，水lOOOmL)培養(yǎng)基中，置2『C培養(yǎng)箱下培養(yǎng)，2436h后病組織周圍長出絲核菌特征的菌落，用無菌的刀片切取單菌絲尖端移植于PDA(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL)培養(yǎng)基中進(jìn)行純化，置28°C培養(yǎng)箱中純化培養(yǎng)后，保存于4°C冰箱中備用。實(shí)施例2菌株基因組DNA的提取菌絲的獲取將保存于斜面培養(yǎng)基上的立枯絲核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或分離得到的水稻紋枯病菌經(jīng)平板活化后，挑取一小塊菌絲塊(約0.5mmX0.5mm)移入裝有100mLPDB(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28。C搖床振蕩培養(yǎng)56d。將獲得的培養(yǎng)物用滅菌水沖洗2次，然后用真空泵將培養(yǎng)物充分抽干，保存于-2(TC冰箱中備用。DNA提取采用改良的CTAB法提取菌株總基因組DNA。取0.2g吸干的菌絲，液氮研磨，力B800iiLDNA提取液(1L溶液中含有20gCTAB、1.4MNaCl、100mMTris-HCl、20mMEDTA和lml|3-巰基乙醇，pH值為8.0)，在1.5mL的離心管中65"下保溫30min，保溫期間輕搖3-4次，10000g離心10min;取上清至一新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(V(氯仿)V(異戊醇)=24:1)混合液，充分混勻，10000g離心10min;再取上清至一新的離心管中，再次加入等體積的氯仿/異戊醇(v(氯仿)v(異戊醇)=24:i)混合液，充分混勻，10000g離心10min;取上清加入等體積的DNA沉淀液(1L溶液中含有10gCTAB、50mMTris-HCl禾P10mMEDTA，pH值為8.0)，充分混勻，10000g離心10min;棄上清，沉淀中加入lMNaCl300iiL，重新溶解，再加入等體積的氯仿/異戊醇(V(氯仿)V(異戊醇)=24:1)混合液，充分混勻，10000g離心10min;取上清至一新的離心管中，加入2.5倍體積的冷凍異丙醇，冰上放置30min沉淀DNA;4。C下10000g離心10min，棄上清，用70%的酒精洗滌沉淀2次，晾干，加TE緩沖液(10mMTris-HCl，lmMEDTA，pH值為8.0)充分溶解后，在-201:下保存?zhèn)溆?，即得到菌株的總基因組DNA。DNA濃度測(cè)定，將樣品用核酸_蛋白儀檢測(cè)DNA的濃度和純度(結(jié)果見表1)，將樣品稀釋為100ng/iU，用于PCR擴(kuò)增。表l菌株總基因組DNA的純度和濃度檢測(cè)結(jié)果9菌株代號(hào)菌絲融合群A260細(xì)0濃度ng/化水稻紋枯病菌1.861.971.601.851.791.731.901.891.9024.3722,6222.5924.3521.5822.2443.0029.5443.00RlR2R3R4R5R6R7R8AG-1IAAG-1IBAG-2-1AG-4AG-5AG-6AG-8AG—BI實(shí)施例3不同菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITS-5.8SrDNA序列的PCR擴(kuò)增對(duì)隸屬于不同菌絲融合群菌株AG-11A、AG-11B、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的標(biāo)準(zhǔn)菌株RlR8，進(jìn)行ITS-5.8SrDNA序列的PCR擴(kuò)增。采用White等(1990)設(shè)計(jì)的通用引物ITS1和ITS4，由上海生物工程有限公司合成，ITS1和ITS4的序列分別為ITS1(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，;SEQNo.1)，ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，;SEQNo.2)。PCR反應(yīng)體系為25iiL總體積中含有l(wèi)OXTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM引物ITSl，10iiM引物ITS4，標(biāo)準(zhǔn)菌株DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase，加ddH20補(bǔ)足體積至25yL。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性4min;94。C變性50s，55。C退火50s，72。C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72。C再延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.5iiL的10Xloadingbuffer于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用1XTAE作為電泳緩沖液，100V下電泳40分鐘，經(jīng)EB染色后在紫外凝膠透射儀下觀察結(jié)果，如圖l所示。結(jié)果表明，陰性對(duì)照H20未出現(xiàn)條帶，不同菌絲融合群的菌株均能產(chǎn)生單一的擴(kuò)增條帶，目的片段大小為700bp。實(shí)施例4不同菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS-5.8SrDNA序列的克隆及測(cè)序?qū)⑸鲜龈鱾€(gè)菌絲融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS-5.8SrDNA序列擴(kuò)增的700bp產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切割目的條帶，使用大連寶生物公司的DNA回收試劑盒分別對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，按《分子克隆》GaCl2方法制備感受態(tài)細(xì)胞(Jos印hSambrook，2001)，將純化產(chǎn)物連接到pMD18-TVector載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a中，用預(yù)先涂有X-gal和IPTG的氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆子，堿法提取克隆質(zhì)粒DNA，再用pMD18-TVector兩端通用引物M13F和M13R在自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，用ClusterX軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，人工刪除載體序列和引物序列，得到立枯絲核菌不同融合群菌株Rl(SEQNo.11)、R2(SEQNo.12)、R3(SEQNo.13)、R4(SEQNo.14)、R5(SEQNo.15)、R6(SEQNo.16)、R7(SEQNo.17)或R8(SEQNo.18)的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列。菌絲融合群AG-1IA標(biāo)準(zhǔn)菌株Rl的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.11所示，全序列包括了3'端18SrDNA小亞基的部分核苷酸序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列(18S與5.8S之間)、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列(5.8S與28S之間)、以及5'端28SrDNA大亞基的部分序列；菌絲融合群AG-1IB標(biāo)準(zhǔn)菌株R2的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.12所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-2-l標(biāo)準(zhǔn)菌株R3的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.13所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-4標(biāo)準(zhǔn)菌株R4的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.14所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-5標(biāo)準(zhǔn)菌株R5的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.15所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-6標(biāo)準(zhǔn)菌株R6的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.16所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-8標(biāo)準(zhǔn)菌株R7的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.17所示，全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列；菌絲融合群AG-BI標(biāo)準(zhǔn)菌株R8的ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如SEQNo.18所示；全序列包括了18SrDNA的部分序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1的序列、5.8SrDNA基因序列、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2的序列、以及28SrDNA的部分序列。實(shí)施例5水稻紋枯病菌融合群判定的特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)不同融合群AG-lIA、AG-lIB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI的標(biāo)準(zhǔn)菌株R1R8的ITS-5.8SrDNA序列分析的比對(duì)結(jié)果，分別構(gòu)建了不同菌絲融合群菌株的特異性引物WG3(SEQNo.3)、WG4(SEQNo.4)、WG5(SEQNo.5)、WG6(SEQNo.6)、WG7(SEQNo.7)、WG8(SEQNo.8)、WG9(SEQNo.9)和WG10(SEQNo.10)，如表2所示，作為水稻紋枯病菌融合群判定的特異性引物。表2不同融合群菌株的特異性引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例6水稻紋枯病菌融合群判定的雙重PCR檢測(cè)以提取的水稻紋枯病菌總基因組DNA為模板，鑒別不同菌絲融合群菌株AG-1IA、AG-1IB、AG-2-l、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8或AG-BI特異性引物WG3WG10為引物，分別進(jìn)行水稻紋枯病菌融合群判定的雙重PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系25iiL總體積中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM特異性鑒別引物(WG3或WG4或WG5或WG6或WG7或WG8或WG9或WG10)，10iiM引物ITS1，10iiM弓|物ITS4，水稻紋枯病菌DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,加ddH20補(bǔ)足體積至25iiL。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性4min;94t:變性50s，55t:退火50s，72"延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72t:再延伸10min，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物中加入2.5yL的10Xloadingbuffer于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用1XTAE作為電泳緩沖液，100V下電泳40分鐘，經(jīng)EB染色后在紫外凝膠透射儀下觀察結(jié)果。從圖2可以看出，當(dāng)以WG3和ITS1和ITS4為引物時(shí)，從PCR產(chǎn)物中可以檢測(cè)到500bp和700bp兩條特異性片段；而以其它特異性引物為引物時(shí)，只可以檢測(cè)到700bp的單條帶，而沒有擴(kuò)增出500bp的特異性片段，也沒有其它的額外片段。說明500bp的DNA片段是該水稻紋枯病菌的特異性片段，是融合群AG-1IA的標(biāo)準(zhǔn)菌株R1的特異性鑒別引物WG3和通用引物ITS4共同擴(kuò)增的結(jié)果。結(jié)果表明，該水稻紋枯病菌屬于AG-1IA菌絲融合群。序列表〈110〉中國水稻研究所〈120〉水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法〈130>1〈160>18〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>19〈212>DNA〈213>通用引物ITS1〈400>1tccgtaggtgaacctgcgg19〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213>通用引物ITS4〈400>2tcctccgcttattgatatgc20〈210>3〈211>21〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-1IA標(biāo)準(zhǔn)菌株Rl的特異性鑒別引物WG3〈400>3agttggtggatttaattccat21〈210>4〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-1IB標(biāo)準(zhǔn)菌株R2的特異性鑒別引物WG4〈400>4tcaaggtcctttggggttg19〈210>5〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-2-1標(biāo)準(zhǔn)菌株R3的特異性鑒別引物WG5〈400>5atggggaatttacttgttg19〈210>6〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-4標(biāo)準(zhǔn)菌株R4的特異性鑒別引物WG6〈400>6atgttttgtgggggggaag19[O川]〈210>7〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-5標(biāo)準(zhǔn)菌株R5的特異性鑒別引物WG7〈400>7atggggaatttattgattg19〈210>8〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-6標(biāo)準(zhǔn)菌株R6的特異性鑒別引物WG8〈400>8aagtgggacttttaattta19〈210>9〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-8標(biāo)準(zhǔn)菌株R7的特異性鑒別引物WG9〈400>9atgggggaatttattcatt19〈210>10〈211>19〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-BI標(biāo)準(zhǔn)菌株R8的特異性鑒別引物WG10〈400〉10acggggg腿tttttattt19〈210〉11〈211〉618〈212〉DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-IIA標(biāo)準(zhǔn)菌株Rl的ITS-5.8SrDNA序列〈400〉11tgagttgttgctggccttttctecctteatttggc郷agggggratgtg60cacaccttctctttcatccatcaraccccctgtgcacttgategttggtg120gattteattccatccatttgctgtctecttcactctectt180gatgteacgcatcteatectaagtttcaacaacggatctcttggctctcg240catcgatg^g皿cgcagcga^tgcgateagteatgtgaattgcag^ttcagtgaatc300atcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagratgcctgtttgagt360atcatga^tcttcaaagteaaccttttgtggtcttttttactttggttt420tettgcagcttcacacctgctcctctttgtgcattegctggatctcagtg■ttetgcttggttccactcggcgtgateagttetctetcgctgaggacacccgtea朋朋g540gtggc咖ggte皿tgc3gatgaaccgcttcteategtccattgacttggacaatettct600attttetgatctgatctc618〈210〉12〈211〉624〈212〉DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-1IB標(biāo)準(zhǔn)菌株R2的ITS-5.8SrDNA序列〈400〉12tgagttgtegctggcctttttgtgcacactcttctctttc60ccctgtgcacttgtgagacagtcaaggtcctttggggttggggggc卿g120ctttettgcaaaaccctttttccccttttgcctttgctgtctectcaatttetecacact180tgteattgatgteacgcatcteatecteagtttcaacaac240ggatctcttggctctcgcatcgatg皿g皿CgC3gCg皿3tgcgateagt朋tgtg朋tt300gtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttgg360agcatgcctgtttgagtetcatgaaatcttcttttgtteattcaatcggg420tctcttgctttggtettggaggtctttgcacctgctcctcttgttcattegctggatctc■agtgttetgcttggttccactcggcgtgataagttetctetcgctg郷acaccgte朋3540皿gtggcc皿ggte皿tgcagacg皿ccgcttcteategtccattgacttggac朋ttea600atttttetgatctgatctca皿tc624〈210〉13〈211〉619〈212〉DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-2-1標(biāo)準(zhǔn)菌株R3的ITS-5.8SrDNA序列〈400>13朋tg朋gagtttggttgtegctggcccattcatttgggcatgtgcacacctttctctttc603tCCC3C3C3cacctgtgaacctgtgagatC卿tgggg3atttecttgttgctttttgg120朋teca朋ggc皿teggttettggaccctctgtctectcaactcaattte180tttteaaacg皿tgteatggtctcatecteagtttcaacaacggatctct240tggctctcgc3tcgatg皿g皿CgC3gCg3皿tgcgateagteatgtg皿ttgcagaatt300C3gtg朋tC3tcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcatgcc360tgtttgagtetcatgaattcatcttttgttaactcaattggtttcacttt420ggtettggaggtcttttgcagcttcacacctgctcctctttgttcattegctggatctca■gtgttetgcttggttccactcggcgtgateaattetctetcgctgaggac3ctgtea皿g540gtggccaaggte皿tgc3gatgaaccgcttcteategtccattgacttggacaatecctt600tetgatctgatctcaaatc619〈210>14〈211>631〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-4標(biāo)準(zhǔn)菌株R4的ITS-5.8SrDNA序列〈400>14朋tgtegagtttggttgtegctggctccteatteaacttgggggratgtgcacacctttc60tctttcatcctgtgcacctggttttgtggggggg皿gg皿120ctttettggaccttctectcccccttgacttctgtctectteattcatet180cggatgteatggatgteac3catcteatecteagtttcaacaacggatct240cttggctctc3g皿CgC3gCg皿atgcgat皿gteatgtg朋ttgcag朋300ttcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcatg360cctgtttgagtcttcaaagtcaaaccttttgtteattcaattggttctgc420tttggtettggaggattettgcagcttcacacctgctcctctttgtgcattegctggatc■tcagtgttetgcttggttccactcagcgtgateagttetctetcgctgaggacaccctgt540te朋朋ggggtggc咖ggtgaaccgcttcteategtccattgacttgga600tttetgatctgatctcaaatc631〈210〉15〈211〉608〈212〉DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-5標(biāo)準(zhǔn)菌株R5的ITS-5.8SrDNA序列〈400〉15皿tg郷ggatetttggttgtegctggctcatcaatttgggcatgtgcacacctetctct60ttcatccacacacacctgtgcacttgtgaggc卿tggggttgtttttte120gtgctggaccctctgtctecaactcaattt3tttega朋t180g皿tgteatggatgteacgcatcteatectaagtttcaacaacggatctcttggctctcg240g皿cgcagcg皿atgcgate3gteatgtgatcagtgaatc300atcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagratgcctgtttgagt3603tC3tg3朋tcttcaaagteaatcttttgtteactcaattggttctectttggtettgga420ggtctttgcagcttcacacctgctcctctttgttcattegctggatctcagtgttetgct■tggttccactcagcgtgateagttetctetcgctgaggacactgtecaggtggcc皿ggg5403朋tgC3g3tgaaccgcttcteategtccattgacttggacactetttttatgatctgat600ctcaaatc608〈210>16〈211>535〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-6標(biāo)準(zhǔn)菌株R6的ITS-5.8SrDNA序列〈400>16朋tgtegagttggttgtegctggcctgatttteatetctgcaccttctct60ttcatccacacacacctgtgcacctgtgag3C3g皿gtgggactttteat120tgaaccctctgtctectcaactcaatttetcttea^tgaatgteactgg180atgteacgcatcteatecteagtttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatg^g240朋CgC3gCg3朋tgcgateagteatgtg皿ttgcagaatttcgaatcttt300gaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcatgcctgtttgagtetcatgaaatc360ttc朋3gtgaaccttttgttaactcaattggttctgctttggtettggaggttettgcag420cttecacctgctcctctttgtecattegctggatctcagtgttetgcttggttccactca■ccgcttccaacagtccattcacttggac皿tectcttetgatctgatctc535〈210>17〈211>590〈212>DNA〈213〉菌絲融合群AG-8標(biāo)準(zhǔn)菌株R7的ITs-5.8srDNA序列〈400>17朋tg朋gagttggttgtegctggtccatteatttgggc皿tgtgcacacctcctctttca60tCC3C3C3C3cctgtgcacctgtg卿ragatggggg皿tttettcatttattggacccc120tctgtctectcaattcatetgatgteacac180atcteatectaagtttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatg^g皿cgcagcg2403朋tgcgateagteatgtgaattgcag^ttcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacc300ttgcgctccttggtettccttggagratgcctgtttgagtatcatga^tcttcaaagte360aatcttttgtteattcaattggttctectttggtettggaggtcttttgcagcttcacac420ctgctcctctttgtgcattegctggatctcagtgttetgcttggttccactcagcgtgat■tcgctgaggacactgte皿3agtggcc皿ggte皿tgcagatgaaccgct540tcteategtccattgacttggac皿tettettetgatctgatctcaaatc590〈210>18〈211>648〈212>DNA〈213〉水稻菌絲融合群AG-BI標(biāo)準(zhǔn)菌株R8的ITS-5.8SrDNA序列〈400>18ttggttgtegctggtccatt皿tttgggcaacgtgcacacctttctcttt60catccatecacacacctgtg皿cctgtgag3C卿Cggggttttgttcag120ateac^tgaatg皿gteatcgggaacccctctgtctectteatctcate180atg皿tgteatggatgteaccteagtttcaac^cggatc240tcttggctctcgcatcgatgcga^tgcgateagteatgt300tcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtettccttggagcat360gcctgtttgagtetcatg皿atcttcaaagteaatcttttgtteattcaaggtggtttca420ctttggtettggaggtcttgcagcttcacacctgctcctctttgtgtettagctggatct■cagtgttetgcggtggttccactcggcgtgateacttetcteccgctgaggacactcttt540ctttttttcctggc咖ggggaaccgcttc600caategtccattegcttggacaatetttttatgatctgatctcaaatc6481權(quán)利要求水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征包括以下步驟1)隸屬于不同菌絲融合群AG-1IA、AG-1IR、AG-2-1、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8和AG-BI的標(biāo)準(zhǔn)菌株，菌株代號(hào)分別為R1～R8，采用改良的CTAB法分別提取其基因組總DNA；2)設(shè)計(jì)能鑒別水稻紋枯病菌融合群類型的特異性引物以步驟1)得到的DNA為模板，以ITS1和ITS4為引物，分別進(jìn)行各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITS-5.8SrDNA序列的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后均得到700bp的目的條帶，經(jīng)序列測(cè)定后得到不同融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株的核苷酸序列，找到區(qū)分不同標(biāo)準(zhǔn)菌株的特異性堿基位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出鑒別不同融合群標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，ITS1核苷酸序列如SEQNo.1所示，ITS4核苷酸序列如SEQNo.2所示，菌絲融合群AG-1IA標(biāo)準(zhǔn)菌株R1的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.3所示，菌絲融合群AG-1IB標(biāo)準(zhǔn)菌株R2的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.4所示，菌絲融合群AG-2-1標(biāo)準(zhǔn)菌株R3的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.5所示，菌絲融合群AG-4標(biāo)準(zhǔn)菌株R4的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.6所示，菌絲融合群AG-5標(biāo)準(zhǔn)菌株R5的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.7所示，菌絲融合群AG-6標(biāo)準(zhǔn)菌株R6的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.8所示，菌絲融合群AG-8標(biāo)準(zhǔn)菌株R7的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.9所示，菌絲融合群AG-BI標(biāo)準(zhǔn)菌株R8的ITS-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序列如SEQNo.10所示；3)采集表現(xiàn)為水稻紋枯病癥狀的病株樣本，從感病組織中分離、純化水稻紋枯病菌；4)采用改良的CTAB法提取水稻紋枯病菌的基因組總DNA；5)水稻紋枯病菌融合群判定的雙重PCR鑒定用步驟4)得到的水稻紋枯病菌的DNA為PCR反應(yīng)模板，以步驟2)得到的不同的融合群的特異性鑒別引物作為水稻紋枯病菌融合群判定的特異性鑒別引物，同時(shí)加入通用引物ITS1和通用引物ITS1，分別進(jìn)行雙重PCR，若能同時(shí)擴(kuò)增出500bp和700bp的兩條特異性片段，即可判定該水稻紋枯病菌隸屬于對(duì)應(yīng)的菌絲融合群；若只能擴(kuò)增出700bp的片段，即判斷水稻紋枯病菌不屬于該菌絲融合群。2.如權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于步驟1)和4)中改良的CTAB法提取DNA的方法中步驟如下取O.2g菌絲，液氮研磨后加入800yLDNA提取液，65t:下水浴保溫30min，lOOOOg離心10min;取上清液用等體積的氯仿/異戊醇抽提，10000g離心10min;用氯仿/異戊醇抽提再抽提1次；上清液加入等體積的DNA沉淀液，充分混勻，10000g離心lOmin;棄上清，在沉淀中加入1MNaCl300yL，重新溶解，再加入等體積的氯仿/異戊醇抽提，lOOOOg離心lOmin;取上清液加入2.5倍體積的冷凍異丙醇，置-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序-5.8SrDNA序列的特異性鑒別引物，其核苷酸序于冰上30min沉淀DNA，4。C下lOOOOg離心10min，棄上清液，用70%的酒精清洗2次，抽干后加TE緩沖液充分溶解，即得到菌株的基因組總DNA。3.如權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于步驟2)中PCR反應(yīng)體系為25iiL總體積中含有l(wèi)OXTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10iiM引物ITSl，10iiM引物ITS4，標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組總DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,力口ddH20補(bǔ)足體積至25uL;PCR反應(yīng)條件為:94"C預(yù)變性4min;94。C變性50s，55。C退火50s，72。C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72t:再延伸10min。4.如權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于步驟5)中雙重PCR反應(yīng)體系為25iiL總體積中含有10XTaqreactionbuffer2.5iiL，25mMMgCl2，2.5mMdNTP，10yM特異性鑒別引物，10yM引物ITS1，10yM弓|物ITS4，水稻紋枯病菌DNAlOOng，O.5UTaqDNApolymerase,力口ddH20補(bǔ)足體積至25iiL;PCR反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性4min，94"C變性50s，55"C退火50s，72"C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72t:再延伸10min。5.如權(quán)利要求2所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于所述的DNA提取液為:lL溶液中含有20gCTAB、1.4MNaCl、100mMTris-HCl、20mMEDTA禾口lmlP-巰基乙醇，pH值為8.0。6.如權(quán)利要求2所述的水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，其特征在于所述的DNA沉淀液為1L溶液中含有10g、50mMTris-HCl禾P10mMEDTA，pH值為8.0。全文摘要水稻紋枯病菌融合群判定的鑒定方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。其包括對(duì)立枯絲核菌8個(gè)不同融合群菌株總DNA提取、PCR擴(kuò)增、rDNA-ITS序列測(cè)定、分析等過程的基礎(chǔ)上，找到了鑒別立枯絲核菌不同融合群菌株的堿基位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)出可鑒別不同融合群菌株的高特異性鑒別引物，與通用引物ITS4結(jié)合，同時(shí)增加通用引物ITS1，利用一步雙重PCR方法檢測(cè)，能得到特異性500bp片段和700bp的DNA片段，成功地進(jìn)行不同融合群菌株的高特異性PCR鑒別。該發(fā)明對(duì)為水稻立枯絲核菌的識(shí)別提供快速準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法，為制定立枯絲核菌引起的多種病害如紋枯病、立枯病等綜合治理決策提供理論參考。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101792795SQ200910156620公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者劉連盟,王玲,黃世文申請(qǐng)人:中國水稻研究所