專(zhuān)利名稱(chēng)：一種活性氮致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)皮細(xì)胞模型及其建立方法與應(yīng)用，特別涉及一種活性氮致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物篩選方法，以及基于該模型進(jìn)行相關(guān)藥物篩選的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
藥物篩選模型是尋找和發(fā)現(xiàn)好的有治療作用藥物的重要和必要條件?；谔禺惏悬c(diǎn)的分子和細(xì)胞水平的藥物篩選模型具有材料用量少，快速靈敏，藥物作用機(jī)制明確，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選等特點(diǎn)，是目前藥物初篩的主要模式。
過(guò)去的十幾年中，關(guān)于活性氮(*NO)對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的作用觀點(diǎn)很多，但普遍認(rèn)為其是一個(gè)具有多種生物活性和多面性的小分子物質(zhì)，對(duì)于維持內(nèi)皮細(xì)胞及血管的功能作用巨大。在病理?xiàng)l件下，活性氮一方面可以舒張血管，增加血流量，加速致病因子的清除，同時(shí)也可以維持微環(huán)境的氧化還原態(tài)的穩(wěn)定。但大量的活性氮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞是有損傷作用的，表現(xiàn)在可能引起細(xì)胞供能系統(tǒng)線粒體的損傷和活性氧(ROS)的大量釋放(Oxidative burst and NO generation asinitial response to ischemia in flow-adapted endothelial cells. Am J Physiol HeartCirc Physiol 280:H2126-2135; 2001.)?；钚缘突钚匝蹩煽焖俳Y(jié)合生成過(guò)氧亞硝酸陰離子(ONOCT)，其氧化能力是過(guò)氧化氫(H202)的約1000倍，可引起細(xì)胞不可逆的損傷，并最終走向凋亡(Walford， G. A.; Moussignac, R. L.; Scribner，A. W.; Loscalzo, J.; Leopold, J. A. Hypoxia potentiates nitric oxide-mediatedapoptosis in endothelial cells via peroxynitrite-induced activation ofmitochondria-dependent and -independent pathways. J Biol Chem 279:4425-4432;2004.)。建立一個(gè)活性氮損傷的內(nèi)皮細(xì)胞模型，可以為深入研究病理狀態(tài)下活性氮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，也可以通過(guò)該模型篩選出一些對(duì)活性氮的損害有保護(hù)作用的藥物。
但是由于活性氮是一個(gè)小分子不穩(wěn)定的物質(zhì)，其單獨(dú)存在的時(shí)間極短，若要建立相關(guān)細(xì)胞模型，就必須選擇適當(dāng)?shù)幕钚缘鳛樵炷Ｎ镔|(zhì)。而目前的研究中并沒(méi)有關(guān)于某種活性氮誘導(dǎo)物可以作為明確的活性氮來(lái)源，作用內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷的文獻(xiàn)報(bào)道，也沒(méi)有在體外研究病理?xiàng)l件下建立活性氮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損
傷模型，以及該模型在藥理學(xué)上應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種活性氮致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物篩選方法，是將外源性的活性氮誘導(dǎo)物質(zhì)加入到內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，活性氮自然產(chǎn)生，與活性氧結(jié)合并作用于內(nèi)皮細(xì)胞，引起相應(yīng)的包括線粒體損傷，凋亡早期
活性氧(ROS)的生成，蛋白酪氨酸硝基化(3-NT)及凋亡，得到活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型。以ROS， 3-NT產(chǎn)生，隨時(shí)間增加，細(xì)胞存活率明顯降低的確切特征性標(biāo)志作為造模成功的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。所述外源性的活性氮誘導(dǎo)物質(zhì)為s-亞硝酰谷胱甘肽(GSNO)， s-亞硝酰半胱氨酸(CSNO)和3-嗎啉-斯得酮亞胺(SIN隱1)。。
本發(fā)明提供的活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型，是經(jīng)過(guò)活性氮作用的體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，所述的內(nèi)皮細(xì)胞包括原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，牛冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，永生化人臍靜脈來(lái)源的EA.hy926細(xì)胞系及HUVEC細(xì)胞系的內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明提供的活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型在篩選具有抵抗活性氮損傷作用的心腦血管藥物中的應(yīng)用。
針對(duì)活性氮引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是ROS-3-NT-線粒體凋亡依賴(lài)性，可以作
為篩選具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不受活性氮損傷作用的藥物靶點(diǎn)。具體方法是通過(guò)將待測(cè)樣品加入活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型中，通過(guò)觀察相應(yīng)的ROS、 3-NT生成的情況，細(xì)胞的存活率篩選出對(duì)該損傷有保護(hù)作用的藥物。
本發(fā)明提供了外源性的活性氮誘導(dǎo)物質(zhì)來(lái)構(gòu)建活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞的藥物篩選方法，填補(bǔ)了這類(lèi)藥物篩選模型的空缺。針對(duì)這一內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的特征作為靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)藥物篩選開(kāi)發(fā)，避免了細(xì)胞整體水平篩選的盲目性，減少了工作量且藥物作用機(jī)制明確，具有直接，快速和簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模的心腦血管候選藥物篩選。
圖1為不同濃度的GSNO加入到EA.hy926細(xì)胞24、 48小時(shí)細(xì)胞存活率的MTT分析結(jié)果。
圖2為0.5mM GSNO加入到EA.hy926細(xì)胞不同時(shí)間ROS的生成量。圖3為0.5mM GSNO加入到EA.hy926細(xì)胞不同時(shí)間3-NT的生成量。圖4為不同藥物對(duì)于GSNO損傷的EA.hy926細(xì)胞模型中細(xì)胞存活率的 MTT分析結(jié)果。
圖5為不同藥物對(duì)于GSNO損傷的EA.hy926細(xì)胞模型中細(xì)胞3-NT生成 量的影響。
圖6為不同藥物對(duì)于SIN-1損傷的HUVEC細(xì)胞模型中細(xì)胞存活率的MTT 分析結(jié)果。
圖7為不同藥物對(duì)于SIN-1引起的HUVEC細(xì)胞模型中細(xì)胞3-NT生成量 的影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。 藥品與試劑
高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于GIBICO公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司， 活性氧清除劑Trolox、活性氮清除劑Hemoglobin、 3-NT抗體購(gòu)于sigma公司， 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純?cè)噭?br>
細(xì)胞
試驗(yàn)所使用的原代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞均購(gòu)于美 國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)條件5%C02， 37°C，高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基每 升含IOOU青霉素和100U鏈霉素；10°/。國(guó)產(chǎn)胎牛血清；37°C (5% C02， 95% 空氣)，飽和濕度，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右融合，用胰酶-EDTA液消化后進(jìn)行 傳代，傳代密度5xl04/ml隔2天傳代；凍存條件2ml凍存管，每管40萬(wàn) 細(xì)胞，含70。/。高糖DMEM， 20%國(guó)產(chǎn)胎牛血清，10%DMSO。
實(shí)施例1 GSNO作用于EA.hy926細(xì)胞制造活性氮損傷模型并用于藥物篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的EA.hy926細(xì)胞，加入適量胰蛋白酶-EDTA消化液，使貼壁 細(xì)胞脫落，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液 (5xl04/mL)，于96孔板中每孔加入100 |iL，在37。C、 5%(302培養(yǎng)2411。取 GSNO溶于無(wú)菌生理鹽水中配制成母液為100mmol/L的溶液，0.22pm濾膜過(guò) 濾除菌后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，使終濃度分別為0.1, 0.5， 1， 2mM。以溶 劑為陰性對(duì)照，放入培養(yǎng)箱于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24或48h。結(jié)束培養(yǎng)前4h 力口入MTT(5mg/mL， D-Hanks，溶解)10pL，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)吸去上清，加入150pL DMSO，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm處測(cè)定各孔OD值，記錄結(jié)果，取6孔 OD值求均值，計(jì)算抑制率抑制率(IR%) =(l-TOD/COD)xl00%。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)0.5mM-2mM濃度的GSNO作用24或48H都可以使EA.hy926 細(xì)胞存活率明顯降低。經(jīng)計(jì)算0.5mM的GSNO作用24h細(xì)胞存活率約為 72.33%; 0.5mM GSNO作用48h細(xì)胞存活率約為60.41%。為了簡(jiǎn)便快捷、節(jié) 省成本，選取GSNO0.5mM作用24小時(shí)作為造模條件。
考察GSNO作用下EA，hy926細(xì)胞ROS的生成情況，將細(xì)胞接種于96孔 板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)階段時(shí)加入終濃度為0.5mM的GSNO，同時(shí)設(shè)對(duì)照 組。培養(yǎng)l， 2， 4， 6， 8， 12h后，收集各組細(xì)胞，PBS離心洗滌1次，調(diào)整 細(xì)胞數(shù)至lxl06mL-l,加入ROS熒光染料H2-DCFDA染色30min， PBS清洗 2次后上流式細(xì)胞儀測(cè)定，然后分析熒光強(qiáng)度。檢測(cè)熒光越強(qiáng)表明ROS含量越 高，細(xì)胞損傷即伴隨ROS變化。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，0.5mM的GSNO作用 于內(nèi)皮細(xì)胞可引起時(shí)間依賴(lài)性的ROS增力口，其中4hROS相對(duì)于0h升高約1.5 倍；12h ROS相對(duì)于0h升高約2.5倍。
GSNO作用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的特異性標(biāo)志還包括使蛋白酪氨酸硝基化 (3-NT)增多，為檢測(cè)3-NT生成情況，將0.5mM的GSNO作用1， 2， 4， 6， 8， 12h后的各組培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，在1000 rpm下離心4 min。 去除培養(yǎng)液，用D-Hanks'液洗細(xì)胞兩次，最后轉(zhuǎn)移至effemdorf管中離心，棄 去D-Hanks'液。然后將離心后細(xì)胞團(tuán)儲(chǔ)存在-8(TC或直接進(jìn)行裂解。細(xì)胞裂解 時(shí)，向細(xì)胞團(tuán)中加入一定量的常規(guī)裂解液，立即吹打均勻。置于冰上，每隔IO min吹打20下。30 min后，在13000 rpm、 4。C下離心30 min，取上清液。蛋 白標(biāo)定后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白， 一抗為特異性抗3-NT抗體。曝 光后所得蛋白條帶定量分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，表明在活性氮GSNO的作用下，3-NT 的生成隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，于4h后達(dá)到一個(gè)較高水平，約相當(dāng)于0h的4 倍。
為了使用所建立的細(xì)胞模型進(jìn)行藥物篩選，選取了 l-8號(hào)樣品進(jìn)行細(xì)胞試 驗(yàn)，其中3號(hào)為已知的活性氧清除劑Trolox作陽(yáng)性對(duì)照，l號(hào)為不具有活性氧 和活性氮清除功能的物質(zhì)，為陰性對(duì)照。應(yīng)用了 0.5mM GSNO作用24小時(shí)的 EA.hy926細(xì)胞模型，結(jié)果參見(jiàn)圖4和圖5， 4#和5弁具有和3井類(lèi)似的作用， 可使細(xì)胞存活率增加同時(shí)降低3-NT的生成，具有抗活性氮損傷的作用。而2 #， 6弁，7弁，8弁樣品不具有此作用。在下一步實(shí)驗(yàn)中，可以只選取4弁和5 井樣品深入研究。
實(shí)施例2 SIN-1作用于HUVEC細(xì)胞制造活性氮損傷模型并用于藥物篩
選使用同實(shí)施例1類(lèi)似的方法，得到SIN-1作用于HUVEC細(xì)胞的活性氮損 傷模型。具體方法如下SIN-1溶于無(wú)菌生理鹽水中配制成母液為lmol/L的溶 液，0.22pm濾膜過(guò)濾除菌后，加入到HUVEC的細(xì)胞培養(yǎng)基中，使終濃度為 lmM。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)得到活性氮損傷模型。
選取6個(gè)樣品進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)，分別命名為9# 14#，待檢樣品均溶于培養(yǎng) 基中，其中9#樣品為不具有活性氧和活性氮清除功能的物質(zhì)，為陰性對(duì)照。 IO弁樣品為Hemoglobin是目前公認(rèn)的活性氮清除劑。結(jié)果如圖6和圖7所示， 可見(jiàn)陰性對(duì)照的9弁樣品不能增加細(xì)胞存活率，且不能減少3-NT的生成，陽(yáng) 性藥物10弁可以明顯增加細(xì)胞存活率，并減少3-NT的生成。11#和12#樣品 與10弁有類(lèi)似效應(yīng)，而13#和14弁無(wú)此功能。
權(quán)利要求
1.一種活性氮致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物篩選方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)將外源性的活性氮誘導(dǎo)物質(zhì)加入到內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，活性氮自然產(chǎn)生，與活性氧結(jié)合并作用于內(nèi)皮細(xì)胞，引起線粒體損傷，凋亡早期活性氧的生成，蛋白酪氨酸硝基化及凋亡，得到活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞模型，以凋亡早期活性氧，蛋白酪氨酸硝基化產(chǎn)生，細(xì)胞存活率明顯降低的確切特征性標(biāo)志作為建模評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)皮細(xì)胞模型，其特征在于所述外源性的活 性氮誘導(dǎo)物質(zhì)選自s-亞硝酰谷胱甘肽、s-亞硝酰半胱氨酸或3-嗎啉-斯得酮亞胺中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)皮細(xì)胞模型，其特征在于所述的內(nèi)皮細(xì)胞 選自原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、牛冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞或永生化人臍靜脈來(lái)源的EA.hy926細(xì)胞系及HUVEC細(xì) 胞系的內(nèi)皮細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活性氮致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物篩選方法在 篩選具有抵抗活性氮損傷作用的心腦血管藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種活性氮致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物篩選方法，通過(guò)采用外源性的活性氮誘導(dǎo)物，以一定的濃度加入到體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，作用一定時(shí)間，造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，建立一種活性氮損傷內(nèi)皮細(xì)胞的模型。利用該細(xì)胞模型，加入不同的藥物，通過(guò)觀察相應(yīng)的ROS、3-NT生成的情況，細(xì)胞的存活率作為靶點(diǎn)，體外篩選可減輕活性氮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物。本發(fā)明避免了細(xì)胞整體水平篩選的盲目性，減少了工作量且藥物作用機(jī)制明確，具有直接，快速和簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模的心腦血管候選藥物篩選。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101654698SQ200910152760
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者劉啟兵, 劉璐璐, 樓宜嘉, 峰 韓 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)