調(diào)節(jié)肺炎球菌莢膜多糖的生產(chǎn)的制作方法

專利名稱：：調(diào)節(jié)肺炎球菌莢膜多糖的生產(chǎn)的制作方法調(diào)節(jié)肺炎球菌莢膜多糖的生產(chǎn)本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2001年3月16日，申請(qǐng)?zhí)枮?1809654,9,發(fā)明名稱為"調(diào)節(jié)肺炎球菌莢膜多糖的生產(chǎn)"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本研究得到了美國(guó)政府資金的部分資助(美國(guó)公共衛(wèi)生服務(wù)授權(quán)編號(hào)AI38436和AI44231),因此，美國(guó)政府可以擁有本發(fā)明的部分權(quán)利。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明總體上涉及用鏈球菌生物生產(chǎn)莢膜多糖材料，并且涉及用所述材料生產(chǎn)疫苗。肺炎鏈球菌(有時(shí)候被稱為肺炎球菌)一般是寄居在人類(lèi)鼻咽的粘膜表面上的共生生物。當(dāng)宿主因素容許該生物進(jìn)入下呼吸道時(shí)，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎性反應(yīng)。引起一種密集的固結(jié)化，即肺泡空氣間隙中充滿了溢泌物，這種癥狀通常被稱為肺炎(Tuomanenetal.，1995)。肺炎球菌感染的最嚴(yán)重的表現(xiàn)是菌血癥，它可能并發(fā)膿毒癥、腦膜炎、或這兩者。在成年人體上，菌血癥通常是肺炎的并發(fā)癥(Razetal,,1997)。肺炎球菌抵抗將該生物從血液中清除的主要機(jī)制(即調(diào)理吞噬)的能力需要表達(dá)該生物的主要毒力因子，該因子是多糖莢膜(Averyetal.，1931;Watsonetal.，1990)。肺炎球菌能夠合成不少于90種的在結(jié)構(gòu)上獨(dú)特的莢膜多糖(CPSs)。肺炎球菌CPS具有抗吞噬特性，并且能抑制與宿主細(xì)胞的粘附。它是運(yùn)栽(即該生物從一個(gè)受感染的、但不一定有癥狀的個(gè)體傳播到另一個(gè)個(gè)體)以及有可能在疾病病理學(xué)的隨后方面的一個(gè)關(guān)鍵步驟(Ringetal.,1998)。在其他有莢膜的生物(例如，流感嗜血菌、腦膜炎萘瑟氏菌、釀膿鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌)上的類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，業(yè)已使人們理解了CPS的量為什么必須臨時(shí)改變，以便能夠?qū)崿F(xiàn)與宿主細(xì)胞的粘附性相互作用，以及對(duì)體液免疫力的抗性(Ha腿erschmidtetal.，1996;Levinetal.，1998;Schrageretal,,1996;Sellinetal.,1995;St.GemeIIIetal.,1991)。即使在同一種菌株內(nèi)，由肺炎鏈球菌所表達(dá)的CPS的量也不同。調(diào)節(jié)CPS表達(dá)的調(diào)控機(jī)制以前尚不完全了解。大多數(shù)肺炎球菌分離物能在至少兩種形式之間發(fā)生表型變化，這兩種形式可以通過(guò)菌落的不透明性進(jìn)行區(qū)分(Weiser,1998;Weiseretal.,1994)。不透明型(O)菌落與相同菌林的透明(T)變體在所合成的CPS的量方面不同，O-型的菌落通常能產(chǎn)生更大量的CPS(Kimetal.，1998)。由肺炎球菌變體所產(chǎn)生CPS量的相對(duì)小的差異，可能對(duì)毒力產(chǎn)生重要影響(MacLeodetal.,1950)'與T-型菌落相比，O-型菌落所產(chǎn)生的CPS的量高出1.2-5.6倍，這種提高與肺炎球菌細(xì)胞對(duì)免疫血清的調(diào)理吞噬提高了的抗性相關(guān)(Kimetal,，1999)。在系統(tǒng)感染的鼠類(lèi)模型上，只有若干種肺炎球菌菌株O變體能引起膿毒癥(Kimetal.,1998),相反，所迷T型能表達(dá)較大量的其他細(xì)胞表面多糖一一磷壁酸。肺炎球菌細(xì)胞壁磷壁酸與CPS共價(jià)連接，并且含有一種不常見(jiàn)的宿主樣成分-磷酸膽堿。這種多糖導(dǎo)致了肺炎球菌細(xì)胞通過(guò)血小板活化因子的受體與上皮細(xì)胞粘附(Cundelletal.,1995;Cundelletal.,1995;Kimetal.,1998)。T型還表現(xiàn)出包括CbpA在內(nèi)的細(xì)胞表面膽堿結(jié)合蛋白的改變了的分布，這種改變起著促進(jìn)粘附和寄居的作用(Rosenowetal,,1997),在由幼小的大鼠模型攜帶期間，選擇表現(xiàn)出T,而不是O表現(xiàn)型的肺炎球菌變體(Weiseretal.，1994)。以上觀察表明，肺炎球菌可以在具有更強(qiáng)的粘附和攜帶能力的形式(即T型)和更適合在入侵性感染型的非粘附形式(O型)之間變化。由肺炎球菌所表達(dá)的CPSs的鑒定構(gòu)成了血清分類(lèi)的基礎(chǔ)，這是一種用于區(qū)分肺炎鏈球菌變體的診斷方法。由于不同的變體可能具有不同的生理學(xué)特征(例如，對(duì)抗微生物制刑的易感性或肺炎發(fā)作或發(fā)展的特有速度)，區(qū)分肺炎球菌變體的能力在醫(yī)學(xué)上是有利的，另外，由于人類(lèi)(或其他脊推動(dòng)物)免疫系統(tǒng)識(shí)別并攻擊肺炎球菌變體的能力取決于它專一性識(shí)別各種變體的CPS的能力，獲得肺炎球菌變體專一性CPS的能力，能顯著影響用于緩解與肺炎球菌感染相關(guān)疾病的治療和預(yù)防方法以及組合物的開(kāi)發(fā)。例如，已知的肺炎球菌疫苗包括從多種肺炎球菌變體中獲得的CPS,仍然存在著對(duì)用于與肺炎球菌感染相關(guān)的疾病的診斷、預(yù)測(cè)、治療和預(yù)防組合物和方法的明顯的需求。很多上述組合物和方法包括、采用或依賴于對(duì)分離的肺炎球菌CPS的開(kāi)發(fā)?，F(xiàn)有用于從肺炎球菌中分離CPS的方法的特征通常是產(chǎn)量低。本發(fā)明包括改良可以從肺炎球菌變體中荻得的CPS產(chǎn)量的方法，和提高產(chǎn)量，以及與肺炎球菌相關(guān)的診斷預(yù)測(cè)、治療和預(yù)防組合物和方法的應(yīng)用。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及一種通過(guò)在一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持肺炎球菌，改良由該肺炎球菌產(chǎn)生莢膜多糖的方法.在一方面，其改進(jìn)在于包括保持一種具有亞大氣濃度的氧氣的氣體與所迷生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸(例如，氣氣濃度不超過(guò)大約16%或不超過(guò)大約0,1%)。所述肺炎球菌可以是鏈球菌屬的生物，如肺炎鏈球菌的生物(例如，肺炎鏈球菌變體6A、6B、18C和9V中的一種).在另一方面，其改進(jìn)在于包括維持一種具有超大氣濃度(例如，至少大約3%或10%)的二氧化碳的氣體與所迷生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸.在第三方面，其改進(jìn)在于包括保持一種具有超大氣濃度的二氣化碳和亞大氣濃度的氧氣的氣體與所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。在另一方面，其改進(jìn)在于包括將所迷生長(zhǎng)培養(yǎng)基的二氧化碳濃度保持在至少等于在相同溫度下用含有5%二氧化碳的氣體平衡的相同生長(zhǎng)培養(yǎng)基中二氧化碳的濃度，本發(fā)明還涉及一種緩解動(dòng)物體內(nèi)肺炎球菌感染的方法。該方法包括保持所述動(dòng)物(例如，至少是該動(dòng)物的肺)與一種具有超大氣濃度(例如，25%、50%或100%)的氧氣的氣體接觸。可以用該方法援解的感染的例子包括肺炎、菌血癥、膿毒癥、和腦膜炎。本發(fā)明還涉及一種制備用于給有發(fā)生肺炎球菌感染的危險(xiǎn)的動(dòng)物服用的免疫原性制劑的方法。該方法包括在其氧氣含量低于在相同溫度下用普通空氣平衡的相同培養(yǎng)基中的氧氣含量的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持肺炎球菌細(xì)胞，并從該細(xì)胞中分離由該細(xì)胞所產(chǎn)生的莢膜多糖.所述莢膜多糖構(gòu)成了所迷免疫原性制劑。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)肺炎球菌多糖的方法.該方法包括在其氧氣含量低于在相同溫度下用普通空氣平衡的相同培養(yǎng)基中的氣氣含量的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持肺炎球菌細(xì)胞，例如，基本上缺乏氧氣的培養(yǎng)基.在一種實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基的二氧化碳含量高于在相同溫度下用普通空氣平衡相同培養(yǎng)基中的二氣化碳含量，例如，由二氧化碳飽和的培養(yǎng)基或含有碳酸鹽或碳酸氫鹽的培養(yǎng)基。本發(fā)明包括一種評(píng)估測(cè)試化合物是否可用于援解動(dòng)物體內(nèi)的肺炎球菌感染的方法。該方法包括(a)在有所迷測(cè)試化合物的條件下維持的肺炎球菌細(xì)胞中CpsD的磷酸化程度，和(b)在沒(méi)有所述測(cè)試化合物的條件下維持的相同類(lèi)型細(xì)胞中CpsD的磷酸化程度。如果在有所迷測(cè)試化合物的條件下維持的細(xì)胞中的CpsD的磷酸化程度，低于在沒(méi)有所述測(cè)試化合物的條件下維持的所迷細(xì)胞中的CpsD的磷酸化程度的話，該測(cè)試化合物就可用于緩解所述感染.例如，CpsD的磷酸化程度可以通過(guò)測(cè)定存在于CpsD上的磷酸化酪氨酸殘基的數(shù)量或通過(guò)測(cè)定具有至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基的CpsD的比例進(jìn)行評(píng)估。圖1，包括圖1Ai-Avi和lBi-lBvi,它們是表明通iiQuellung反應(yīng)評(píng)估的環(huán)境氧和二氣化碳濃度對(duì)菌落形態(tài)影響的圖像。在37'C下，在大氣條件下(圖lAi,1Aiv，1Bi和lBvi)，在含有較高二氧化碳濃度的大氣條件下(圖lAii,lAv，1Bii和lBv)，在含有較高二氧化碳濃度的厭氧條件下(圖1Aiii，lAvi,1Biii和lBvi)，在補(bǔ)充了過(guò)氧化氛酶的T營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)6A型肺炎球菌分離物的不透明的(圖1Ai，lAii,1Aiii、1Bi、1Bii和1Biii)和透明的(圖1Aiv，lAv,1Avi、1Biv、1Bv和1Bvi)變體。在圖1Ai-lAvi中的照片上的菌落是通過(guò)偏振透射光照射觀察的，并且以放大56倍的形式顯示。圖1Bi-lBvi中的照片中的莢膜材料是通過(guò)Quellung反應(yīng)和類(lèi)型專一性抗血清觀察的，并且以放大4000倍的形式顯示。圖2,包括圖2A-2D，它是表示通過(guò)捕捉ELISA評(píng)估的環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度以及不透明性表現(xiàn)型對(duì)以每單位蛋白為基礎(chǔ)的CPS產(chǎn)量的影響的四聯(lián)棒圖。讓四種類(lèi)型肺炎球菌分離物(圖2Ai和2Aii中的變體6B;圖2Bi和2Bii中的變體6A;圖2Ci和2Cii中的變體18C;圖2Di和2Dii中的變體9V)的不透明的(圖2Ai、2Bi、2Ci和2Di)和透明的(圖2Aii、2BH、2Cii和2Dii)變體在曲線圖上面所標(biāo)明的氣氣和二氣化碳濃度下，生長(zhǎng)到中對(duì)數(shù)期(實(shí)心柱)或穩(wěn)定期(點(diǎn)劃線柱)。在超聲波處理的細(xì)胞沉淀和培養(yǎng)上清液(加斜線的柱)中測(cè)定CPS產(chǎn)量，并且以相對(duì)總細(xì)胞蛋白量的形式表達(dá)."*，，表示該變體在該條件下不生長(zhǎng).有關(guān)數(shù)值表示重復(fù)進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖3，包括圖3A和3B，它是表示在Western分析中環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度以及不透明性表現(xiàn)型對(duì)CpsD的酪氨酸磷酸化的影響的一對(duì)照片。在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)之后，除去肺炎球菌變體P303的O型(泳道1-4)和T型(泳道5-8)的全細(xì)胞裂解物，并調(diào)整到相等的密度，圖3A中的照片表示所述樣品中的蛋白，這些蛋白是通過(guò)SDS-PAGE分離的，轉(zhuǎn)移到一種膜上，并且用被稱為4G10的單克隆抗體進(jìn)行免疫吸印，這種抗體能專一性地結(jié)合磷酸化的酪氨酸。圖3B中的照片表示用抗完整肺炎球菌的抗血清進(jìn)行免疫吸印的復(fù)制的膜的照片，以便證實(shí)加樣量相等，相應(yīng)于裂解的細(xì)胞和加樣到各泳道中的生長(zhǎng)條件如下在泳道l和5中，小于1%氧氣/10°/。二氧化碳；在泳道2和6中，16%氧氣/3%二氧化碳；在泳道3和7中，21%氧氣/小于0.1%二氧化碳；而在泳道4和8中，19%氧氣/10%二氧化碳。圖3A中的箭頭表示25kDCpsD帶的位置.大小標(biāo)記物以千道爾頓為單位。圖4，表示通過(guò)Northern分析評(píng)估的環(huán)境氧氣和二氣化碳濃度以及不透明性表現(xiàn)型對(duì)CpsD的轉(zhuǎn)錄的影響的照片。在曱酰胺凝膠上分離從肺炎球菌變體P303的O型(泳道1和2)或T型(泳道3和4)中荻得的總RNA，并且用放射性標(biāo)記過(guò)的由血清型4肺炎球菌中荻得的CpsD的片段進(jìn)行檢測(cè)。在小于0.1%氣氣/10%二氣化碳(泳道1和3)或1%氣氣/小于0,1%二氧化碳(泳道2和4)的條件下生長(zhǎng)用于分離RNA的細(xì)菌。大小標(biāo)記物是以前道爾頓為單位的RNA標(biāo)準(zhǔn)物。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即由肺炎球菌所產(chǎn)生的莢膜多糖(CPS)的量可以通過(guò)控制用于維持該細(xì)菌的培養(yǎng)基中的氧氣和二氣化碳含量來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌中的CPS產(chǎn)量是由CpsD蛋白的存在以及該蛋白的翻譯后修飾調(diào)控的.基于上迷發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明包括用于調(diào)節(jié)肺炎球菌的CPS產(chǎn)量的方法(例如，用于生產(chǎn)抗肺炎球菌疫苗和其他免疫原性制刑)，用于緩解肺炎球菌感染的方法，以及鑒定可用于緩解肺炎球菌感染的制劑的方法。定義在本文中，下面的每一個(gè)術(shù)語(yǔ)具有在本節(jié)與它相關(guān)的含義.本文所使用的冠詞"一個(gè)"("a""an")表示一個(gè)或一個(gè)以上(即至少一個(gè))該冠詞的語(yǔ)法賓語(yǔ)。舉例來(lái)說(shuō)，"一個(gè)因子"表示一個(gè)因子或一個(gè)以上因子。"普通"空氣表示在特定部位大體上具有大氣的平均含量的氣體，不考慮濕度(即以干重為基礎(chǔ))。大氣的平均含量為大約78%的氮?dú)猓?1%的氧氣，1%的氬氣，以及各自低于0.04%的二氣化碳、氫氣、氦氣、氖氣、氪氣和氙氣。說(shuō)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)，肺炎球菌莢膜多糖(CPS)的產(chǎn)量受該細(xì)胞環(huán)境中所存在的氧氣和二氣化碳的存在和濃度的影響。具體地講，CPS的產(chǎn)量隨著環(huán)境中氧氣含量的降低而提高；CPS的產(chǎn)量還會(huì)隨著環(huán)境中二氧化碳含量的提高而提高。盡管以上發(fā)現(xiàn)是利用肺炎鏈球菌的培養(yǎng)物作出的，還可將其應(yīng)用于具有類(lèi)似于諸如其他鏈球菌的(例如，無(wú)乳鏈球菌)的鏈球菌的生物的莢膜和莢膜基因特性的生物，應(yīng)用于諸如金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、約氏不動(dòng)桿菌的其他有莢膜的生物，以及具有與上迷一種或多種特性類(lèi)似的表現(xiàn)型、基因型或同時(shí)具有這兩者的生物，當(dāng)所迷生物是肺炎鏈球菌時(shí)，它可以是任何一種已知的或以后發(fā)現(xiàn)的它的變體，包括根據(jù)其CPS的性質(zhì)鑒定的變體，如變體6A、6B、18C和9V中的一種，以上發(fā)現(xiàn)可用于與任何已知的培養(yǎng)肺炎球菌的方法組合，或者與以后開(kāi)發(fā)的任何方法組合，以便提高(或者降低，如果需要的話)由所述方法所培養(yǎng)的肺炎球菌的CPS產(chǎn)量.本發(fā)明包括一種提髙通過(guò)按照已知方法培養(yǎng)肺炎球菌獲得的CPS的產(chǎn)量的方法.這種改良的方法包括降低在它里面或在它上面維持所迷肺炎球菌的培養(yǎng)基中的氣氣的含量，這種降低是相對(duì)在培養(yǎng)所述肺炎球菌期間正常情況下出現(xiàn)在該培養(yǎng)基中的氧氣含量而言。例如，通常是在明膠或半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)肺炎球菌，其中，保持該培養(yǎng)基與經(jīng)過(guò)過(guò)濾的(或以其他方式滅菌)的普通空氣接觸。通過(guò)降低與所述培養(yǎng)基保持接觸的氣體中的氣氣含量(以干重為基礎(chǔ))，可以提高肺炎球菌的CPS產(chǎn)量，氣氣含量降低的程度并不重要，不過(guò)，一般來(lái)說(shuō)，氧氣含量降低的越多，CPS的產(chǎn)量就提高的越多.所述氣體的氧氣含量?jī)?yōu)選低于16%,或者降低到使該氣體基本上成為厭氧的程度(例如，使它含有小于0.1%的氣氣)，使所迷氣體中氣氣含量降低的方式并不重要。將氣體中氧氣含量降低到低于普通空氣中氧氣含量程度的常見(jiàn)方法，包括用一種具有所需氣氣含量的氣體沖洗培養(yǎng)容器(至少在開(kāi)始進(jìn)行沖洗，或者間歇性沖洗、定期沖洗或連續(xù)沖洗)。例如，可以用含有大約71%氮?dú)狻?9%氧氣和10%二氣化碳的氣體混合物或者用含有95%氬氣和5%二氧化碳的氣體混合物沖洗培養(yǎng)容器.還可以通過(guò)提高與在它上面或里面維持的肺炎球菌的培養(yǎng)基接觸的氣體的二氧化碳含量提高肺炎球菌的CPS產(chǎn)量，所迷氣體二氧化碳提高的程度并不重要，不過(guò)，一般來(lái)說(shuō)，二氧化碳含量提高的越多，CPS的產(chǎn)量就提高的越多。所述氣體的二氧化碳含量?jī)?yōu)選至少為大約5%，或至少為大約10%，不過(guò)，二氧化碳的濃度還可以高到使培養(yǎng)基被二氧化碳飽和的程度。如上文所述，理想的二氧化碳含量可以通過(guò)用具有所需二氧化碳含量的氣體沖洗用來(lái)培養(yǎng)所迷肺炎球菌的容器而獲得。另外，還可以通過(guò)將碳酸鹽或碳酸氫鹽摻入培養(yǎng)基中或者將所述鹽添加到培養(yǎng)基中為所述培養(yǎng)基提供二氧化碳。本發(fā)明包括通過(guò)提高用于維持肺炎球菌的培養(yǎng)基中的二氣化碳含量、提高與所述培養(yǎng)基接觸的氣體的二氧化碳含量、降低所述培養(yǎng)基的氧氣含量、降低與所迷培養(yǎng)基接觸的氣體的氧氣含量、或這些措施的任意組合來(lái)提高肺炎球菌的CPS產(chǎn)量，在一種實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基(或與該培養(yǎng)基接觸的氣體的)的氧氣/二氣化碳含量可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便能夠在一個(gè)時(shí)期提高肺炎球菌細(xì)胞的產(chǎn)量，然后可以再次調(diào)節(jié)，以便提高在第二個(gè)時(shí)期中的CPS產(chǎn)量。降低與所迷培養(yǎng)基接觸的氣體中的氧氣含量會(huì)導(dǎo)致在它上面或里面維持肺炎球菌的培養(yǎng)基的氧氣含量，這是因?yàn)槿芙獾暮头侨芙獾臍怏w的平衡作用。改變氣體的二氣化碳含量具有類(lèi)似的作用。所述氣體溶解在培養(yǎng)基中以及非溶解氣體平衡的速度，取決于本領(lǐng)域已知的多種因素，例如，包括培養(yǎng)基-氣體界面的面積，培養(yǎng)基的粘度，以及培養(yǎng)基的攪動(dòng)程度?？梢栽谂囵B(yǎng)基(例如，液體培養(yǎng)基)中維持肺炎球菌，其中，培養(yǎng)基和任何氣相之間的界面(如果有的話)是最小化的。在這種培養(yǎng)系統(tǒng)中，改變氣相的合量可能對(duì)液體培養(yǎng)基的氣體含量產(chǎn)生相對(duì)較小的影響，因?yàn)橹挥杏邢薜臍怏w從所迷氣相中擴(kuò)散到液體中.在所述系統(tǒng)中，所迷液體培養(yǎng)基的氣體含量可以受到用于制備該培養(yǎng)基的方法的影響.例如，通過(guò)以下方法可以制備大體上為厭氧的液體培養(yǎng)基制備液體培養(yǎng)基，在高壓滅菌器中滅菌(高壓滅菌器中的熱量可以排除液體中的幾乎所有的氣氣)，并且在沒(méi)有氧氣的環(huán)境中冷卻高壓滅菌的培養(yǎng)基，如在有穩(wěn)定的、不含氣氣的氣流通過(guò)的密封容器中冷卻。合適的不含氧氣的氣體的例子包括純氬氣，與5-10%二氧化碳混合的氬氣，純的氮?dú)?，或氮?dú)狻鍤夂投趸嫉哪撤N組合。在需要很高程度的厭氧條件時(shí)([氧氣]<<0.1%-，利用本領(lǐng)域已知方法，讓通過(guò)加熱的銅線圏或?yàn)V網(wǎng)或從它上面經(jīng)過(guò)的不含氧氣的氣體從冷卻中的培養(yǎng)基上通過(guò)。當(dāng)然，可以用類(lèi)似方法制備具有需要的氣體含量的固體、凝膠和半固體培養(yǎng)基，還可以通過(guò)選擇合適的肺炎球菌變體并將其制成用于接種其氣氣含量、二氧化碳含量或這兩種含量受到調(diào)控的培養(yǎng)基的接種物，來(lái)提高CPS產(chǎn)量?？梢岳斫獾氖?，肺炎球菌的不同變體可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上不同的CPS。本文所披露的方法可用于利用任何肺炎球菌變體提高CPS產(chǎn)量.還應(yīng)當(dāng)理解的是，很多肺炎球菌至少具有兩種表現(xiàn)形式。這些形式可以包括不透明型(O)和透明型(T)，其中，不透明型的特征通常是能產(chǎn)生更大數(shù)量的CPS。因此，通過(guò)篩選以更大的CPS產(chǎn)量為特征的肺炎球菌變體作為接種物可以進(jìn)一步提高CPS產(chǎn)量。利用本文所披露的一種或多種方法所生產(chǎn)的CPS可以用于(單獨(dú)或者與其他類(lèi)型的肺炎球菌的CPS組合)通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備肺炎球菌疫苗和其他免疫原性制劑。所述方法通常包括從肺炎球菌細(xì)胞中分離CPS,選擇性地將其余的肺炎球菌細(xì)胞滅活，并且將所述CPS與一種可以藥用的栽體(以及選擇性的免疫學(xué)佐劑)組合.所述制劑可以給動(dòng)物服用，以便增強(qiáng)該動(dòng)物對(duì)肺炎球菌感染的免疫反應(yīng)，由于肺炎球菌CPS被認(rèn)為使得肺炎球菌能逃脫動(dòng)物(例如人)體內(nèi)的免疫防御，可以將抑制CPS生產(chǎn)的方法用于緩解動(dòng)物體內(nèi)的肺炎球菌感染?？梢杂眠@種方法緩解的肺炎球菌感染(以及由此產(chǎn)生的并發(fā)癥)包括肺炎(特別是肺炎球菌肺炎)、菌血癥、膿毒癥、腦膜炎細(xì)菌性心臟內(nèi)膜炎，鏈球菌滲出性咽炎，蜂窩織炎和內(nèi)臟潰瘍.業(yè)已發(fā)現(xiàn)，提高環(huán)境中的氧氣含量能降低肺炎球菌CPS產(chǎn)量，從而提高肺炎球菌對(duì)免疫系統(tǒng)的感染性'類(lèi)似的，業(yè)已發(fā)現(xiàn)降低環(huán)境中的二氧化碳含量，能降低肺炎球菌CPS產(chǎn)量。通過(guò)保持受所迷感染困擾的動(dòng)物與具有超大氣濃度的氣氣的氣體接觸可以緩解肺炎球菌感染及其副作用和并發(fā)癥。另外，可以相對(duì)感染部位的普通氧氣含量提高該感染部位{例如，與肺炎球菌相關(guān)的內(nèi)臟潰瘍)的氧氣含量(例如，通過(guò)向位于動(dòng)物體內(nèi)的感染部位直接提供純氧氣或滅菌過(guò)的空氣)。例如，當(dāng)所迷身體部位是肺(例如，具有肺炎球菌肺炎的肺)時(shí)，所述普通氣氣含量就是普通空氣的氧氣含量。例如，通過(guò)使用呼吸器或標(biāo)準(zhǔn)氧氣面罩給患者肺提供超大氣濃度的氧氣，可以緩解肺炎球菌性肺炎。還可以通過(guò)將動(dòng)物體內(nèi)的感染部位的二氣化碳含量降低到低于正常情況下出現(xiàn)在該感染部位的二氣化碳含量，并且優(yōu)選低于正常情況下出現(xiàn)在該身體部位的二氧化碳含量(即使在沒(méi)有肺炎球菌感染的情況下也是如此)，緩解肺炎球菌感染及其副作用和并發(fā)癥。降低除了肺以外的體內(nèi)部位的二氧化碳含量的方法，可能包括提供一個(gè)穿過(guò)通過(guò)、經(jīng)過(guò)該身體部位的無(wú)菌氣體流。當(dāng)感染部位是肺時(shí)，可以通過(guò)提高呼吸速度降低二氧化碳含量，呼吸速度的提高是患者的自愿行為或人工行為(例如，使用呼吸器或呼吸加快藥物).正如在實(shí)施例中更詳細(xì)地說(shuō)明的，肺炎球菌中CPS產(chǎn)量的提高與CpsD基因的低水平表達(dá)相關(guān)，并且與CpsD蛋白的低度磷酸化相關(guān).因此，CPS產(chǎn)量可以通過(guò)能增強(qiáng)CpsD表達(dá)、增加CpsD的磷酸化程度的制劑或這兩者來(lái)提高.相反，CPS產(chǎn)量可以通過(guò)能抑制或降低CpsD表達(dá)、抑制CpsD磷酸化、增強(qiáng)磷酸化CpsD的脫磷酸化或它們的某種組合的制劑而受到抑制。正如上文所披露的，與動(dòng)物感染相關(guān)的肺炎球菌中CPS產(chǎn)量的降低，能夠使得這種肺炎球菌更容易受到所述動(dòng)物免疫系統(tǒng)的攻擊。本發(fā)明包括評(píng)估一種測(cè)試化合物是否是肺炎球菌CPS生產(chǎn)的抑制劑的方法，以及評(píng)估一種測(cè)試化合物是否是肺炎球菌CPS生產(chǎn)的增強(qiáng)劑的方法。在上迷每一種方法中，在存在所述測(cè)試化合物的條件下，以及分別，但優(yōu)選在缺乏相同的測(cè)試化合物的條件下維持肺炎球菌細(xì)胞。可以通過(guò)測(cè)定在有和沒(méi)有所述測(cè)試化合物的條件下，由細(xì)胞所產(chǎn)生的CPS的量評(píng)估該測(cè)試化合物對(duì)CPS生產(chǎn)的直接影響.另外，評(píng)估了CpsD的表達(dá)水平(通過(guò)測(cè)定相應(yīng)的RNA或相應(yīng)的蛋白的產(chǎn)生評(píng)估)，或CpsD的磷酸化程度(通過(guò)測(cè)定存在于CpsD中的磷酸化酪氨酸殘基的數(shù)量或至少具有一個(gè)磷酸化酪氨酸殘基的CpsD的比例)，并按照上迷方法將它與CPS生產(chǎn)的抑制或增強(qiáng)相關(guān)聯(lián)。參考文獻(xiàn)本申請(qǐng)涉及到的參考文獻(xiàn)如下。Arrecubietaetal.,1995，Gene167:1-7Austrianetal.，1966,J.Bacteriol.92:1281-1284Auzatetal.,1999,Mol.Microbiol.34:1018-1028Averyetal.，1931，JExp.Med.54:73Averyetal.,1944,JExp.Med79:137-157Caparonetal.，1992，J.Bacteriol.174:5693-5701Chenetal.，1988,Gene164:155-164Cundelletal.'1995，Nature377:435-438Cundelletal.，1995，Infect.Immun.63:757-761GibsonCtal.，簡(jiǎn)，Infect.Immun.61:478-485Hammerschmidtetal.,1996,Mol.Microbiol.20:1211-1220Howden，1976,3.Clin.Pathol.29:50-53Iannellietal.,1999，3.Bacteriol.181:2652-2652Ilanetal.，1999,EMBO3.18:3241-3248Kimetal,，1998,3.Infect.Dis.177:368-377Kimetal.，1999,Infec.Immun.67:2327-2333Knechtetal,，1970,3.Exp.Mcd.132:475-487.Levinetal.，1998，Mol.Microbiol,30:209-219MacLeodetal.,1950，J.Exp.Med.92:1-9Modde,1978，Experimentia34:1285-1286Neufeld，1902，Z.Hyg.Infektionskr.40:54Razetal.，1997,Clin.Infect.Dis.24:1164-1168Ringetal.'1998,3.Clin.Invest..102:347-360Rosenowetal.，1997，Mol.Microbiol.25:819-829Salujaetal.，1995，Mol.Microbiol.16:215-227Schmgeretal.,1996,3.Clin.Invest.98:1954-1958Sellinetal.,1995,Microb.Pathogen.18:401-415StGememet1991,InfectImmun.59:1325-1333Stevensonetal.，1996,3.Bacteriol.178:4885-4893Thro叩etal.，2000，Mol.Microbiol.35:566-576Tomasz，1964,Bacteriol.Proc.64:29Tuornanenetal.,1995,NewEng.3.Med.332:1280-1284Vincentetal.，1999,3.Bacteriol.181:3472-3477Wanietal.,1996,Infect,Immun.64:3967-3974Watsonetal.，1990，Infect.Immun.58:3135-3138Weiser,1998,Microb.DrugResist,4:129-145Weiseretal.，1994，InfectImmun.62:2582-2589Weiseretal.,999，Infect.Immun.67:3690-3692Weyandetal.，2000,3.Biol.Chem.275:3192-3200實(shí)施例下面將結(jié)合以下實(shí)施例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。提供本實(shí)施例只是用于說(shuō)明目的的，并且，本發(fā)明不局限于本實(shí)施例，相反，本發(fā)明包括在閱讀本發(fā)明說(shuō)明書(shū)之后可以得出的所有變化.肺炎鏈沐菌的莢膜多糖表達(dá)的氯氣依賴性與CpsD的翻譯后修飾相羞本實(shí)施例所提供的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肺炎球菌之間透明度表現(xiàn)型的差異(即O型與T型)受環(huán)境氧氣濃度的影響，并且，諸如可能出現(xiàn)在肺炎球菌上的厭氧生長(zhǎng)條件，會(huì)影響O型肺炎球菌增強(qiáng)CPS表達(dá)的能力，并逃脫免疫清除。下面將介紹在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中所使用的材料和方法。細(xì)菌菡棘和生長(zhǎng)條件用于本研究中的肺炎鏈球菌菌抹如表l所示，并且包括以前公開(kāi)的臨床分離物P303(6A型)、P324(6B型)、P68(18C型)和P10(9V型)的O和T變體(Kimetal.,1998;Weiseretal.，1994).按公開(kāi)方法在37'C下，在不進(jìn)行搖動(dòng)的條件下，在非密封容器中，在半合成(C+Y培養(yǎng)基，pH8.0)或胰化大豆培養(yǎng)基中生長(zhǎng)細(xì)菌(Tomasz，1%4)'將液體培養(yǎng)液鋪平板到含有1%(w/v)瓊脂的胰化大豆瓊脂(TSA)平板上，在該平板上涂有5000單位的過(guò)氧化氯酶(購(gòu)自WorthingtonBiochemical,Freehord，NJ),在37'C下，在燭罐中培養(yǎng)接種過(guò)的培養(yǎng)基，除非另有說(shuō)明。按公開(kāi)方法，在顯微鏡和偏振透射光下確定該TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(Weiseretal.，1994)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>7對(duì)每一種菌林/突變體來(lái)說(shuō)，測(cè)定了在有氣條件下生長(zhǎng)的O表現(xiàn)型.有單一的25-2"7kD的帶的反應(yīng)性.卜'，表示具在通氣條件下，用二氧化碳培養(yǎng)箱控制環(huán)境二氧化碳濃度。厭氣生長(zhǎng)條件是按照生產(chǎn)商的說(shuō)明利用BBLGasPakiM系統(tǒng)獲得的(BectonDickinson,Cockeysville,MD)在某些實(shí)驗(yàn)中，在該系統(tǒng)中使用碳酸氬鈉成分，以便產(chǎn)生10%的二氣化碳?xì)怏w，而在其他實(shí)驗(yàn)中，不使用該成分。在收獲所迷細(xì)菌之后，測(cè)定生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，以便證實(shí)其pH沒(méi)有受到所述不同培養(yǎng)條件的影響.用類(lèi)似方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行分析。一共檢查了患有腦膜炎的502位患者，其中大約20%在細(xì)菌學(xué)上被證實(shí)為肺炎球菌性腦膜炎。從在臨床診斷中被推測(cè)為肺炎球菌性腦膜炎的患者體內(nèi)收集鼻咽洗漱液樣品，將該樣品馬上鋪平板到5%綿羊血瓊脂和含有5000個(gè)單位的過(guò)氣化氬酶的胰化大豆瓊脂上，并在含有5%二氧化碳的空氣環(huán)境中，在37'C下培養(yǎng)所述平板。與培養(yǎng)存在肺炎球菌的患者血液樣品的做法相同，將腦脊液(CSF)樣品同樣鋪平板到血液瓊脂和透明平板上，按照標(biāo)準(zhǔn)通氣培養(yǎng)方法培養(yǎng)48小時(shí)。首先通過(guò)格蘭氏染色和Quellung反應(yīng)證實(shí)在血液瓊脂上表現(xiàn)出典型的形態(tài)特征的分離物是肺炎球菌。所有分離物在-80'C下在細(xì)菌保存器中保存，并按本文所披露的方法測(cè)定菌落形態(tài)學(xué)。用Fisher'sExactTest檢查鼻咽和入侵部位培養(yǎng)物的T和0表現(xiàn)型比例之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。遺傳轉(zhuǎn)化按公開(kāi)方法使得膠囊化的和非膠嚢化的肺炎球菌成為天然轉(zhuǎn)化感受態(tài)(Weiseretal.,1999)。通過(guò)從含有紅霉素U微克/毫升)的培養(yǎng)基中篩選將雙成分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCSTSs)中的突變轉(zhuǎn)入菌株P(guān)303。篩選具有改變了的菌落形態(tài)的膠嚢化的轉(zhuǎn)化體，并且用類(lèi)型專一性抗血清(購(gòu)自StatensSeruminstitut，哥本哈根，丹麥)通過(guò)Quellung反應(yīng)證實(shí)CPS表達(dá).Quellung反應(yīng)觀察在各種條件下，在半合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到中對(duì)數(shù)期的細(xì)菌中的肺炎球菌莢膜。為了進(jìn)行Quellung反應(yīng)，按照公開(kāi)方法將等體積的培養(yǎng)物和含有6型抗血清和1%(w/v)購(gòu)自StatensSeruminstitut(哥本哈根，丹麥)的亞甲基蘭的組合物在玻璃栽玻片上混合1分鐘(Neufeld，1902)。CPS的定量讓0和T型肺炎球菌變體在半合成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到中對(duì)數(shù)期(A620-0.3)或生長(zhǎng)16小時(shí)(此時(shí)細(xì)胞處于穩(wěn)定期)。通過(guò)以2000xg的速度離心收集細(xì)胞，用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌，在O'C下超聲波處理3次，每次10秒，并在-20'C下保存。按公開(kāi)方法用捕捉ELISA技術(shù)測(cè)定存在于在特定條件下生長(zhǎng)的變體中的CPS的量(Kimetal.，1998)。類(lèi)型專一性兔抗血清(購(gòu)自StatensSeruminstitut,哥本哈根，丹麥)是以1:5000的稀釋比例用0.05摩爾碳酸鈉(pH9.6)稀釋之后使用的，并且在室溫下用一夜時(shí)間使其固定在微量滴定板的孔的壁上。在每一個(gè)培養(yǎng)步驟之間，用Tris緩沖液(含有l(wèi)OmMTds,150mM氯化鈉，0.05%BrijTM35，和o.02%(w/v)疊氮化鈉)洗滌5次.Brij35(聚氣乙烯(23)月桂基酯C12H25(OCH2CH2)23OH)是一種洗滌刑。在已知濃度下使用從6B、6A、i8C或9V型肺炎球菌中獲得的純化CPS,并且是從美國(guó)典型組織保藏所(Rockville，MD)購(gòu)買(mǎi)的，將其作為標(biāo)準(zhǔn)物。用被命名為HASP4(它能專一性結(jié)合6A和6B型CPSs)、HASP22(它能專一性結(jié)合18C型CPS)和HASP33(它能專一性結(jié)合9V型CPS)的單克隆抗體檢測(cè)超聲波處理過(guò)的細(xì)胞樣品中的CPS,所迷抗體是以在中試實(shí)驗(yàn)中確定的濃度使用的。用能與小鼠IgM專一性起反應(yīng)的并且與堿性磷酸酶結(jié)合的抗血清檢測(cè)單克隆抗體與CPS的結(jié)合.該制劑是按公開(kāi)方法使用的(Kim和Weiser,1998),利用微量二辛可酸試劑盒，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明(PierceChemicalCo,Rockford，IL)用超聲波處理過(guò)的細(xì)胞提取物進(jìn)行總細(xì)胞蛋白測(cè)定。上清液級(jí)份中的CPS的量取決于相應(yīng)的細(xì)胞超聲處理級(jí)份中的蛋白濃度(即為了以每單位蛋白為基礎(chǔ)統(tǒng)一CPS含量)業(yè)已披露了用于比較細(xì)胞超聲處理物中的總的磷壁酸的含量的捕捉ELISA方法(Kimetal.，1998)。所有實(shí)驗(yàn)都成雙地進(jìn)行，并且重復(fù)至少3次。結(jié)果以每一種總的細(xì)胞蛋白濃度的平均值形式表示。Western分析按上迷方法在添加了過(guò)氣化氫酶的胰化大豆瓊脂上生長(zhǎng)細(xì)菌。在37。C下，在特定條件下生長(zhǎng)16小時(shí)之后，用消毒的Dacron"^刷將細(xì)胞從培養(yǎng)基表面上取出，重新懸浮在PBS中，并且用PBS洗滌，以便將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)到A62o-0,5。在離心之后，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在Laemmli凝膠加樣緩沖液中，并且加熱到IOO'C,保持5分鐘。然后在12.5%(w/v)的聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)SDS-PAGE分離所述樣品，并按公開(kāi)方法轉(zhuǎn)移到Immobilon-PTM膜上(W"anietal.，1996)。用以l:2000的稀釋比例稀釋在TSBP緩沖液(Wanietal,，1996)中的4皮稱為4G10(UpstateBiotechnologyInc.,Waltham，MA)的單克隆抗體進(jìn)行免疫吸印，按公開(kāi)方法用與堿性磷酸酶結(jié)合的小鼠IgG抗血清檢測(cè)吸印的樣品與該抗體的反應(yīng)性(Kimetal.，1999)。通過(guò)用以前披露的抗完整肺炎球菌的抗血清(Wanietal.，1996)對(duì)復(fù)制的膜進(jìn)行免疫吸印，證實(shí)添加了大體上相等數(shù)量的細(xì)菌。Northern分析按公開(kāi)方法從在半合成培養(yǎng)基中，在大氣和厭氣條件下生長(zhǎng)到中對(duì)數(shù)期的菌林P303細(xì)胞的O和T變體中分離總RNA并進(jìn)行純化(Weyand等，2000)。在甲酰胺凝膠上分離RNA之后，對(duì)用浹化乙錠染色的RNA進(jìn)行照相，并將其圖像數(shù)字化，以便與RNA大小標(biāo)記物進(jìn)行比較。使用VacuGeneTMXL系統(tǒng)，按照生產(chǎn)商(PharmaciaLKBBiotechnology,Uppsala,Sweden)的說(shuō)明將所述DNA轉(zhuǎn)移到一種膜上。在65'C下，在含有0.5M磷酸鈉，pH7.2，1.5mMEDTA和7。/。(w/v)SDS的溶液中將所述膜預(yù)雜交15分鐘。探針是用cps4D基因的內(nèi)部片段制備的，并且用具有以下序列的引物通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。5，-CCGGAATTCGTACAAATATACAGTTGAGCGGAGATAAAC-3，(SEQIDNO:1)和5，-CGCGGATCCTGTTGCTGTTACCAAGATGGACG-3'(SEQIDNO:2)而基因組DNA獲自4型菌抹.該菌抹與基因組研究所用于進(jìn)行全基因組測(cè)序的菌林相同，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI消化所述PCR產(chǎn)物，然后克隆到在多接頭兩側(cè)具有轉(zhuǎn)錄終止子的栽體上，以便能夠克隆鏈球菌序列。該栽體是按照以下方法由pJDC9構(gòu)建的將pUK4K(Pharmacia,Uppsala,Sweden)的平端卡那霉素抗性框插入平端Clal位點(diǎn)，以便能夠在大腸桿菌中篩選該標(biāo)記(Chen和Morrison,1988)。將cps4D片段插入BamHI和EcoRI消化過(guò)的栽體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH5oc,總RNA是從在大氣和厭氧條件下，在胰化大豆培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到中對(duì)數(shù)期的菌抹P303的肺炎球菌的O和T變體中提取的。下面將披露在本實(shí)施例中提供的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.在人休中瞎選灰現(xiàn)型變體為了驗(yàn)證是否對(duì)栽體和人類(lèi)菌血癥中的不同肺炎球菌表現(xiàn)型進(jìn)行了選擇，從表現(xiàn)出膿毒癥癥狀的患者的鼻咽和血液中獲得相同血清類(lèi)型的成對(duì)的分離物。由于菌林與菌林之間在與不透明性無(wú)關(guān)的菌落形態(tài)學(xué)方面存在異質(zhì)性，必須獲得成對(duì)的分離物.一旦開(kāi)始抗生素治療，就不能從菌血癥患者的鼻咽中分離肺炎球菌。因此，鼻咽和血液的培養(yǎng)物基本上是同時(shí)獲得的。這種制約因素需要該研究在具有肺炎球菌菌血癥高發(fā)的地區(qū)進(jìn)行，以便可以獲得足夠數(shù)量的成對(duì)的分離物。從住在Blantyre、Malawi地區(qū)的19位成年患者體內(nèi)荻得血液和鼻咽分離物，并且只有在這些分離物隨后在用類(lèi)型專一性抗血清進(jìn)行Quellung反應(yīng)中證實(shí)為相同類(lèi)型的時(shí)候才被認(rèn)為是成對(duì)的分離物.大部分成對(duì)的分離物是l型的，在該地區(qū)的最常見(jiàn)的類(lèi)型如表II所示.檢測(cè)還證實(shí)了大多數(shù)患者的人類(lèi)免疫缺陷病毒感染成陽(yáng)性，這種感染被認(rèn)為是造成在這些患者中出現(xiàn)高的侵入性肺炎球菌疾病的原因.在19對(duì)分離物中，有17(89%)對(duì)在鼻咽中是T表現(xiàn)型的，而12(63%)對(duì)在血液中是O表現(xiàn)型的。有10對(duì)分離物在從兩種部位獲得的肺炎球菌的表現(xiàn)型方面不一致，都表現(xiàn)出在鼻咽中更像是T表現(xiàn)型(p〈0.00U。這證實(shí)了一般存在對(duì)表現(xiàn)型變體的選擇，由此導(dǎo)致了來(lái)自主要為T(mén)樣群體的更像是0樣表現(xiàn)型的血液在天然菌血癥感染的鼻咽中的存在.表II從人類(lèi)攜帶者和侵入性感染中獲得的不透明性表現(xiàn)型菌杉k表型患者數(shù)類(lèi)型(數(shù)量)HIV狀態(tài)鼻咽血液/CSF1+-N/A2TT71(4),4,18,19110021(2)1010T0T0101(4),4(2),6,12,15,22514注14/19侵入性分離物是從腦脊液中獲得，而不是從血液中獲得的.2N/A表示不存在的臨床癥狀.氮?dú)鈱?duì)CPS教音的彩響研究了在感染期間能促進(jìn)O變體篩選，并且在攜帶期間促進(jìn)T變體.篩逸的宿主和細(xì)菌因素。據(jù)推測(cè)，在固結(jié)肺中出現(xiàn)的較低的氣氣含量會(huì)促進(jìn)從T到O表現(xiàn)型的轉(zhuǎn)變，6A型臨床分離物P303在較低氧氣濃度下的生長(zhǎng)對(duì)T型向O型自動(dòng)轉(zhuǎn)變的速度沒(méi)有影響，不過(guò)，如圖1A所示，在厭氧條件下的生長(zhǎng)(存在較高濃度的二氧化碳)與向更大和更多類(lèi)粘蛋白菌落形態(tài)的轉(zhuǎn)變相關(guān)，這種現(xiàn)象對(duì)于0變體來(lái)說(shuō)特別明顯.由于具有O表現(xiàn)型的肺炎球菌所表達(dá)的CPS的量高于具有T表現(xiàn)型的肺炎球菌所表達(dá)的CPS的量。因此認(rèn)為，與O型相關(guān)的更大的菌落體積有可能是這種材料的產(chǎn)量增加所導(dǎo)致的(Kimetal.,1998),在初步研究中，通過(guò)Quellung反應(yīng)和6型抗血清觀察細(xì)菌菌落周?chē)腃PS的折射區(qū)，如圖1B所示。與相同表現(xiàn)型在有氣氣的條件下的生長(zhǎng)或T變體在包括缺乏氧氣在內(nèi)的任何實(shí)驗(yàn)過(guò)的條件下的生長(zhǎng)相比，在有10%二氧化碳的厭氧條件下生長(zhǎng)的O變體的該區(qū)更大.相反，當(dāng)所逸細(xì)菌是在大氣條件下培養(yǎng)的時(shí)，在T型肺炎球菌的菌落周?chē)鷻z測(cè)不到莢膜材料區(qū)。這一結(jié)果證實(shí)了O型合成較大數(shù)量CPS的能力，并且表明較低的氧氣含量、較高的二氧化碳含量，或者這兩者能夠促進(jìn)CPS產(chǎn)量的提高.利用為了測(cè)定CPS的量而開(kāi)發(fā)的一種方法定量測(cè)定環(huán)境氣氣和二氧化碳濃度的作用，并且表示在圖2中(Kimetal.，1998).用本文所披露的捕捉ELISA測(cè)定的每毫克總細(xì)胞蛋白的CPS量與菌落表面積相關(guān)，表面積相關(guān)，如表III所示。與T型生物相比，在中對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定期生長(zhǎng)的O型細(xì)菌表現(xiàn)出較大量的與細(xì)胞相關(guān)的CPS,與在大氣條件下培養(yǎng)的相同細(xì)胞中的CPS產(chǎn)量相比，O型6A變體在有10°/。二氣化碳的厭氣條件下的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致CPS的產(chǎn)量提高7.9倍.與在有10%二氧化碳的厭氧條件下生長(zhǎng)的T變體相比，O變體的CPS產(chǎn)量提高了29倍。利用從兩種不相關(guān)的臨床分離物獲得的O和T分離物獲得了類(lèi)似結(jié)果(即使用6B和18C型)。表m在<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>對(duì)于相同的6A型臨床分離物的O和T變體而言.4這些值是基于在生長(zhǎng)16小時(shí)之后所觀察到的菌落.這些值表示用3個(gè)單一的孔分離的菌落進(jìn)行的測(cè)定的平均值.3這些值是基于用Quellung反應(yīng)觀察到的莢膜材料計(jì)算的值，用于計(jì)算球形橢圓形的體積的公式為V-(丌/6)LW2.有關(guān)數(shù)值表示由兩個(gè)相應(yīng)的單細(xì)胞分裂的三種雙球菌形式測(cè)定的平均值."UD"表示莢膜材料區(qū)檢測(cè)不到.6這些值基于對(duì)在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到中對(duì)數(shù)期的生物的捕捉ELISA測(cè)定.有關(guān)數(shù)字是兩次獨(dú)立測(cè)定的平均值.在生長(zhǎng)到穩(wěn)定期之后，測(cè)定18C型肺炎球菌的培養(yǎng)上清液中的CPS產(chǎn)量。發(fā)現(xiàn)在O型變體的培養(yǎng)上清液中多糖的產(chǎn)量隨著氣氣濃度的降低以及二氧化碳濃度的提高而增加，這表明較高的CPS產(chǎn)量是因?yàn)樵谳^低的氧氣/較高的二氣化碳條件下細(xì)胞的CPS合成增加而導(dǎo)致的，而不是因?yàn)樵谳^高的氧氣/較低的二氧化碳條件下由細(xì)胞中釋放出的CPS減少所致。用9V型分離物確定CPS合成的增加是由于氣氣的減少所致還是由于二氧化碳的增加所致。與有10%二氧化碳以及存在氧氣的條件下生長(zhǎng)的相同的細(xì)胞相比，在有10%二氧化碳和在沒(méi)有氧氣的條件下生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的9V型細(xì)菌的CPS產(chǎn)量提高了12倍。這證實(shí)了氧氣含量，而不是二氣化碳含量是影響CPS產(chǎn)量程度的主要環(huán)境因素.與CdsD/CpsD改變相關(guān)的CPS產(chǎn)量的變4乜本研究下一階段的目的是了解氧氣影響CPS產(chǎn)量的機(jī)理.檢驗(yàn)了用于傳感并轉(zhuǎn)導(dǎo)氧氣含量/存在的雙成分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的作用。按公開(kāi)方法將以前披露的出現(xiàn)在3型分泌物基因組中的雙成分信號(hào)#導(dǎo)系統(tǒng)的12種標(biāo)記突變中的11種導(dǎo)入P!303(Throup等，2000)。制備了在響應(yīng)調(diào)節(jié)子同系物上具有突變的IO種結(jié)構(gòu)，以及在組氨酸激酶同系物上具有突變的7種結(jié)構(gòu)。對(duì)在P303中實(shí)驗(yàn)的這n種突變型同系物中的每一種來(lái)說(shuō)，在細(xì)胞在厭氧條件下生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中，用Quellung反應(yīng)測(cè)定時(shí)這些突變對(duì)菌落體積的增加或莢膜區(qū)的形成沒(méi)有影響。這一結(jié)果表明，氧氣的作用不可能是通過(guò)TCSTS介導(dǎo)的，不過(guò)，在肺炎球菌中的上述系統(tǒng)中的一種無(wú)法檢查，因?yàn)樵摶蛩坪跏潜匦杌?。然后，檢驗(yàn)已知是CPS表達(dá)所需要的基因座的的基因.由于在多種類(lèi)型的菌林中觀察到了氧氣對(duì)CPS量的影響，因此，在不同類(lèi)型之間保守的基因被認(rèn)為最有可能是候選基因。在莢膜基因座上的基因中，只有頭4個(gè)基因cpsA-D是不同類(lèi)型的肺炎球菌所共有的(Iannellietal.，1999),如表I所示，在大氣條件下生長(zhǎng)時(shí)，通過(guò)Quellung反應(yīng)測(cè)定了解到3型肺炎球菌能形成類(lèi)粘蛋白菌落并具有大的莢膜(Knechtetal.,1970)。與所有其他實(shí)驗(yàn)過(guò)的類(lèi)型的肺炎球菌不同，相對(duì)在大氣條件下培養(yǎng)時(shí)的體積而言，在厭氧條件下培養(yǎng)時(shí)，3型菌林沒(méi)有表現(xiàn)出菌落體積或莢膜的增加。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，確定了3型cpsA-D和其他類(lèi)型基因座之間的差別。編碼一種推測(cè)的轉(zhuǎn)錄弱化劑的cpsA的同系物和編碼一種具有未知功能的蛋白的cpsB出現(xiàn)在3型膠囊化基因座上(GenBank保藏號(hào)Z47210;Arrecubieta，1995)。血清型2肺炎球菌中編碼CpsC的基因在3型膠囊化基因座之間是高度保守的，不過(guò)，血清型3肺炎球菌中推測(cè)的CpsD在69號(hào)氨基酸之后截短了(截短了226個(gè)氡基酸)'CpsC和CpsD是肺炎球菌莢膜表達(dá)所需要的，并且它們都與在大腸桿菌中表達(dá)的一種蛋白(Wzc)同源，這種蛋白與鏈長(zhǎng)調(diào)控和被稱為colanic酸的細(xì)胞外多糖的輸出相關(guān)(Moronaetal.，1999;Stevensonetal.,1996).在大腸桿菌中，Wzc在酪氨酸殘基上發(fā)生可恢復(fù)的自發(fā)磷酸化(Vincentetal.,1999),將被稱為4G10的能專一性結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基的單克隆抗體用于Western分析，測(cè)定出現(xiàn)在肺炎球菌中的磷酸化的酪氨酸。在6A型分離物的全細(xì)胞裂解物中出現(xiàn)了大約為26kD的單一的帶，這是CpsD的推測(cè)的大小，同樣在用于本研究中的6B、18C和9V菌株的全細(xì)胞裂解物中出現(xiàn)了相同大小的單一的帶，但是，3型肺炎球菌中缺乏這條帶(它具有截短的CpsD)。以上發(fā)現(xiàn)證實(shí)，CpsD是可以在酪氨酸殘基上磷酸化的。通過(guò)比較菌林D39(—種非膠囊化的突變體)和R6x(—種具有跨越cps2A-H的7504個(gè)堿基對(duì)的缺失的菌株，其中，只有A-D是其他類(lèi)型所共有的；Iannellietal.，1999)，獲得了4G10是由具有磷酸化的酪氨酸殘基的CpsD識(shí)別的進(jìn)一步的證據(jù)。在某些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)用從(2型)D39親本菌株或三種菌林獲得的DNA轉(zhuǎn)化有關(guān)細(xì)菌糾正了R6x型肺炎球菌中的所迷突變，從而得到了具有2型D39遺傳背景的具有3型或2型莢膜的膠囊化的菌林。4G10不能與R6x和3型R6x轉(zhuǎn)化體起反應(yīng)，以及該抗體能夠與2型R6x轉(zhuǎn)化體起反應(yīng)的亊實(shí)，證實(shí)了與該帶相關(guān)的蛋白的表達(dá)需要所述膠囊化基因座上頭4個(gè)共有基因中的一個(gè)，并且需要完整拷貝的CpsD。根椐大小確定，4G10反應(yīng)性蛋白不可能是CpsA或B.在2型和3型CpsC之間，只有15個(gè)保守氨基酸的變化，其中沒(méi)有酪氨酸,在3型菌林中4G10反應(yīng)性蛋白的缺乏表明，4G10不是CpsC。因此，得出的結(jié)論是，在所述肺炎球菌中CPS蛋白包括可以磷酸化的酪氨酸殘基。檢驗(yàn)了在各種濃度的氧氣和二氣化碳下的生長(zhǎng)對(duì)CpsD的酪氨酸磷酸化的影響。將在各種濃度的氧氣和二氣化碳條件下生長(zhǎng)的被稱為P303的6A型肺炎球菌分離物的O和T型全細(xì)胞的裂解物調(diào)整到相同的密度，并且用磷酸酪氨酸專一性單克隆抗體4G10通過(guò)Western分析進(jìn)行檢驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。在有氣條件下生長(zhǎng)的O變體中檢測(cè)到了具有CpsD的預(yù)期大小的單一的帶。如圖3中的泳道2-4的結(jié)果所示，二氧化碳含量在低于0.1%到10%之間的變化所產(chǎn)生的影響沒(méi)有明顯差別.在實(shí)驗(yàn)過(guò)的所有條件下(氧氣<0.1%至21%，二氣化碳<0.1%至10%)，所迷抗體與T變體的細(xì)胞提取物的反應(yīng)都是微弱的.用其他菌株獲得了類(lèi)似結(jié)果.因此，所得出的結(jié)論是，CpsD的酪氨酸磷酸化受不透明性表現(xiàn)型的影響，并且需要在有氣氣的條件下生長(zhǎng)。酪氨酸磷酸化的差別可以影響CpsD的活性，并且導(dǎo)致了在有氧氣的條件下O型肺炎球菌中CPS表達(dá)的減弱.厭氣生長(zhǎng)的O或T型肺炎球菌都不能表達(dá)磷酸化的酪氨酸，不過(guò)，這兩種表現(xiàn)型形式在CPS生產(chǎn)的程度方面存在很大差別。通過(guò)Northern分析確定O和T變體之間的差別是否是由于CpsD轉(zhuǎn)錄水平的差別所導(dǎo)致的，以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示.從在大氣條件下或者在有10n/o二氧化碳的厭氧條件下生長(zhǎng)的肺炎球菌菌抹P303的0和T型中荻得總細(xì)胞RNA。用克隆的CpsD片段檢測(cè)所迷RNA。通過(guò)測(cè)定放射性標(biāo)記過(guò)的探針與mRNA上的CpsD的雜交并且將該測(cè)定值相對(duì)存在于雜交分析混合物中的RNA的總量進(jìn)行調(diào)整，確定了轉(zhuǎn)錄活性方面的定量差別。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氣氣濃度對(duì)CpsD轉(zhuǎn)錄的水平?jīng)]有明顯影響。不過(guò)，與O型細(xì)胞相比，T型細(xì)胞中CpsD的轉(zhuǎn)錄水平提高了3.4倍，因此，所得出的結(jié)論是，CpsD的轉(zhuǎn)錄調(diào)控決定肺炎球菌的不透明性表現(xiàn)型。不希望受任何特定操作理論的約束，相信CpsD控制CPS的產(chǎn)生。在CpsD的酪氨酸磷酸化程度方面出現(xiàn)的差別和在CPS產(chǎn)量方面的差別之間的相關(guān)性支持這種理論.據(jù)信CpsD起著酪氨酸激酶的作用，這是部分基于其氨基酸序列與大腸桿菌中的酪氨酸自發(fā)磷酸化酶的相似性，這種酶與鏈長(zhǎng)調(diào)控和細(xì)胞外多糖colanic酸的輸出相關(guān).Cps23FD與Wze在229個(gè)氨基酸中的188個(gè)上面具有30%的相同性和49%的相似性。血清型23f肺炎球菌的CpsD含有一種異常的羧基末端氨基酸序列(YGSYGNYNNYGKNKK;SEQIDNO:3),該序列含有包括酪氨酸殘基在內(nèi)的重復(fù)特征(YGX)4。與CpsD的其余部分相比，該羧基末端區(qū)在肺炎球菌變體之間表現(xiàn)出明顯更大的氨基酸序列雜合性.據(jù)信，肺炎球菌菌林之間CPS產(chǎn)量的波動(dòng)性是由于在這些菌抹之間該羧基末端部分的波動(dòng)性所致，這種序列波動(dòng)影響了該蛋白的磷酸化能力。業(yè)已鑒定了多種其他的細(xì)菌蛋白激酶，并且這些激酶同樣擁有具有富含酪氨酸的重復(fù)特征的C-末端(Ilanetal.，1999).不能產(chǎn)生在CpsD上具有突變的肺炎球菌菌林，同時(shí)保持該菌林生產(chǎn)CPS的能力這一事實(shí)是該基因在CPS和莢膜生產(chǎn)中的重要性的進(jìn)一步的證據(jù)。下面提供了根據(jù)菌落不透明性表現(xiàn)型和氧氣含量調(diào)控CPS生產(chǎn)的機(jī)制的模型，該模型包括CpsD的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和CpsD的翻譯后修飾.CpsD是一種負(fù)調(diào)控因子，它作用在參與肺炎球菌類(lèi)型專一性CPS生物合成的基因上.較弱的CpsD轉(zhuǎn)錄是導(dǎo)致在厭氧條件下O型肺炎球菌中CPS的表達(dá)量較高的原因。除了造成顯著水平的CPS表達(dá)調(diào)控的CpsD的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外，還涉及到第二種水平的調(diào)控，即在CpsD上的酪氨酸殘基的磷酸化或自發(fā)磷酸化。CpsD的磷酸化只影響O變體，并且需要在通氣條件下生長(zhǎng).只能在O變體中檢測(cè)到在一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基上磷酸化的CpsD的能力，可能是因?yàn)樵赥肺炎球菌中具有較高的磷酸酶活性。酪氨酸磷酸化增強(qiáng)了CpsD的負(fù)調(diào)控活性，因此，磷酸化的CpsD降低了在通氣條件下CPS的合成.結(jié)果，O變體在通氣條件下產(chǎn)生的CPS少于在厭氧生長(zhǎng)條件下產(chǎn)生的CPS.T型肺炎球菌中較低的CPS產(chǎn)量，即使是在沒(méi)有明顯的CpsD的酪氨酸磷酸化的情況下也是這樣，是因?yàn)門(mén)型肺炎球菌中CpsD表達(dá)的增強(qiáng)。以前業(yè)已披露的改進(jìn)在厭氧條件下的生長(zhǎng)的做法，亊實(shí)上可能是增強(qiáng)的CPS合成導(dǎo)致較大菌落體積的作用(Modde，1978)。在能表達(dá)表面多糖的很多其他細(xì)菌種中存在與Wzc具有更大相似性的CpsD的同系物，所述細(xì)菌種的例子包括無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、約氏不動(dòng)桿菌。由于莢膜及其大小是毒粒的關(guān)鍵決定因素，基于這種類(lèi)型基因/蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾來(lái)調(diào)控CPS量的能力，在促進(jìn)膠囊化的細(xì)菌在適應(yīng)寄居和感染的不同的要求方面的能力方面可能是重要的。在本文中所引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物的公開(kāi)內(nèi)容，以其全文形式收作本文參考。盡管業(yè)已結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，顯而易見(jiàn)的是，本領(lǐng)域其他技術(shù)人員在不超出本發(fā)明的實(shí)際構(gòu)思和范圍的前提下，可以提出本發(fā)明的其他實(shí)施方案和改變。所附權(quán)利要求書(shū)包括所有諸如此類(lèi)的實(shí)施方案和等同的變化。權(quán)利要求1.一種評(píng)估測(cè)試化合物是否可用于緩解動(dòng)物體內(nèi)的肺炎球菌感染的方法，該方法包括比較在有所述測(cè)試化合物的條件下維持的肺炎球菌細(xì)胞中CpsD的磷酸化程度，和在沒(méi)有所述測(cè)試化合物的條件下維持的相同類(lèi)型細(xì)胞中CpsD的磷酸化程度，其中，如果在有所述測(cè)試化合物的條件下維持的細(xì)胞中的CpsD的磷酸化程度，低于在沒(méi)有所述測(cè)試化合物的條件下維持的所述細(xì)胞中的CpsD的磷酸化程度的話，該測(cè)試化合物就可用于緩解所述感染。2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述CpsD的磷酸化程度可以通過(guò)測(cè)定存在于CpsD上的磷酸化酪氨酸殘基的數(shù)量進(jìn)行評(píng)估。3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述CpsD的磷酸化程度可以通過(guò)測(cè)定具有至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基的CpsD的比例進(jìn)行評(píng)估。全文摘要本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)肺炎球菌莢膜多糖的生產(chǎn)。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)諸如肺炎鏈球菌的肺炎球菌中莢膜多糖生產(chǎn)的方法。本發(fā)明還涉及緩解動(dòng)物體內(nèi)肺炎球菌感染的方法，以及鑒定能夠在動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)肺炎球菌感染的制劑。圖(1)包括圖1Ai-Avi和1Bi-1Bvi，它們是表明通過(guò)Quellung反應(yīng)評(píng)估的環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度對(duì)菌落形態(tài)影響的圖像。文檔編號(hào)C12N1/21GK101586143SQ20091015033公開(kāi)日2009年11月25日申請(qǐng)日期2001年3月16日優(yōu)先權(quán)日2000年3月16日發(fā)明者J·N·韋澤申請(qǐng)人:費(fèi)城兒童醫(yī)院