專利名稱：調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因htf1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及稻瘟病菌同源異型
盒/Z7F7基因敲除、功能互補(bǔ)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由稻瘟病菌Magwa/ oAe gn&a (Herbert) Barr(無性世代 i^yn'CM/an'flgn'犯a)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻上最重要的病害之-一，有 性世代是單倍體異宗配合的子囊菌。該菌能夠侵染50多種禾本科植物，包 括許多雜草以及重要的谷類作物如小麥、大麥、玉米等，也造成一定的經(jīng) 濟(jì)損失。由于該病害的重要性和對稻瘟病菌傳統(tǒng)、分子遺傳的可操作性， 它己成為研究植物病原真菌與寄主互作較為理想的模式系統(tǒng)之一。但由于 稻瘟病菌的致病性復(fù)雜，且易變異，高抗水稻品種大面積種植往往3-5年 便喪失抗病性。因此，開辟防治稻瘟病的新途徑，是目前稻瘟病的熱門課 題。其中較為一致的看法是采取持久性抗性策略，即在弄清侵染循環(huán)各環(huán) 節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，設(shè)法干擾或中斷其中某一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，使稻瘟病的流行速 率減低，達(dá)到防治病害的目的。
稻瘟病菌以分生孢子和菌絲在病稻草或病谷上越冬。第2年當(dāng)氣溫升 至2(TC左右時，若遇降雨，在草堆、草房等處越冬的病菌就能產(chǎn)生大量 分生孢子。這些分生孢子依靠氣流，通過空氣傳播，秧苗或成株葉片受侵 發(fā)病后，病斑上又產(chǎn)生大量孢子，繼續(xù)借風(fēng)雨傳播進(jìn)行再次侵染為害。在 實(shí)驗(yàn)室條件下， 一個典型的病斑在溫濕度適宜時，每天可產(chǎn)生2 000 6 000 個分生孢子，且可持續(xù)14天左右，因此，只要條件適宜，病菌可反復(fù)進(jìn)行 多次再侵染，以致病害迅速擴(kuò)展而流行?？梢?，孢子在病害侵染循環(huán)中起 著關(guān)鍵性作用，能否產(chǎn)生大量的孢子，孢子能否發(fā)揮正常功能，決定著病 害會不會流行。國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，孢子萌發(fā)液中存在著稻瘟病菌的致病 因子及有關(guān)物質(zhì)。Shi等用化學(xué)和插入突變技術(shù)獲得了幾個單基因產(chǎn)孢突 變體conl、 con2、 con3、 con4、 con5、 con6禾口con7。它們在產(chǎn) 包的不同階 段起作用，每個基因突變體都在產(chǎn)孢和孢子形態(tài)上有獨(dú)特的特征。還有其 它幾個基因在產(chǎn)孢方面也有相類似的表型，例如稻瘟菌PAK激酶Chml ，其敲除突變體的產(chǎn)孢量只有野生型的萬分之一。因此，有研究者認(rèn)為，通 過有目的地研制開發(fā)新型高特異性農(nóng)藥一對產(chǎn)孢基因的表達(dá)起干擾作用 的抗產(chǎn)孢物質(zhì)，將會是控制稻瘟病流行的強(qiáng)有力武器。
稻瘟病菌的侵染過程是一個涉及到復(fù)雜的細(xì)胞分化、信號傳導(dǎo)和極性 生長的過程。同源異型盒基因在真核生物個體發(fā)育及細(xì)胞分化的調(diào)控中起 重要作用。對于動物，同源異型盒基因在胚胎發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞 分化及腫瘤的發(fā)生等方面發(fā)揮著重要作用；對于植物，同源異型盒基因主 要具有調(diào)控胚發(fā)育、葉的發(fā)育、細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸及花的分化等功能；在 真菌中，有關(guān)同源異型盒基因的研究相對較少，但已有的研究表明，其參 與調(diào)控菌絲的線性生長、產(chǎn)孢、致病性及有性生殖。因此，對稻瘟病菌同
源異型盒基因/Z7F/蛋白的結(jié)構(gòu)功能研究，將有助于了解其個體發(fā)育及在 細(xì)胞分化中的作用，最終有助于闡明稻瘟病菌同源異型盒基因所作用的靶 標(biāo)DNA以及它們所調(diào)控的生物學(xué)功能之間內(nèi)在的聯(lián)系，同時也有助于制 定更加有效合理的稻瘟病治理策略和措施，為開展防治稻瘟病菌的基礎(chǔ)理 論研究與生產(chǎn)應(yīng)用研究奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
稻瘟病菌全基因組序列的測定已經(jīng)完成，為以功能基因組學(xué)方法從全 基因組水平研究其關(guān)鍵基因的功能奠定了基礎(chǔ)。目前，通過基因敲除和功 能互補(bǔ)相結(jié)合的方法，是鑒定基因功能最成熟的技術(shù)之一。這將為進(jìn)一步 明確靶點(diǎn)基因調(diào)控稻瘟病菌生長發(fā)育和侵染致病的內(nèi)在分子機(jī)制奠定基 礎(chǔ)，并為研制開發(fā)干擾該基因表達(dá)的特異性農(nóng)藥提供快速而準(zhǔn)確的幫助
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同 源異型盒基因//7F/，及其在減少自然界稻瘟病菌種群數(shù)量和設(shè)計(jì)農(nóng)藥分 子革巴點(diǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供稻瘟病菌同源異型盒基因//7^7，該基因直接調(diào)控分生孢 子的產(chǎn)生；該基因的核苷酸序列，為序列表中SEQID1所示的堿基序列； 該基因核苷酸序列所推演的氨基酸序列，為序列表中SEQ ID 2所示的氨 基酸序列。通過基因克隆，測序所得的序列與稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫 (www.broad.mit.edu /annotation /fungi/ magnaporthe grisea)中所公^ft"白勺//7F7序列(MGG_00184.6) —致。
調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因/Z7F/的鑒定方法，其 特征在于包括以下步驟(l)用同源重組的方法，將野生稻瘟菌株中的基
因片段SEQ ID1敲除，則表現(xiàn)為喪失產(chǎn)生分生孢子的能力，分生孢子梗 明顯增加；(2)采用人工構(gòu)建的互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化被敲除而缺失所述SEQID1 基因片段的稻瘟病菌菌株，則所得的互補(bǔ)菌株能產(chǎn)生分生孢子。
進(jìn)一步利用同源重組的方法，將野生稻瘟病菌菌株中的同源異型盒結(jié) 構(gòu)域的序列敲除，表現(xiàn)為和敲除整個基因片段SEQ ID1 —樣的表型。
本發(fā)明的調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因//7F7，其實(shí) 用價值之一在于可根據(jù)其功能域的結(jié)構(gòu)和功能，設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶 點(diǎn)。通過保守域分析，//7^7具備了所有同源異性盒蛋白特有的結(jié)構(gòu)域， 即含有保守的三個螺旋結(jié)構(gòu)。這些功能域的存在是//2F/作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶 標(biāo)DNA的重要結(jié)構(gòu)，輔以體外轉(zhuǎn)錄因子驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，可用于迸一步證實(shí) //7F/蛋白所調(diào)控的基因。篩選直接作用于7/7F/基因或作用于能與其互 作的其他基因的藥劑都能抑制稻瘟病菌分生孢子的產(chǎn)生，從而起到田間防 治稻瘟病的效果。實(shí)用價值之二在于用//7F/突變體菌株與自然界不同交 配型稻瘟病菌菌株有性交配，后代群體中有一半失去了產(chǎn)生分生孢子的能 力。將//.77^突變體菌株制成工程菌，能逐年銳減自然稻瘟病菌的群體數(shù) 量，為防治稻瘟病起到重要作用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施 例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如J.Sambrook等分子克隆 實(shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明以稻瘟病菌野生型菌株 70-15 (Fungal Genetics Stock Center)為供試菌株。 實(shí)施例l: //777基因克隆及保守域分析
根據(jù)稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫公布的i/ZF7序列(MGG—00184.5)，設(shè) 計(jì)基因特異引物，以稻瘟病菌野生型菌株70-15基因組DNA為模板，經(jīng)
5PCR擴(kuò)增獲得7/77^7 DNA全長序列。此外，以70-15總RNA為模板， 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得//7F7 cDNA全長序列，分別克隆至Promega公司的 pGEM-T easy載體，測序結(jié)果表明其與稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫所公布序列 一致。Southern雜交結(jié)果表明該基因在稻瘟病菌中為單拷貝基因。通過生 物信息學(xué)預(yù)測，//7F/具備了所有同源異型盒蛋白特有的結(jié)構(gòu)域，即含有 典型的三個螺旋結(jié)構(gòu)，在第二螺旋和第三螺旋間具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的空 間結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2: i/r」F7基因敲除
本發(fā)明用同源重組方法對iiTF7基因進(jìn)行敲除。首先構(gòu)建靶基因敲 除載體。具體方法為首先以菌株70-15基因組DNA為模板，用引物1AF: 5'-CGGAGCTCCCCAGCTATGGTCAAATCA-3， ， 1AR :
5'-CCCAAGCTTCCTTCTATCTCCTTGGTCGT-3' 禾口1BF : 5'-CCGCTCGAGCACCACGGGACTACAACAC-3， ，1BR : 5'-GGGGTACCACCAAATGCTCGCTCACTA-3，分別擴(kuò)增獲得//7F/基因 ORF左右兩側(cè)的片段作為同源重組的同源片段，其大小分別為910bp和 810bp。將PCR擴(kuò)增獲得的A、 B片段分別用/// dIII、 &cl和I戸I、 雙酶切，純化回收后，用于敲除載體的構(gòu)建。構(gòu)建過程為常規(guī)的酶切、連 接、轉(zhuǎn)化及進(jìn)一歩的PCR和酶切驗(yàn)證，骨架載體為pCSN43 (Fungal Genetics Stock Center)。提取克隆得到的陽性重組子的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行下 一步的稻瘟病菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。提取野生型菌株70-15的原生質(zhì)體，以 PEG (購自北京市雙翔達(dá)公司)介導(dǎo)的方法，將重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入原生 質(zhì)體中，于含有200ug/ml潮霉素的完全培養(yǎng)基(酵母粉6g/L，水解酪蛋 白6g/L，蔗糖10g/L，瓊脂粉20g/L)上進(jìn)行篩選生長。生長得到的轉(zhuǎn)化子 進(jìn)行PCR和Southern雜交驗(yàn)證。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化所得到的陽性敲除轉(zhuǎn)化子， 表現(xiàn)為喪失產(chǎn)生分生孢子能力，分生孢子梗增加。由于不產(chǎn)生分生孢子， 所以不能用孢子噴霧接種水稻驗(yàn)證致病性，但用菌絲塊接種水稻和大麥均 能致病。
實(shí)施例3: //2 7敲除突變體功能互補(bǔ)為了證實(shí)陽性敲除轉(zhuǎn)化子分生孢子的生長發(fā)育異常是由于//77^7基因 敲除所引起的，本研究用酵母同源重組方法構(gòu)建^TF7基因自身啟動子啟 動的該基因與GFP基因的融合表達(dá)載體，同時它也是W7F7的功能互補(bǔ)載 體。具體方法為首先擴(kuò)增從啟動子到基因末尾，必須去除終止子的片段， 啟動子為基因起始密碼子前1500bp的序列。引物的5'端加上與pKB04 的GFP基因前端序列同源20bp以上的接頭，用于同源重組所需。用 Clontech公司的Advantage 2 Polymerase Mix進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增PCR片段膠 回收純化。擴(kuò)增引物分別為 INF :
CAAGAAGTGA-3' 禾n 1GR :
ACCTGTGTT-3，用Promega提質(zhì)粒試劑盒提取pKB04質(zhì)粒，并用Xho I酶 切，確保酶切成功后，進(jìn)行膠回收純化。
按照Alkali-Cation Yeast Transformation Kit制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，及 酵母轉(zhuǎn)化。一般按照試劑盒的protocol—次能制備IO管感受態(tài)細(xì)胞，lOOuL 每管分裝。轉(zhuǎn)化使用的DNA體積是10ul， 一般PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒的比例 是5 10: 1，先在一個管子里分別加入質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物，混勻，然后 把10ul的混合DNA加入酵母感受態(tài)細(xì)胞里，用手輕彈幾下。轉(zhuǎn)化完后， 涂在缺trp的平板上生長3天(此時酵母菌落比較大)，可以用牙簽把所 以生長出來的菌落轉(zhuǎn)移到eppendorf管中，直接進(jìn)行酵母質(zhì)粒的提取。使 用lyticase (sigma, L4025-250 KU, 107K8631, CAS: 37340-57-1)裂解酵母 細(xì)胞，釋放質(zhì)粒DNA。把提取好的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用常規(guī)的熱 擊或電擊轉(zhuǎn)化，用氨芐青霉素篩選，并進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆。最 后，挑取多個陽性克隆進(jìn)行測序，選取正確融合的載體進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)化。 構(gòu)建好的載體以PEG介導(dǎo)的方法，將重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體中，在 含有200ng/ml的zeocin抗生素的完全培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選生長。結(jié)果表明， 敲除突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子能夠恢復(fù)稻瘟病菌正常的孢子產(chǎn)生。 實(shí)施例4: //7F7的同源異型盒結(jié)構(gòu)域敲除為了進(jìn)一步證實(shí)Z/rF7的同源異型盒結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著調(diào)控稻瘟病菌分
生孢子產(chǎn)生的作用，本發(fā)明構(gòu)建了一個i/r」F7的同源異型盒結(jié)構(gòu)域敲除載 體。具體方法為先用引物 miF :
5'-CCGCTCGAGTCCCGGCTGGCTTCATTG-3， 禾卩1H1R : 5'-GGACTAGTCTGGTCCTGCTTCGACGTTG-3，擴(kuò)增2.2kb片段并克隆到 pYKll (Fungal Genetics Stock Center)的Xho I禾卩Spe I酶切位點(diǎn)得到 pYKll-Hl ，然 后 用 引 物1H2F : 5，-GGACTAGTGGAATCAAAAAGACGCAAG-3， 禾B 1H2R : 5，-GCTCTAGAAGGACCTAATAAAGCACGAC-3，擴(kuò)增2.3kb片段并克隆 到pYKll-Hl的Spe I和Sac I位點(diǎn)得到homeobox domain敲除載體 pYH12。該載體仍能夠表達(dá)HTF1自身啟動子驅(qū)動的該基因，但表達(dá)的蛋 白缺失了氨基酸86-146，即HTF1的同源異型盒結(jié)構(gòu)域序列
KEKGIKKTQEFAA。所有的PCR用TaKaRa公司的La DNA聚合酶擴(kuò)增， pYH12經(jīng)測序無誤后用于轉(zhuǎn)化似/7突變體原生質(zhì)體，用200ug/mL的zeocin 抗生素的完全培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子抗性篩選，并用PCR和RT-PCR驗(yàn)證。 結(jié)果表明，得到的突變體失去了產(chǎn)生分生孢子的能力。 實(shí)施例5:稻瘟病菌7fTF7缺失突變體的應(yīng)用
稻瘟病菌分生孢子在稻瘟病的侵染循環(huán)中起重要作用。我們證實(shí) //7F7基因的homeobox domain在稻瘟病菌的產(chǎn)孢中起決定性作用。該結(jié) 構(gòu)域是一個由3個螺旋區(qū)折疊而成的緊密球狀結(jié)構(gòu)。螺旋I與螺旋n之間 有一個環(huán)(loop)，螺旋n和螺旋III形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix - turn - helix) 的基序。因此，篩選直接作用于/ZIF7基因的homeobox domain或作用于 能與其互作的其他基因的藥劑都能抑制稻瘟病菌分生孢子的產(chǎn)生，能起到 田間防治稻瘟病的效果。
有性交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用i/7F7基因缺失突變體與不同交配型的稻瘟病 菌菌株交配，后代群體中有一半失去了產(chǎn)生分生孢子的能力，即破壞了稻 瘟病菌侵染循環(huán)的途徑。把改造的稻瘟病菌/^^7缺失突變體制成工程菌 株，釋放到自然環(huán)境中能逐年減少稻瘟病菌的種群數(shù)量。Untitled2. ST25 SEQUENCE LISTING
<110>福建農(nóng)林大學(xué)
<120>調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因HTF1及其應(yīng)用
〈130>
<160> 2
<170> Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211> 2227
<212> 隨
<213〉 稻瘟病菌
<400> 1
atgaacatgtt.tC3gggCggtggccatcaggccggctacttcgtccctxagtacaacgcc60
atgggccaggcggC3cctcagaacgacaccaggctcagcaacgacaac.ag120
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ctatggaatgccggc6igcaaCgC3ggg雄caggg卿acacagtttcgtcaagtgcatc1680
ggacgatgaacaaagctt,cggcatcggcgccaatggcgtgcagcccaacgcttccgccct1740<image>image see original document page 10</image>Untitled2. ST25
Ala Asp Asn Ala Ser lie Asn Ser Gly Leu Glu Glu Asp Ser Thr Val
195
200
205
Ser Thr Thr Asn Ser His Thr Pro lie Glu Pro Asn Val Met Thr Lys 210 215 220
Glu Asp Leu Val Arg Asp Gly Asp Glu Tyr Pro Ser Pro Gin Ser Leu
225
230
235
240
Pro Phe Gin Ser Thr A印Gin Ala Ser Asp Phe Asn Phe Gin His Asn 245 250 255
Phe Val Ala Met Ser Glu Asp Gin Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Ser His
260
265
270
Ser Gly Leu Pro Leu Asn Gly Met Pro Ala Gin Phe Thr His Asp Gly
275
280
285
Phe Ser Val Ser Asp Gin Leu Ser Phe Val Gly Gin Gin Tyr Thr Ser 290 295 300
Ala Val Asp Asn Asp Ala lie lie Ala Pro Thr Pro Ser Phe Pro Ser
305
310
315
320
Gin Leu Leu Gly Arg Leu Glu Phe Gin Asp Met Asp Pro His Gin Ala 325 330 335
Ala. Pro Ser Ser Phe Asp Leu Gin Gly Met Gin Val Glu Ser Pro Thr 340 345 350
Ala Met Thr Thr lie Pro Asp Asp Gly Ser Pro Asn Ser Met Pro Met
355
360
365
Ser Pro Pro Thr Pro Ser Asp Leu Arg Phe Lys Ser Pro Pro Pro Pro 370 375 380
Ala Asn Leu Ala Ser Arg Arg Asn Lys Gly Val Pro Ala Gin Leu Asn
385
390
395
400
Ala Thr Ala Leu Arg Ser Tyr Ser Tyr Gly Pro Lys Thr Gly Leu Asp 405 4lb 415
Leu Ser Lys Arg Ala Asp Cys Pro Ser Pro lie Arg Arg lie Ala Ser
420
425
430
Ala Thr Gly Pro Met Pro Gly Arg lie Gin Lys Ser Leu Thr Leu Gly
435
440
445
Thr Gly Ser Ser Ala Pro Arg Ser Pro Met Tyr Leu Glu Arg Thr Lys
450
455
460
Asp Ala Leu lie Arg Ser Phe Ser Asn Thr Arg Ser Pro Val Pro Leu
465
470
475
■
Gin Pro lie Asn Thr Ser Leu Ser Pro Met Thr Pro Gly Glu Tyr Tyr
485
490
495
11Untitled2. ST25
Gly Met Pro Ala Ala Thr Gin Gly Thr Arg Glu Asn Thr Val Ser Ser 500 505 510
Ser Ala Ser Asp Asp Glu Gin Ser Phe Gly lie Gly Ala Asn Gly Val 515 520 525
Gin Pro Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ser Thr Leu Lys Thr Pro Pro Gly 530 535 540
Thr Pro Gly Phe Asn Asn Gly Phe Val Ser Asp Gin Gin Pro Pro Ala
545
550
555
560
Asn Gin Val Asn Thr Phe Asp Ala Ala Trp Asn Phe Asn Pro Gin Asp
565
570
575
Glu Pro Leu Val Thr Pro Gly Leu Gly Ser Phe Gly Ser Glu Glu Phe
580
585
590
Ala Met Ala Pro Pro Ala Pro Gly Tyr lie Gly Gly Ser Ser Gin Pro 595 60i) 605
Pro Thr Pro Ser Tyr Pro His Ser lie Gly Pro Thr Tyr Gly Gly Ser
610
615
620
Phe Pro Trp Gly Ser Ala Ala Met Phe Asn Gly Ser Arg Val Gly Met
625
630
635
640
Pro Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Asn Phe Pro Glu Ser Phe Val Pro Asp 645 650 655
Thr Ser Asp lie Ser Pro Ser Leu Ser Thr Lys Ala Ser Lys Gin Phe 660 665 670
Gin Phe Thr Gin Asn Val Thr Pro Arg Asp Tyr Asn Thr Gly Val Glu
675
匕ys
680
68權(quán)利要求
1、調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因HTF1的核苷酸序列，為序列表中SEQ ID1所示的堿基序列。
2、 調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因i/7F/的核苷酸序 列所推演的氨基酸序列，為序列表中SEQ ID 2所示的氨基酸序列。
3、 調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因7/3T7的鑒定方法， 包括以下步驟(1) 用同源重組的方法，將野生稻瘟菌株中的基因片段SEQ ID1 敲除，則表現(xiàn)為喪失產(chǎn)生分生孢子的能力，分生孢子梗明顯增加；(2) 采用人工構(gòu)建的互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化被敲除而缺失所述SEQ ID1基 因片段的稻瘟病菌菌株，則所得的互補(bǔ)菌株能產(chǎn)生分生孢子。
4、 敲除調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒結(jié)構(gòu)域的序列，表 現(xiàn)為和敲除整個基因片段SEQ ID 1 —樣的表型。
5、 利用所述的調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因//rF7 作為靶點(diǎn)基因制備新型農(nóng)藥。
全文摘要
調(diào)控稻瘟病菌分生孢子產(chǎn)生的同源異型盒基因HTF1。通過基因克隆，表明其與稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫所公布的HTF1序列(MGG_00184.5)一致，且具備同源異型盒蛋白特有的結(jié)構(gòu)域。該基因的敲除突變體失去了產(chǎn)生分生孢子的能力，分生孢子梗增加，菌絲塊接種水稻能產(chǎn)生致病性。敲除突變體通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)后，即恢復(fù)了分生孢子的產(chǎn)生。敲除HTF1基因中同源異型盒結(jié)構(gòu)域序列則同樣導(dǎo)致稻瘟病菌不能產(chǎn)生分生孢子。該基因可以作為新型農(nóng)藥設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)。把HTF1突變體菌株制成工程菌，能逐年銳減自然稻瘟病菌的群體數(shù)量，為防治稻瘟病起到重要作用。
文檔編號C12N15/31GK101532022SQ20091011153
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者劉文德, 王宗華, 許金榮, 謝世勇, 魯國東 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)