專利名稱：枯草芽孢桿菌中性植酸酶phyC基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種來自微生物的具有酶解植酸、植酸鹽及其絡(luò)合 物、釋放出磷等礦質(zhì)營養(yǎng)元素活性的中性植酸酶基因phyC。
背景技術(shù)：
植酸(phytic acid)又名肌醇六磷酸(myo inositol hexakisphosphate)，對植物體本身來 說，可作貯藏性磷，在種子發(fā)芽時，逐漸被水解利用。但其絕大部分以復(fù)鹽的形式存在， 是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。它和胰蛋白酶原抑制劑、凝血素、皂角素、單寧、草酸、硫代葡萄糖 苷、棉酚、抗脂溶性維生素、抗B族維生素等多種抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)一樣，在飼料中被畜禽采食 后，影響畜禽對礦物營養(yǎng)元素和蛋白質(zhì)等的消化吸收。并且非反芻動物因缺少水解植酸、 植酸鹽及其絡(luò)合物的消化酶，在生理上對植酸鹽中的磷是不可利用的。
植酸酶(phytase)，是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或鹽)的一類酶的總稱，能 水解植酸最終釋放出無機磷。因此在動物飼料中添加植酸酶可以改良磷酸鹽的生物利用 度，消除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，減少非反芻動物未能吸收植酸、植酸鹽及其絡(luò)合物中的磷向 環(huán)境中的排泄，減少環(huán)境富磷營養(yǎng)化的污染；并可減少動物詞料中無機磷的添加。而且， 在食品中應(yīng)用植酸酶可以改善人對鐵、鋅的吸收利用，對提高食品的營養(yǎng)也具有意義。
目前從微生物中獲得植酸酶的報道有以下三種(1)主要來源于黑曲霉的酸性植酸酶 (phyA)，它具有較高的酶活性，其酶促反應(yīng)的pH值有效范圍在4.5 6.0之間，適用于 胃pH呈酸性的單胃動物及少數(shù)魚類，不適用于消化道呈中性的鯉科魚類，限制了酸性植 酸酶的應(yīng)用范圍。(2)來源于芽孢桿菌的中性植酸酶(phyC)，它具有更高的熱穩(wěn)定性， 在飼料制?；蚺蚧^程中引起的酶活損失少，最適酶促反應(yīng)pH在7.0 7.5，適合于鯉科 魚類飼料，可以彌補酸性植酸酶的不足，但其酶活性不高。(3)主要來源于大腸桿菌的雙 功酶(appA)，它具有植酸酶和磷酸酶的功能，但只在酸性條件下表現(xiàn)出強的植酸酶活性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來自于微生物的具有分解植酸、植酸鹽及其絡(luò)合物釋放出 磷的植酸酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物不僅酶促反應(yīng)最適PH為中性，而且酶活性很高，將其轉(zhuǎn)入 植物使之表達(dá)，可分解植物收獲物中的植酸、植酸鹽及其絡(luò)合物，釋放出磷等礦物營養(yǎng)元 素，不但植物自身可以吸收利用，而且也有利于食用此植物的動物的吸收利用。
4本發(fā)明申請人利用枯草芽孢桿菌基因組為模板，設(shè)計了一對中性植酸酶phyC引物， 然后進(jìn)行克隆，得到了一段序列。于上海invitrogen公司測序三次，堿基序列均一致，第 一次為TA克隆測序，第二次為將此段基因連接在表達(dá)載體pPIC9K上的測序，第三次為 用高保真酶進(jìn)行的TA克隆測序，其DNA堿基序列和氨基酸序列均與已報道的植酸酶基因 序列有異。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌中性植酸酶phyC基因通過以下步驟得到
(1) 首先根據(jù)NCBI上已報道的中性植酸酶phyC基因(登錄號為AY220075) (Hongning,W" Qi,W., Yong，H.， Likou,Z. and Shigui,L. Cloning of the phytase gene (phyC)
from Bacillus subtilis and its overexpression in Escherichia coli. Submitted (17-JAN-2003) College of Animal Science and Technology)設(shè)計引物，上游為5' TAC gTA ATg AAT CAT TCAAAAACACTT 3'，下游為5' gCA CTA gTT TAT TTT CCg CTT CTg TC A ;在上游
添加S flBI限制性酶切位點；
(2) 將枯草芽孢桿菌擴大培養(yǎng)并提取其基因組，然后以其為模板，用設(shè)計的特異 性引物進(jìn)行擴增，獲得目的條帶，PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T載體連接轉(zhuǎn)化入大腸桿 菌DH5oc感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性克隆后送往上海invitrogen公司測序，測序結(jié)果表明擴增 的序列與預(yù)期的結(jié)果一致；
(3) 將含有目的片斷的T克隆與pPIC9K空質(zhì)粒分別用S朋BI和Nort進(jìn)行雙酶切， 分別回收目的片斷，以T4連接酶將其連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得 含有pPIC9K-phyC的克隆，然后將擴大培養(yǎng)的菌液送往上海invitrogen公司測序，測序結(jié) 果與第一次測得的序列一致，獲得正確的克??；
(4) 提取質(zhì)粒pPIC9K-phyC將其進(jìn)行線性化和去磷酸化，然后用電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn) 入酵母感受態(tài)，再涂于MD板上培養(yǎng)兩天，挑取最先長的單菌落，之后點種于含G418的 YPD板上進(jìn)行陽性克隆的篩選，再進(jìn)行PCR驗證確認(rèn)其phyC基因已導(dǎo)入酵母菌中，再置 于BMMY中培養(yǎng)，添加甲醇以誘導(dǎo)phyC的表達(dá)，取上清液進(jìn)行植酸酶酶活性的測定；
(5) 參照鉬藍(lán)法，對植酸酶酶活性進(jìn)行測定
(6) 序列同源性分析通過NCBI上的BLAST (同源性比對)，得到的序列與NCBI 上己報道登錄的枯草芽孢桿菌菌株WHNB02， B9601-Y2， IDCC 1102， SD01N， DSll， ARRMK33等的phyC基因或者前體的同源性達(dá)到98%。
上述方法獲得的phyC基因，其完整的CDS及其推斷的氨基酸序列如下
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本發(fā)明的優(yōu)點是
本發(fā)明獲得的phyC基因，其表達(dá)產(chǎn)物的酶促反應(yīng)最適PH為中性，適用于桑樹以及如 玉米、水稻等其他收獲物為中性的作物遺傳轉(zhuǎn)化研究。特別桑樹，成熟桑葉的PH接近中 性，因此phyC基因轉(zhuǎn)入桑樹，其表達(dá)產(chǎn)物的酶促反應(yīng)最適PH與桑葉的PH—致，可以酶 解桑葉中的植酸、植酸鹽及其絡(luò)合物釋放出磷，有利于桑樹對磷的吸收利用，減少磷肥的施肥，減少磷對環(huán)境的污染，促進(jìn)桑樹的生長，提高家蠶對桑葉中磷元素的吸收利用，并 且其酶促活性較高，經(jīng)測定比同類植酸酶活性高10%左右。
具體實施例方式
實施例首先根據(jù)NCBI上巳報道的中性植酸酶phyC基因設(shè)計引物，上游為5' TAC gTAATg AATCATTCAAAAACACTT 3'，下游為5' gC A CTA gTT TAT TTT CCg CTT CTg TCA;在上游添加S^BI限制性酶切位點；將枯草芽孢桿菌擴大培養(yǎng)并提取其基因 組，然后以其為模板，用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行擴增，獲得目的條帶，PCR產(chǎn)物回收后 與pGEM-T載體連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性克隆后送往上海 invitrogen公司測序，測序結(jié)果表明擴增的序列與預(yù)期的結(jié)果一致；將含有目的片斷的T 克隆與pPIC9K空質(zhì)粒分別用S朋BI和NM進(jìn)行雙酶切，分別回收目的片斷，以T4連接 酶將其連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得含有pPIC9K-phyC的克隆，然后 將擴大培養(yǎng)的菌液送往上海invitrogen公司測序，測序結(jié)果與第一次測得的序列一致，獲 得正確的克?。惶崛≠|(zhì)粒pPIC9K-phyC將其進(jìn)行線性化和去磷酸化，然后用電擊轉(zhuǎn)化的方 法轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)，再涂于MD板上培養(yǎng)兩天，挑取最先長的單菌落，之后點種于含G418 的YPD板上進(jìn)行陽性克隆的篩選，再進(jìn)行PCR驗證確認(rèn)其phyC基因已導(dǎo)入酵母菌中， 再置于BMMY中培養(yǎng)，添加甲醇以誘導(dǎo)phyC的表達(dá)，取上清液參照鉬藍(lán)法，進(jìn)行植酸酶 酶活性的測定，比同類植酸酶活性高10%左右；通過NCBI上的BLAST (同源性比對)， 得到的序列與NCBI上已報道登錄的枯草芽孢桿菌菌株WHNB02， B9601-Y2， IDCC 1102， SD01N， DS11 ， ARRMK33等的phyC基因或者前體的同源性達(dá)到98%。
7序列表
SEQUENCE LISTING 〈110〉西南大學(xué)
<120>枯草芽孢桿菌中性植酸酶phyC基因
〈130〉
<140> 〈141〉
〈160〉 1
〈170〉
〈210〉 1
<211> 1152
〈212> 腿
<213〉 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
〈400〉 1
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權(quán)利要求
1、枯草芽孢桿菌中性植酸酶phyC基因，其特征在于其序列如下1atgaatcatt caaaaacact tttgttaacc gcggcagccg gattgatgct51 cacatgcggt gcggtttctt cccaggccaa acataagctg tctgatcctt101 atcattttac cgtgaatgcg gcggcggaaa cggagccggt tgatacagcc151 ggtgatgcag ctgatgatcc tgcgatttgg ctggacccca agaatcctca201 gaacagcaaa ttgatcacaa ccaataaaaa atcaggctta gtcgtgtaca251 gcctagaggg aaagatgctt cattcctatc ataccgggaa gctgaacaat301 gttgatatcc gctatgattt tccgttgaac ggaaaaaaag tcgatattgc351 ggcggcatcc aatcggtctg aaggaaagaa taccattgag atttacgcca401 ttgacgggaa aaacggcaca ttacaaagca ttacggatcc agaccgcccg451 attgcatcag caattgatga agtatacggt ttcagcttgt accacagtca501 aaaaacagga aaatattacg cgatggtgac agggaaagaa ggcgaatttg551 aacaatacga attaaatgcg gataaaaatg gatacatatc cggcaaaaag601 gtaagggcgt ttaaaatgaa ttctcagaca gaagggatgg cagcagacga651 tgaatacggc agtctttata tcgcagaaga agatgaggcc atctggaagt701 tcagcgctga gccggacggc ggcagtaacg gaacggttat cgatcgtgcc751 gacggcaggc atttaacccc tgatattgaa ggactgacga tttactacgc801 tgctgacggg aaaggttatc tgcttgcctc aagccagggt aacagcagct851 acgcgattta tgaaagacag ggacagaaca aatatgttgc ggactttcag901 ataacagacg ggcctgaaac agacggctca agcgatacag acggaattga951 cgttctgggt ttcgggctgg ggcctgaata tccgttcggt ctttttgtcg1001 cacaggacgg agagaatata gatcacggcc aaaaggccaa tcaaaatttt1051 aaaatggtgc catgggaaag aatcgctgat aaaatcggct ttcatccgca1101 ggtcaataaa caggttgacc cgagaaaact gactgacaga agcggaaaat1151 aa。
2、枯草芽孢桿菌中性植酸酶phyC基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其序列如下: 1 MNHSKTLLLT AAAGLMLTCG AVSSQAKHKL SDPYHFTVNA AAETEPVDTA<formula>formula see original document page 3</formula>
全文摘要
一種來自微生物的具有酶解植酸、植酸鹽及其絡(luò)合物、釋放出磷等礦質(zhì)營養(yǎng)元素活性的中性植酸酶基因phyC，其表達(dá)產(chǎn)物的酶促反應(yīng)最適pH為中性，適用于桑樹以及如玉米、水稻等其他收獲物為中性的作物遺傳轉(zhuǎn)化研究。因此phyC基因轉(zhuǎn)入桑樹，其表達(dá)產(chǎn)物的酶促反應(yīng)最適pH與桑葉的pH一致，可以酶解桑葉中的植酸、植酸鹽及其絡(luò)合物釋放出磷，有利于桑樹對磷的吸收利用，減少磷肥的施肥，減少磷對環(huán)境的污染，促進(jìn)桑樹的生長，并且其酶促活性較高，經(jīng)測定比同類植酸酶活性高10％左右。
文檔編號C12N15/55GK101492688SQ200910103029
公開日2009年7月29日 申請日期2009年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月8日
發(fā)明者余茂德, 吳存容, 李鎮(zhèn)剛, 王茜齡, 金筱耘, 黎其友 申請人:西南大學(xué)