專利名稱：大白菜抗霜霉病的分子標(biāo)記檢測(cè)方法及使用的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蔬菜分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及 一種利用分子標(biāo)記技術(shù) 準(zhǔn)確、快速檢測(cè)大白菜抗霜霉病的檢測(cè)方法和該方法使用的引物。
背景技術(shù)：
大白菜(5nz^.c" ra/w L.ssp ./ eh'"e"w'51 (Lour) Olsson)霜霉病主要危害葉片， 莖部、花梗。種莢亦可受害。葉片染病，初生邊緣不甚明晰的水漬狀褪綠斑， 后病斑擴(kuò)大，因受葉脈限制而呈多角形黃褐色病斑，葉背面則生白色稀疏霉層， 濕度大時(shí)霉層更為明顯。病情進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，多角形斑常連合成大斑塊，終致 葉片變褐干枯(朱志英，劉寶傳，趙西文，許立春，大白菜霜霉病的發(fā)生與防 治，北京農(nóng)業(yè)[J]， 2003,10: 7)。施用農(nóng)藥對(duì)大白菜霜霉病的防治有一定的效果， 但農(nóng)藥統(tǒng)治在生產(chǎn)上會(huì)造成農(nóng)藥殘留。在人們普遍重視綠色無(wú)公害蔬菜的今天， 采用抗霜霉病品種是解決白菜霜霉病危害的重要選擇。傳統(tǒng)抗病育種對(duì)霜霉病 鑒定的這一重要環(huán)節(jié)不但工作量大、費(fèi)用高、周期長(zhǎng)，而且鑒定結(jié)果常常受到 環(huán)境條件的影響。因此，大白菜育種和生產(chǎn)上急需一種能早期、周年、快速、 準(zhǔn)確鑒定大白菜霜霉病抗性的方法。
分子標(biāo)記輔助育禾中(molecular marker-assisted selection,簡(jiǎn)稱MAS)借助分 子標(biāo)記對(duì)育種材料從DNA水平上進(jìn)行選擇，從而可以快速選擇得到具有目的性 狀的后代(方宣鈞，吳為人，唐紀(jì)良。作物DNA標(biāo)記輔助育種.北京科學(xué)出 版社，2001)。通過(guò)篩選與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可快速、穩(wěn)定、可靠 地對(duì)抗性基因進(jìn)行篩選。因此，研究開(kāi)發(fā)與大白菜霜霉病基因連鎖的分子標(biāo)記， 可快速、穩(wěn)定、可靠地對(duì)抗性基因進(jìn)行篩選，加快抗病品種選育的進(jìn)程。在大 白菜抗霜霉病育種中極具應(yīng)用價(jià)值。于拴倉(cāng)等(2009)獲得一個(gè)與大白菜抗霜霉病一個(gè)主效QTL相距4.36cM 的SSR標(biāo)記并對(duì)其進(jìn)行了定位(YU Sh C， Zhang F L， Yu R B, a/. Genetic mapping and localization of a major QTL for seedling resistance to downy mildew in Chinese cabbage CSmw/ca ssp. /7eh"em7S)[J]. Molecular Breeding, 2009,
23:573-590.)。我們對(duì)抗病親本與感病親本雜交的F2分離群體進(jìn)行抗性鑒定，結(jié) 果表明本發(fā)明中的大白菜霜霉病抗性是由單基因控制的，顯性遺傳。目前尚未 見(jiàn)到單基因顯性遺傳的大白菜霜霉病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有大白菜霜霉病抗性鑒定方法的不足，提供一種 鑒定大白菜霜霉病抗性的引物序列。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種采用上述 引物鑒定大白菜霜霉病抗性的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 鑒定大白菜霜霉病抗性的引物，該引物由上游引物和下游引物組成，上游
引物的序列為5，-GCCAACAAAATAGGCGAG-3'，下游引物的序列為5，-GAGTT GTAGAGCTTCCTAGCA-3 ，。
為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 大白菜霜霉病抗性的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟
① 提取大白菜基因組DNA;
② 進(jìn)行PCR擴(kuò)增在PCR管中加入步驟①提取的大白菜基因組DNA 15~3 0ng;上游引物0.1 0.4pM，上游引物的序列為5，-GCCAACAAAATAGGC GAG-3';下游引物0.1 0.4pM，下游引物的序列為5'-GAGTTGTAGAGCT TCCTAGCA隱3; dNTP 0.15~0.5mM; Mg2+1.2 2.0 mM; 1倍的PCR緩沖 液；TaqDNA聚合酶0.8 1.2單位，加無(wú)菌超純水至15pL，進(jìn)行擴(kuò)增；③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析在步驟②的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液， 混勻，將混合物在0.8~1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠
的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和/ 或照相；
依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上有無(wú)條帶，鑒定大白菜霜霉病的抗性。 作為優(yōu)選，上述的擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性120 180秒，94。C變性60秒， 48 52。C退火30秒，72。C延伸45~90秒，25~35個(gè)循環(huán)，再72。C延伸300 420 秒，擴(kuò)增完成。
本發(fā)明的主要依據(jù)是篩選并獲得的了與大白菜抗霜霉病基因緊密連鎖的 DNA標(biāo)記。研究表明大白菜的霜霉病抗性為質(zhì)量性狀，由單顯性基因控制。所 以，可通過(guò)檢測(cè)大白菜基因組內(nèi)是否存在與抗霜霉病基因緊密連鎖的特異片段 來(lái)確定其霜霉病抗性，即如果檢測(cè)出特異片段，則說(shuō)明被檢植株為抗性株；如 果沒(méi)有檢測(cè)出特異片段，則說(shuō)明被植株為感病植株。
本發(fā)明的有益效果為簡(jiǎn)便易行、快速、特異性地檢測(cè)，只需采集少量待 檢植株葉片0.2 0.3g，采用常規(guī)PCR技術(shù)，就可判斷出所檢測(cè)大白菜材料是否 抗霜霉病，而無(wú)需在田間進(jìn)行，不受天氣影響，而且檢測(cè)周期大大縮短。
圖l為大白菜抗霜霉病特異片段擴(kuò)增結(jié)果圖，其中-
1: DNAMarker; 2:抗病親本；3:感病親本；4 — 13: F2代抗病植株；14 —23: F2代感病植株。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但以下描述不對(duì)本發(fā)明的保護(hù) 范圍構(gòu)成任何意義上的限定。(1) 提取大白菜基因組DNA;
(2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR管(0.2mL無(wú)菌塑料管)中加入所述大白 菜基因組DNA 20ng;上游弓I物0.1 ^M,上游引物的序列為5 ，-GCC AAC AAAATAG GCGAG-3';下游引物O.l，下游引物的序列為5'-GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA -3'; dNTP 0.15mM; Mg2+1.2 mM; 1倍的PCR緩沖液；Taq DNA聚合酶0.8 單位；加無(wú)菌超純水至15pL;擴(kuò)增條件為94"C預(yù)變性120秒，94。C變性60 秒，5(TC退火30秒，72。C延伸45秒，30個(gè)循環(huán)，再72。C延伸300秒，擴(kuò)增完 成；
(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液(0.25% 溴酚蘭+40%蔗糖)，混勻，將混合物在0.8 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，至 溴酚蘭到達(dá)凝膠的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行 觀察、照相；
(4) 依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上有無(wú)條帶，鑒定大白菜霜霉病的抗性?？?性植株能擴(kuò)增出條帶，感病植株無(wú)條帶。
6序列表
〈110〉浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
〈120>大白菜抗霜霉病的分子標(biāo)記檢測(cè)方法及使用的引物 〈160>2
〈210〉 1 <211〉18 〈212〉腿 〈213〉人工序列 〈223〉引物 〈400〉 1
GCCAACAAAATAGGCGAG 18
<210〉2 <211〉21 〈212〉 ■ <213〉人工序列 〈223〉引物 <400〉 2
GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA 2權(quán)利要求
1.鑒定大白菜霜霉病抗性的引物，其特征在于該引物由上游引物和下游引物組成，上游引物的序列為5’-GCCAACAAAATAGGCGAG-3’，下游引物的序列為5’-GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA-3’。
2. 大白菜霜霉病抗性的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟① 提取大白菜基因組DNA;② 進(jìn)行PCR擴(kuò)增在PCR管中加入步驟①提取的大白菜基因組DNA 15 30ng、權(quán)利要求1所述的上游引物0.1 0.4pM、權(quán)利要求1所述的下 游引物0.1~0.4一、 dNTP0.15 0.5mM、 Mg2+1.2~2.0 mM、 1倍的PCR緩 沖液、TaqDNA聚合酶0.8 1.2單位，加無(wú)菌超純水至15jiL,進(jìn)行擴(kuò)增；③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析在步驟②的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液， 混勻，將混合物在0.8 1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠 的2/3位置處停止電泳，凝膠經(jīng)EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和/ 或照相；④ 依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上有無(wú)條帶，鑒定大白菜霜霉病的抗性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的大白菜霜霉病抗性的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，其特征在于 擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性120-180秒，94。C變性60秒，48 52。C退火30秒， 72。C延伸45 90秒，25 35個(gè)循環(huán)，再72。C延伸300 420秒，擴(kuò)增完成。
全文摘要
本發(fā)明涉及蔬菜分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確、快速檢測(cè)大白菜抗霜霉病的檢測(cè)方法和該方法使用的引物。鑒定大白菜霜霉病抗性的引物，該引物由上游引物和下游引物組成，上游引物的序列為5’-GCCAACAAAATAGGCGAG-3’，下游引物的序列為5’-GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA-3’。本發(fā)明還公開(kāi)了采用上述引物快速檢測(cè)大白菜抗霜霉病的檢測(cè)方法。本發(fā)明的有益效果為簡(jiǎn)便易行、快速、特異性地檢測(cè)，只需采集少量待檢植株葉片0.2～0.3g，采用常規(guī)PCR技術(shù)，就可判斷出所檢測(cè)大白菜材料是否抗霜霉病，而無(wú)需在田間進(jìn)行，不受天氣影響，而且檢測(cè)周期大大縮短。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101619360SQ20091010172
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者李必元, 虞慧芳, 鐘新民, 顧宏輝 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院