自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法

專利名稱：：自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種將功能細(xì)胞在體外構(gòu)建成具有生命的組織材料，用以植入生物體內(nèi)，修復(fù)或替代病損組織，恢復(fù)組織器官的形態(tài)、機(jī)構(gòu)與功能；或在生物體內(nèi)植入某些生物活性物質(zhì)如透明質(zhì)酸酶、膠原蛋白、組織干細(xì)胞等誘導(dǎo)自體組織再生，達(dá)到修復(fù)組織、器官功能的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法。
背景技術(shù)：
：隨著我國社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)美容市場的日益增長，美容整形已經(jīng)成為我國目前發(fā)展最快的學(xué)科之一，伴隨醫(yī)學(xué)生物科技的髙速發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)產(chǎn)品不斷地出現(xiàn)于美容整形領(lǐng)域。組織工程學(xué)是在分子生物學(xué)、移植免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、新型材料學(xué)等學(xué)科以及基因工程技術(shù)、分子克隆技術(shù)、體外組織構(gòu)建技術(shù)等高科技迅速發(fā)展之后，出現(xiàn)的新興分支學(xué)科。其最終目的是將功能細(xì)胞在體外構(gòu)建成具有生命的組織材料，用以植入生物體內(nèi)，修復(fù)或替代病損組織，恢復(fù)組織器官的形態(tài)、機(jī)構(gòu)與功能；或在生物體內(nèi)植入某些生物活性物質(zhì)如透明質(zhì)酸酶、膠原蛋白、組織干細(xì)胞等誘導(dǎo)自體組織再生，達(dá)到修復(fù)組織、器官功能的目的1。這是繼20世紀(jì)科學(xué)家們解讀人類基因密碼后，具有重大科學(xué)意義的又一事件，對人類健康起到了十分重要的作用，因此，被認(rèn)為是"一場意義深遠(yuǎn)的醫(yī)學(xué)革命"，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域2。目前的美容除鈹方法雖有一定療效但有一定的時(shí)間限制21，由于都不是自體組織，有時(shí)會出現(xiàn)排異反應(yīng)及局部不平整現(xiàn)象。社會的進(jìn)步與生活水平的提高，使人們越來越注重于社會生活質(zhì)量，面部創(chuàng)傷的修復(fù)美容治療成為人們越來越關(guān)心的話題，美容整形也取得快速發(fā)展，各種組織工程生物材料不斷應(yīng)用于面部美容與創(chuàng)傷治療的修復(fù)3。對抗衰老是全人類共同關(guān)注的話題，研究表明對人體肌膚起支撐作用的物質(zhì)大部分存在于真皮層，由膠原蛋白、彈性纖維和透明質(zhì)酸構(gòu)成的一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)對皮膚起著支撐作用，其含量的多少決定了皮膚的質(zhì)地。這三種物質(zhì)都從真皮層中的成纖維細(xì)胞分泌而來，成纖維細(xì)胞由成纖維前體細(xì)胞演化生成。她不斷分泌膠原蛋白、彈性纖維和透明質(zhì)酸，保持肌膚的光澤度和質(zhì)感。25歲以后，成纖維前體細(xì)胞以每年1%到2%的速度減少，導(dǎo)致了成纖維細(xì)胞的減少，隨之而來的就是膠原蛋白、彈性纖維和透明質(zhì)酸的數(shù)量均下降，衰老的跡象就體現(xiàn)出來由此可見成纖維細(xì)胞才是導(dǎo)致肌膚衰老的真正原因。成纖維前體細(xì)胞(transitamplifyingfibroblast,TAF)是間充質(zhì)干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化過程中的過渡細(xì)胞，具有持久增殖分化為成纖維細(xì)胞的能力，是近年形領(lǐng)域的產(chǎn)品之一，具有作用持久、副作用少等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前的美容醫(yī)學(xué)發(fā)展趨勢朝著簡單、微創(chuàng)、安全的方向發(fā)展，面部老化的治療也從過去的手術(shù)治療向生物醫(yī)學(xué)制劑注射治療轉(zhuǎn)化，當(dāng)前主要的生物注射制劑有膠原蛋白、透明質(zhì)酸酶、胚胎干細(xì)胞和肉毒素等4。在以上生物注射制劑中除肉毒毒素是作用于面部動態(tài)皺紋外，均是用于治療皮膚老化所致的細(xì)小鈹紋，其中膠原蛋白和透明質(zhì)酸酶是真皮組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在皮膚中主要起生物替代作用，使老化皮膚逐漸減少的真皮厚度與細(xì)胞外基質(zhì)得到補(bǔ)充，具有除皺效果明顯，起效快的特點(diǎn)；但這些成分多數(shù)是異體或異種成分，存在免疫排斥和過敏反應(yīng)的可能，且生物代謝作用使之很快降解，效果持續(xù)時(shí)間短暫是這類產(chǎn)品的主要缺點(diǎn)5。胚胎干細(xì)胞也是近年開發(fā)的生物美容產(chǎn)品，具有持續(xù)的生物美容效果和免疫原性的特點(diǎn)，但胚胎干細(xì)胞的來源有限，提純與保存困難，不能完全排除免疫反應(yīng)是其缺點(diǎn)6。胚胎干細(xì)胞的高分化特性使其組織分化方向誘導(dǎo)成為注射后值得關(guān)注的一個(gè)問題7。TAF作為成纖維細(xì)胞的來源細(xì)胞具有細(xì)胞分化活性和分化方向恒定的優(yōu)點(diǎn)，且為自體組織，排除了免疫與過敏反應(yīng)的顧慮，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景8。自體細(xì)胞除皺的適應(yīng)癥比較廣泛，不但對于所有的顏面部皺紋和凹陷性疤痕都有效，還包括頸部皺紋、手部皺紋、額頭紋、眉間紋、魚尾紋、口周和面部皺紋、妊娠紋以及痤瘡、青春痘、天花、水痘、外傷等在面部留下的凹陷性疤痕都有明顯的效果。由于細(xì)胞取自自體，較以往的除皺手段有著截然相反的醫(yī)學(xué)思路，它不是靠破壞或刺激肌膚病理性改變來除皺，也不是異物物理性填充，它是通過直接增強(qiáng)皮膚功能來達(dá)到治療目的，因而屬于生理性除皺。自體細(xì)胞非手術(shù)除皺技術(shù)除了可以令患者保持更久的青春外，更重要的是它無與倫比的安全性。皮膚主要是由表皮、真皮、皮下組織三部分組成，真皮組織構(gòu)成了皮膚的支架結(jié)構(gòu)，是影響皮膚彈性與韌性的主要成分。真皮主要由膠原蛋白構(gòu)成，膠原蛋白成分的多少直接影響著皮膚組織的厚度與彈性。隨著皮膚的衰老，真皮組織中成纖維細(xì)胞與其所分泌的膠原蛋白的減少，是皮膚出現(xiàn)各種皺紋的主要原因，為皮膚提供足夠數(shù)量的成纖維細(xì)胞是應(yīng)用TAF進(jìn)行生物除皺的主要機(jī)制9。然而，成熟的成纖維細(xì)胞增殖與分泌活力有限，研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞是由TAF成熟演化而來10。在通常情況下，人體皮膚的彈性與光澤就是由真皮組織中TAF的含有量決定，隨著年齡的增長皮膚組織內(nèi)TAF逐漸減少。在皮膚組織中補(bǔ)充TAF可以持續(xù)地增加成纖維細(xì)胞的含量，促進(jìn)膠原蛋白的增生，使真皮的厚度增加，恢復(fù)皮膚的彈性，從而消除皮膚的皺紋或使凹陷的瘢痕得到填充11。TAF的采集與培養(yǎng)在這項(xiàng)組織工程技術(shù)的應(yīng)用中具有關(guān)鍵作用。首先需要解決的是TAF的純化與鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，有增殖活性的TAF較成熟的成纖維細(xì)胞幼稚、飽滿，缺乏成熟細(xì)胞的特征性細(xì)胞胞質(zhì)的突起。在組織學(xué)鑒定上，采用常規(guī)的細(xì)胞免疫學(xué)方法12。培養(yǎng)液的配制對細(xì)胞的生長有重要影響，美國Hyclone公司針對TAF的生長特性，設(shè)計(jì)生產(chǎn)了這一產(chǎn)品13。TAF技術(shù)在面部美容修復(fù)中主要應(yīng)用于生物美容除皺和凹陷性瘢痕的治療14。美國Isolagen研究機(jī)構(gòu)于1995年開始應(yīng)用組織工程技術(shù)培養(yǎng)自體成纖維前體細(xì)胞，并用于面部皺紋和瘢痕的治療，此后法國、英國、澳大利亞等都開展了這一研究[12][20][16]，取得了豐富的經(jīng)驗(yàn)，基本形成了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。Keller15等應(yīng)用此技術(shù)為20例年齡為3761歲的中老年人進(jìn)行了面部除皺治療，產(chǎn)生了明顯的療效。Watson等運(yùn)用攝像及硅膠模型技術(shù)，選擇10例年齡在2429歲之間的人，同時(shí)在耳后注射相同細(xì)胞進(jìn)行病理實(shí)驗(yàn)，經(jīng)36個(gè)月隨訪，用注射前后的硅膠模型比較局部皮膚表面的改善情況，對耳后注射部位的樣本標(biāo)本進(jìn)行了組織學(xué)分析。結(jié)果表明10例中有9人在治療后感覺有60%100%的改善，臨床醫(yī)師也給出了同樣的觀察結(jié)果；對每例的硅膠模型檢査證實(shí)，美容者面部的皺紋和瘢痕有10%85%的減少；經(jīng)顯微鏡觀察，真皮層膠原蛋白的厚度和密度均有所增加[16]。Boss等17對94例中的老年人進(jìn)行除皺治療，經(jīng)3648個(gè)月的隨訪，美容者的皺紋自主滿意率為92%,長期療效達(dá)70%。通過大量的臨床實(shí)驗(yàn)可以看出，TAF是一種面部美容修復(fù)安全有效的方法。國內(nèi)學(xué)者18在對82例接受手術(shù)的美容者分析中，觀察隨訪時(shí)間為6個(gè)月，結(jié)果自我感覺對皺紋、瘢痕明顯消失滿意，皮膚蒼白狀況明顯改善者為70例，其滿意率為85.4%。在采用硅膠皺紋模型方法觀察的10例中，有9例達(dá)到60%100%的改善程度，每例有IO%85%皺紋和瘢痕的減少，在所有觀察者中，經(jīng)過治療前后血、尿、便常規(guī)檢査以及肝腎功能和心電圖檢査，未出現(xiàn)異常反應(yīng)和全身的不良反應(yīng)，極少數(shù)人在術(shù)后24h內(nèi)注射部位有輕度腫脹、麻木等感覺，未經(jīng)處理均自然消失。l例在注射部位出現(xiàn)紅斑，于3d后自行消失。有醫(yī)療機(jī)構(gòu)]對135例美容者行自體成纖維細(xì)胞回植除皺術(shù)，術(shù)后經(jīng)6個(gè)月至1年的隨訪，改善者100%、醫(yī)患均滿意者91%。且不同年齡的患者其除皺效果及對術(shù)后的滿意度是不同的，年輕患者的皺紋淺而少，自體細(xì)胞活性強(qiáng)，增殖分化多，除皺效果好；年長患者與之相比則較差。年輕患者一般只需回植注射1次即達(dá)到除皺效果；年長患者則需2、3次的補(bǔ)充回植注射方可達(dá)到除鈹效果19。[l]楊志明，主編.組織工程.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002.15-30.BrooksN.Aforeignbodygranulomaproducedbyaninjectablecollagenimplantatatestsite.JDermatolSurg，1982,8:111-114.BurkeKE，NaugtonG,CassaiN,etal.Histological,immunologicalandelectronmicroscopystudyofbovinecollagenimplantsinthehuman.AnnPlastSurg，1985,14:515-522.[4]CoopermanS，MackinnonV,BechlerG，etal.Injectablecollagen:asixyearclinicalinvestigation.AesthPlastSurg,1985,9:145-151.ClarkP,HankerD,WilliamC,etal.Safetyofproductsinjectedforsofttissueaugmentation.JAmAcedDermatology,1989,21:992—998.McClellandM,EgbertB,HankoV，etal.Evaluation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發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，采用美容者的自體皮膚細(xì)胞，運(yùn)用當(dāng)今世界先進(jìn)的"組織工程技術(shù)"，進(jìn)行細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)，并擴(kuò)增成足量的成纖維細(xì)胞注射液，再回輸?shù)绞苄g(shù)者的皺紋、凹陷性疤痕等皮膚缺損部位的真皮層內(nèi)。會輸?shù)某衫w維細(xì)胞在真皮層內(nèi)繼續(xù)生長，逐步替換和補(bǔ)充自身已經(jīng)衰亡的細(xì)胞，源源不斷地產(chǎn)生屬于自己的膠原蛋白、透明質(zhì)酸和彈性纖維，使皮膚真皮層的厚度和密度增加，直接修復(fù)治療部位的皺紋和凹陷性疤痕等皮膚缺損疾病，恢復(fù)皮膚彈性，撫平皺紋，祛除凹陷性疤痕，達(dá)到預(yù)防、延緩衰老的目的。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是該自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于依次進(jìn)行皮膚標(biāo)本處理步驟和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，所述皮膚標(biāo)本處理步驟包括無菌條件下切取的皮膚標(biāo)本，立即放入裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)液的離心管中封存并運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，置于4。C冰箱中，24小時(shí)內(nèi)處理皮膚標(biāo)本，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液采用DMEM低糖培養(yǎng)液，含重量百分比為20%的胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟包括原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，所述原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟包括在超凈工作臺無菌條件下將皮膚標(biāo)本移入3.5cm培養(yǎng)皿中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗，修剪皮膚標(biāo)本并去除皮下組織、脂肪，剪切皮膚標(biāo)本成lmm3小塊，小塊皮膚標(biāo)本真皮層緊貼培養(yǎng)瓶底部置于50ml培養(yǎng)瓶中并使其均勻分布，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使得瓶底朝上，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml并保持基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本不接觸，擰緊瓶塞，將培養(yǎng)瓶倒置于37'C，5%C02培養(yǎng)箱中，1小時(shí)后緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)讓基礎(chǔ)培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的小塊皮膚標(biāo)本，再倒置培養(yǎng)，2小時(shí)后正放培養(yǎng)瓶，使基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本接觸，每35天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液一次，每次2ral，使得成纖維細(xì)胞大量繁殖。本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟后還可設(shè)置成纖維細(xì)胞傳代步驟，所述成纖維細(xì)胞傳代步驟包括吸棄舊培養(yǎng)液，加入2ml的PBS溶液，輕輕清洗細(xì)胞后吸棄PBS溶液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液1ml，將培養(yǎng)瓶置于37'C，5%C02培養(yǎng)箱中消化5分鐘；以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，立即加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；收集帶有細(xì)胞的含酶溶液于離心管，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，吸棄上清;用1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，輕輕吹打均勻后再加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液吹打均勻，將細(xì)胞分裝于3個(gè)新的50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶2ml;將培養(yǎng)瓶置于37°C,5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，使原代成纖維細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖。本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞傳代步驟可根據(jù)需要重復(fù)進(jìn)行，使得成纖維細(xì)胞大量增殖。本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟后或者成纖維細(xì)胞傳代步驟后還設(shè)置有成纖維細(xì)胞凍存步驟，所述成纖維細(xì)胞凍存步驟包括吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液2ml,于37°C，5%C02條件下消化35分鐘；以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入加基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打培養(yǎng)皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；收集帶細(xì)胞培養(yǎng)液，離心以IOOO轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；加35ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清溶液；加1ml凍存液重懸并吹勻細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管，蓋緊密封后，將凍存管封包，所述凍存液包括重量百分比為50%的胎牛血清、1(^的DMS0溶液、40%的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；將凍存管儲存到4'C冰箱，2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-20'C冰箱，再2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-80'C冰箱凍存。本發(fā)明所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在成纖維細(xì)胞凍存步驟后還設(shè)置有成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇步驟，所述成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇步驟包括將含成纖維細(xì)胞的凍存管從-80'C冰箱中取出，直接置于37'C水浴中解凍；解凍后將凍存管離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；加基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml重懸細(xì)胞，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；加基礎(chǔ)培養(yǎng)液lml重懸細(xì)胞并吹打均勻，再加基礎(chǔ)培養(yǎng)液lml并吹勻細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；在37°C，5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每35天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液一次，每次2ml。本發(fā)明所述超凈工作臺超凈空氣的流速為2430米/分鐘。本發(fā)明通過自體的成纖維前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增方法大量培養(yǎng)自體組織成纖維細(xì)胞，簡單方便、安全性好，使用時(shí)不會出現(xiàn)排異反應(yīng)，效果顯著。圖1為本發(fā)明實(shí)施例自體原代成纖維細(xì)胞示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法操作步驟如下1皮膚標(biāo)本處理無菌條件下切取的皮膚標(biāo)本，立即放入裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM低糖培養(yǎng)液，含20%(本發(fā)明所述比例均指重量百分比，下同)胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)的離心管中封存、運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，置于4'C冰箱中，24h內(nèi)處理皮膚標(biāo)本。2成纖維細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備和材料超凈工作臺是一種層流局部空氣凈化設(shè)備，采用可調(diào)風(fēng)量風(fēng)機(jī)系統(tǒng)，將空氣通過由特制的微孔泡沫塑料片層疊合組成的"超級濾清器"后吹送出來，形成連續(xù)不斷的無塵無菌的超凈空氣層流，即所謂"高效的特殊空氣"，它除去了大于0.3nm的塵埃、真菌和細(xì)菌孢子等等。超凈空氣的流速為2430m/min,已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒。工作人員就在這樣的無菌條件下操作，保證無菌材料在轉(zhuǎn)移接種過程中不受污染?；A(chǔ)培養(yǎng)液DMEM低糖培養(yǎng)液(含20%胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)；胎牛血清(四季青)；0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液;DMSO(Dimethylsulfoxide:二甲基砜)溶液；PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)；一次性吸管；眼科剪刀；眼科鑷子；細(xì)玻棒；50ml培養(yǎng)瓶；3.5cm培養(yǎng)皿。2.1原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)(組織塊貼壁法)2.1.1在超凈工作臺無菌條件下，將皮膚標(biāo)本移入3.5cm培養(yǎng)皿中，用lml基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗皮膚標(biāo)本3次，用眼科剪刀修剪皮膚標(biāo)本，去除皮下組織、脂肪，盡可能剪到皮膚真皮層。2.1.2用剪刀剪切皮膚標(biāo)本成lmm3小塊，小塊皮膚標(biāo)本的真皮層緊貼培養(yǎng)瓶底部置10于50ml培養(yǎng)瓶中(可用彎細(xì)玻棒移小塊皮膚標(biāo)本到培養(yǎng)瓶中)并使其均勻分布(小塊皮膚標(biāo)本之間的間距0.30.5cm間隔放置)。2.1.3輕輕翻轉(zhuǎn)，瓶底朝上，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml并保持基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本不接觸，擰緊瓶塞，將培養(yǎng)瓶倒置于37'C,5劣C02培養(yǎng)箱中。2.1.4lh后緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)讓基礎(chǔ)培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的小塊皮膚標(biāo)本，再倒置培養(yǎng)。2.1.52h后正放培養(yǎng)瓶，使基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本接觸。2.1.6每35天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液(2ral/次)一次。14天左右可以長出細(xì)胞，當(dāng)成纖維細(xì)胞大量繁殖單層成纖維細(xì)胞相互融合，出現(xiàn)密集的細(xì)胞集落或成纖維細(xì)胞基本上鋪滿瓶底(融合率達(dá)70-80%)時(shí)可以傳代。從成纖維細(xì)胞長出到可以傳代一般需要培養(yǎng)46個(gè)星期。2.2成纖維細(xì)胞傳代2.2.1吸棄舊培養(yǎng)液，加入2mlPBS溶液，輕輕清洗細(xì)胞后吸棄PBS溶液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液1ml,將培養(yǎng)瓶置于37'C，5%C02培養(yǎng)箱中消化5min;2.2.2以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，立即加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；2.2.3用一次性吸管吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；2.2.4收集帶有細(xì)胞的含酶溶液于離心管，離心1000r/min轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6min，吸棄上清；2.2.5用1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，輕輕吹打均勻后再加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液吹打均勻，將細(xì)胞分裝于3個(gè)新的50ral培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶2ml;2.2.6將培養(yǎng)瓶置于37°C,5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，使原代成纖維細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖；2.2.7—般3天左右可以再次傳代，即如果需要的話可重復(fù)2.2.12.2.6步驟，一瓶可傳3瓶。2.3成纖維細(xì)胞凍存(2.3成纖維細(xì)胞凍存步驟和2.4成纖維細(xì)胞解凍步驟可以在2.1原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟后也可以在2.2成纖維細(xì)胞傳代步驟后進(jìn)行)當(dāng)成纖維細(xì)胞大量繁殖單層成纖維細(xì)胞相互融合，出現(xiàn)密集的細(xì)胞集落或成纖維細(xì)胞基本上鋪滿瓶底(融合率達(dá)70-80%)時(shí)可以凍存。配制凍存液50%胎牛血清，10%DMSO溶液，40%基礎(chǔ)培養(yǎng)液，三種成分按比例混勻后置于4'C冰箱冷藏。2.3.1吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液2ml，于37°C,5%C02條件下消化35min;2.3.2以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入加基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；2.3.3用一次性吸管吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打培養(yǎng)皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；2.3.4收集帶細(xì)胞培養(yǎng)液，離心1000r/min轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6min,除去上清；2.3.5加35ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心1000r/min轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6min,除去上清溶液；2.3.6加lml凍存液重懸并吹勻細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管，蓋緊密封后，用衛(wèi)生紙將凍存管層層封包(約15層左右)；2.3.7將用衛(wèi)生紙包裹的凍存管儲存到4'C冰箱，2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-20'C冰箱，再2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-80'C冰箱凍存。2.4成纖維細(xì)胞解凍2.4.1將含成纖維細(xì)胞的凍存管從-80'C冰箱中取出，直接置于37'C水浴中約20分鐘解凍；2.4.2解凍后將凍存管離心1000r/min轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6min，除去上清；2.4.3加基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml重懸細(xì)胞，離心IOOOr/min轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6min,除去上清；2.4.4加基礎(chǔ)培養(yǎng)液1ml重懸細(xì)胞并吹打均勻，再加基礎(chǔ)培養(yǎng)液1ml并吹勻細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；2.4.537°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3~5天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液(2ml/次)一次；2.4.6如果需要的話可繼續(xù)成纖維細(xì)胞傳代，即轉(zhuǎn)至2.2成纖維細(xì)胞傳代步驟。本發(fā)明實(shí)施過程如下首先進(jìn)行皮膚取材(1)局部麻醉常規(guī)PVP-I溶液消毒，鋪巾后用2%利多卡因針1ml于耳后取皮部位局部皮下注射。(2)耳后取皮耳后切取約0.8x0.3cm大小梭形皮膚(包括表皮，真皮，以及少量皮下組織)。(3)封存、運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。將獲取的皮膚組織至于無菌器皿運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，然后采用本發(fā)明實(shí)施例的方法進(jìn)行自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)；最后進(jìn)行注射(1)皮試，(2)局部麻醉或全身麻醉，(3)使用專用注射器注射，選用410代的細(xì)胞進(jìn)行移植。注射細(xì)胞的數(shù)量根據(jù)需注射的面積而定。每毫升含約1-2千萬個(gè)自體成纖維細(xì)胞的懸浮液，2-5ml每次，真皮內(nèi)注射，一個(gè)療程注射3次，每次間隔2周。本發(fā)明實(shí)施范圍嬌嫩肌膚、潤唇、祛除凹陷性疤痕，治療頸紋、妊娠紋、眉間紋、眼周紋、鼻唇溝、鼻背紋、口周紋、魚尾紋等。試驗(yàn)表明，自體細(xì)胞注射后1、2、4、6月的組織填充效果分別約57%、79.6%、77.1%、81.6%。突出的特點(diǎn)是隨著時(shí)間推移，組織填充效果增加，普通充填劑的填充效果隨著時(shí)間推移遞減。本發(fā)明實(shí)施例回植的成纖維前體細(xì)胞來源于自體，安全性非常高，不會出現(xiàn)排異反應(yīng)。通過自體的成纖維前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，首先從數(shù)量上得到滿足，而且回植后易于成活，能迅速分泌膠原蛋白，由于機(jī)體代謝功能的調(diào)節(jié)作用，并不會出現(xiàn)膠原蛋白過度增生的現(xiàn)象，因此除皺的效果十分自然。自體成纖維細(xì)胞美容術(shù)不僅可以治療各個(gè)部位已經(jīng)形成的皺紋、凹坑，對沒有進(jìn)入衰老的肌膚，也有很好的嬌嫩肌膚作用。最重要的特點(diǎn)是完全不留痕跡，使用以后，細(xì)胞適應(yīng)母體需要一個(gè)周期，之后逐漸顯效，潛移默化地使肌膚質(zhì)地得到改善。還可以建立"自體細(xì)胞庫"，不論是為美容或者作為創(chuàng)傷治療，凍存細(xì)胞都可以實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)的幾大特點(diǎn)在國內(nèi)整形美容界具有唯一性，是目前市場上最有效祛除皺紋、疤痕的手段。并且在絕對安全的前提之下，把全面嬌嫩肌膚、改善膚質(zhì)的技術(shù)提高到一個(gè)新的境界。1權(quán)利要求1、一種自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于依次進(jìn)行皮膚標(biāo)本處理步驟和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，所述皮膚標(biāo)本處理步驟包括無菌條件下切取的皮膚標(biāo)本，立即放入裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)液的離心管中封存并運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，置于4℃冰箱中，24小時(shí)內(nèi)處理皮膚標(biāo)本，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液采用DMEM低糖培養(yǎng)液，含重量百分比為20％的胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100單位/毫升鏈霉素；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟包括原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，所述原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟包括在超凈工作臺無菌條件下將皮膚標(biāo)本移入3.5cm培養(yǎng)皿中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗，修剪皮膚標(biāo)本并去除皮下組織、脂肪，剪切皮膚標(biāo)本成1mm3小塊，置小塊皮膚標(biāo)本于50ml培養(yǎng)瓶并使真皮層緊貼培養(yǎng)瓶底部并均勻分布，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使得瓶底朝上，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml并保持基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本不接觸，擰緊瓶塞，將培養(yǎng)瓶倒置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，1小時(shí)后緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)讓基礎(chǔ)培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的小塊皮膚標(biāo)本，再倒置培養(yǎng)，2小時(shí)后正放培養(yǎng)瓶，使基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本接觸，每3～5天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液一次，每次2ml，使得成纖維細(xì)胞大量繁殖。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟后還設(shè)有成纖維細(xì)胞傳代步驟，所述成纖維細(xì)胞傳代步驟包括吸棄舊培養(yǎng)液，加入2mlPBS溶液，輕輕清洗細(xì)胞后吸棄PBS溶液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液1ml，將培養(yǎng)瓶置于37'C，5%C02培養(yǎng)箱中消化5分鐘；以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，立即加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，使己經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；收集帶有細(xì)胞的含胰蛋白酶溶液于離心管，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，吸棄上清；用1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，輕輕吹打均勻后再加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液吹打均勻，將細(xì)胞分裝于3個(gè)新的50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶2ml;將培養(yǎng)瓶置于37'C，5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，使原代成纖維細(xì)胞大量增殖。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于所述成纖維細(xì)胞傳代步驟重復(fù)進(jìn)行，使得成纖維細(xì)胞大量增殖。4、根據(jù)權(quán)利要求13任一權(quán)利要求所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟后或者成纖維細(xì)胞傳代步驟后還設(shè)置有成纖維細(xì)胞凍存步驟，所述成纖維細(xì)胞凍存步驟包括吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%￡0丁八溶液21111，于37'C，5%C02條件下消化35分鐘；以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入加基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打培養(yǎng)皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；收集帶細(xì)胞培養(yǎng)液，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；加35ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清溶液;加lml凍存液重懸并吹勻細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管，蓋緊密封后，將凍存管封包，所述凍存液包括重量百分比為50%的胎牛血清、1(W的DMSO溶液、40%的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；將凍存管儲存到4'C冰箱，2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-20'C冰箱，再2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-80'C冰箱凍存。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在成纖維細(xì)胞凍存步驟后還設(shè)置有成纖維細(xì)胞解凍步驟，所述成纖維細(xì)胞解凍步驟包括將含成纖維細(xì)胞的凍存管從-80'C冰箱中取出，直接置于37'C水浴中解凍；解凍后將凍存管離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；加基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml重懸細(xì)胞，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；加基礎(chǔ)培養(yǎng)液lml重懸細(xì)胞并吹打均勻，再加基礎(chǔ)培養(yǎng)液lml并吹勻細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；在37'C,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每35天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液一次，每次2ml。6、根據(jù)權(quán)利要求13任一權(quán)利要求所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于所述超凈工作臺超凈空氣的流速為2430米/分鐘。全文摘要本發(fā)明涉及一種自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法，其特征在于依次進(jìn)行皮膚標(biāo)本處理步驟和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟包括原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，還可根據(jù)實(shí)際需要設(shè)置成纖維細(xì)胞傳代步驟、成纖維細(xì)胞凍存步驟和成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇步驟。本發(fā)明通過自體的成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增方法大量培養(yǎng)自體組織成纖維細(xì)胞，用于回輸治療皮膚膠原缺損性疾病或變性疾病，簡單方便、安全性好，使用時(shí)不會出現(xiàn)排異反應(yīng)，效果顯著。文檔編號C12N5/08GK101597593SQ200910101280公開日2009年12月9日申請日期2009年7月27日優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日發(fā)明者燁呂,王培科,趙可佳申請人:杭州安倍生物科技有限公司