專利名稱：超高溫瞬時處理的酸性乳飲料中抗生素的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超高溫瞬時處理(UHT)的酸性乳飲料中抗生素的檢測 方法，且該酸性乳飲料是由于添加酸性食品添加劑造成其酸性口味。特別涉 及用微生物檢測UHT酸性乳飲料中抗生素的方法。
背景技術(shù)：
、
抗生素的發(fā)現(xiàn)在幫助人類戰(zhàn)勝重大疾病方面有巨大的貢獻，但藥物都是 雙刃劍，抗生素也不例外，它的大范圍濫用所導(dǎo)致的副作用己成為一個嚴峻 的社會問題，是人類健康的一大隱患?？股氐臑E用已顯現(xiàn)出三大惡果其 一，產(chǎn)生大量的耐藥菌，抗生素的效果變差或安全無效；原本抗生素可以輕 松對付的疾病，面對"抗藥性"卻顯得無奈，于是只得應(yīng)用更強大的藥物來治療， 如肺炎鏈球菌，過去對青霉素、紅霉素、磺胺等藥品都很敏感，現(xiàn)在幾乎"刀 槍不入"。其二，產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng)。其三，導(dǎo)致人體免疫力下降和產(chǎn)生醫(yī) 源性感染。
因此，乳制品中抗生素殘留一直是令人關(guān)注的焦點。抗生素可以利用微 生物來檢測，其原理是抗生素抑制微生物孢子和微生物孢子在生長時產(chǎn)酸并 引起培養(yǎng)基中pH指示劑變色，從而判斷樣品中抗生素的有無。然而，當(dāng)被檢 測的樣品中含有檸檬酸鈉等這種酸性物質(zhì)且達到一定量時，無論樣品中有沒 有抗生素殘留，微生物孢子有無生長，培養(yǎng)基中pH指示劑都可以變色，產(chǎn)生 假陰性結(jié)果。所以該方法一直用于成品白奶檢測。
早期的乳制品企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品主要是滅過菌的白奶類產(chǎn)品，pH值是接近 于中性的， 一般在6.4-6.7之間，針對這類產(chǎn)品出現(xiàn)了用微生物培養(yǎng)法檢測產(chǎn) 品中的抗生素，同時也出現(xiàn)了一些快速檢測試劑盒，例如西班牙的ECLIPSE50 試劑盒。當(dāng)樣品中無抗生素時，微孔中微生物會生長，并產(chǎn)酸，微孔中的藍 色pH指示劑在酸性條件下變?yōu)辄S色，判斷樣品為陰性，當(dāng)樣品中有抗生素且 達到檢測限時，微孔中微生物生長受到抗生素抑制，停止生長，不產(chǎn)酸，微 孔中的藍色pH指示劑保持藍色不變，判斷樣品為陽性。隨著人們對乳制品的口味要求越來越多樣化，出現(xiàn)了酸酸乳，真果粒等 UHT酸性乳飲料，這些酸性乳飲料由于其本身pH值低，是酸性產(chǎn)品，其滅
菌后的pH值能夠達到4左右，會導(dǎo)致檢測抗生素的微生物培養(yǎng)法，不管樣品 中有無抗生素，由于樣品本身的酸性，藍色pH指示劑在酸性條件下變?yōu)辄S色， 會產(chǎn)生假陰性的結(jié)果，起不到檢測抗生素的目的。然而若是使用液相法或液 質(zhì)法進行檢測，成本是它的幾十倍，檢測時間差不多，都是兩個多小時，但 是微生物培養(yǎng)法只需要把樣品加入微孔中，等待兩個多小時，觀察結(jié)果就可 以，檢測人員可以用這兩個多小時進行其它檢測工作；而液相法或液質(zhì)法在 檢測的兩個多小時時間內(nèi)，需要不停地進行前處理，檢測人員只能進行這一 項工作。目前，還有 -種可以快速檢測抗生素的方法，叫做膠體金試紙條法， 但是該方法也只限于原料乳和成品白奶，無法進行UHT酸性乳飲料檢測。
目前，國內(nèi)沒有關(guān)于微生物檢測UHT酸性乳飲料中抗生素的方法，更沒 有相關(guān)國家標(biāo)準檢測方法。因此，迫切需要找到一種簡單，方便，成本低的 檢測UHT酸性乳飲料中抗生素的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速準確的超高溫瞬時處理(UHT)的酸性乳 飲料中抗生素的檢測方法，其簡便易行并且適用于規(guī)?；鹾YUHT酸性乳飲 料。
本發(fā)明提供了一種超高溫瞬時處理的酸性乳飲料中抗生素的檢測方法， 包括以下步驟
1) 制備堿性試劑；
2) 取待檢UHT酸性乳飲料樣品，加入所述堿性試劑，混合均勻，使pH 值達到6.4-6.7，得到待測溶液；
3) 用己有的微生物快速檢測抗生素的試劑盒檢測待測溶液中是否存在微 生物，若存在微生物，則所述酸性乳飲料中不含抗生素，若不存在微生物， 則所述酸性乳飲料中含有抗生素。
優(yōu)選的，所述的堿性試劑以去離子水為溶劑，溶解氫氧化鈉或氫氧化鉀 制備而成，更優(yōu)選的，堿性試劑的濃度為1M。加入堿性試劑，可以中和UHT 酸性乳飲料中的酸性物質(zhì)，使其pH值達到6.4-6.7之間，該pH值不回對微生 物培養(yǎng)法檢測抗生素的pH指示劑產(chǎn)生干擾，避免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。優(yōu)選的，所述的試劑盒為西班牙的ECLIPSE50試劑盒。 為了確定上述試劑盒的培養(yǎng)時間，在所述步驟3)前進行陰性對照實驗， 包括取50uL不含抗生素及抗生素拮抗劑的乳，加入到所述的試劑盒的微孔 中，置于65"C孵育器或水浴箱孵育變?yōu)辄S色后再延長15分鐘，記錄自孵育開 始起所需時間之和為最佳培養(yǎng)時間。通常最佳培養(yǎng)時間為2小時15分鐘到2 小時45分鐘。
用ECLIPSE50試劑盒檢測微生物存在的步驟如下
取50uL步驟2)所得到的待測溶液，加入到微生物快速檢測抗生素的試 劑盒ECLIPSE50的微孔中，置于65'C孵育器或水浴箱孵育2小時15分鐘到2 小時45分鐘，讀取結(jié)果。綠-黃色或者黃色表示抗生素不存在(陰性)，藍-紫色表示抗生素存在(陽性)，綠-藍色表示抗生素濃度接近試劑盒的檢測限， 此時要重做檢測。
優(yōu)選的，在步驟3)檢測時進行陽性對照實驗檢測ECLIPSE50試劑盒是 否可以使用，陽性對照實驗包括如下步驟
a) 以去離子水為溶劑，配制抗生素標(biāo)準溶液；
b) 將所配制抗生素標(biāo)準溶液加入不含抗生素及抗生素拮抗劑的乳中，制 成陽性對照乳；
c) 將所述陽性對照乳與所述待測溶液使用相同的所述試劑盒進行檢測， 讀取陽性對照乳檢測結(jié)果，其檢測結(jié)果若為不含抗生素，則所用試劑盒失效， 需更換試劑盒重新檢測樣品，若其檢測結(jié)果為含有抗生素，則所用試劑盒可 以用于檢測。
本發(fā)明的方法是在檢測成品白奶的微生物培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，增加前處理方 法，使酸度改變后的UHT酸性乳飲料符合微生物培養(yǎng)法檢測要求。同時，不 影響UHT酸性乳飲料中抗生素的成分，最終完成檢測。本發(fā)明的檢測方法， 可以有效的解決微生物培養(yǎng)法檢測UHT酸性乳飲料中抗生素殘留時產(chǎn)生假陰 性的問題，正確的檢測UHT酸性乳飲料中抗生素殘留。本發(fā)明的方法具有快 速、簡便、準確的優(yōu)點，便于企業(yè)規(guī)?；瘧?yīng)用。
具體實施例方式
下面將結(jié)合具體實施方案對本發(fā)明的方法做更詳細的說明。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，下述實施例均用于對本發(fā)明所要求保護的范圍進行實例性的描述，以此概括本發(fā)明的各參數(shù)的相對范圍，因而不能將之理解為對本發(fā)明 的一種具體限制。
實施例l檢測UHT酸性乳飲料中的抗生素
UHT酸性乳飲料，其酸性是由檸檬酸鈉等酸性食品添加劑造成。該UHT 酸性乳飲料pH值在4.0-5.0之間，lml的UHT酸性乳飲料加入30-35uL的1M NaOH，可將其pH值調(diào)至6.4-6.7。取待測UHT酸性乳飲料，按照如下步驟檢
測其中是否含有抗生素
1 、配制lMNaOH水溶液稱取4克NaOH，用去離子水溶解，定容到 腦ml。
2 、取兩份，每份lml待測UHT酸性乳飲料樣品，分別加入30、 35ul 的lMNaOH水溶液，渦旋混勻，用pH精密試紙進行檢測，使樣品pH值調(diào) 至6.4-6.7，制備成兩份平行待測溶液。
3 、取l克不含抗生素及抗生素拮抗劑的乳粉溶解于9ml蒸餾水(溫度 45-60。C)制成無抗復(fù)原乳，渦旋混勻制成陰性對照乳，溫度降至室溫后使用。 取lml無抗復(fù)原乳，也可以使用lml不含抗生素和抗生素拮抗劑的原料乳， 加入10ullPPm青霉素鈉水溶液，使青霉素鈉的最終濃度為10ppb ，制備成 陽性對照乳。
4 、將上述準備好的陰性對照乳，取50uL加入到西班牙ECLIPSE50試 劑盒的微孔中，置于65t:孵育器或水浴箱孵育，從試劑盒的微孔中觀察，變 為黃色后再延長15分鐘，所需要的時間之和記錄為最佳培養(yǎng)時間。同一批次 的試劑盒只需進行一次陰性對照實驗，以確定最佳培養(yǎng)時間，該時間在2小 時15分鐘到2小時45分鐘之間。
5、將上述準備好的待測溶液和陽性對照乳，分別取50uL加入到西班牙 ECLIPSE50試劑盒的微孔中，置于65。C孵育器或水浴箱孵育上述最佳培養(yǎng)時 間。
5、從西班牙ECLIPSE50試劑盒的微孔側(cè)面觀察結(jié)果，綠-黃色或者黃色 表示抗生素不存在(陰性)，藍-紫色表示抗生素存在(陽性)，綠-藍色表示抗 生素濃度接近試劑盒的檢測限，此時要重做檢測。本實施例的待測溶液檢測 結(jié)果均為綠-黃色，不含抗生素。實施例2檢測UHT果粒酸性乳飲料中的抗生素
UHT果粒酸性乳飲料，其酸性是由檸檬酸鈉等酸性食品添加劑造成。UHT 果粒酸性乳飲料pH值在4.0-5.0之間，lml的UHT果粒酸性乳飲料加入30-35uL的IMKOH,可將其pH值調(diào)至6.4-6.7，用ECLIPSE50試劑盒進行抗生 素檢測。
取待測UHT果粒酸性乳飲料，按照如下步驟檢測其中是否含有抗生素
1 、配制1M KOH水溶液稱取4克KOH，用去離子水溶解，定容到100ml。
2 、取兩份、每份lml待測UHT果粒酸性乳飲料樣品，用紗布過濾掉果粒。
3 、在兩份去除果粒的樣品中分別加入32、 34ul的IMKOH水溶液，渦 旋混勻，用pH精密試紙進行檢測，使樣品pH值調(diào)至6.4-6.7，制備成兩份平 行待測溶液。
4 、取l克不含抗生素及抗生素拮抗劑的乳粉溶解于9ml蒸餾水(溫度 45-60 °C )制成無抗復(fù)原乳，渦旋混勻，溫度降至室溫后使用。取lml無抗 復(fù)原乳，也可以使用lml不含抗生素和抗生素拮抗劑的原料乳，加入10ul IPPm 青霉素鈉水溶液，使青霉素鈉的最終濃度為10ppb ，制備成陽性對照乳。
5、 將上述準備好的待測溶液和陽性對照乳，分別取50uL加入到 ECLIPSE50試劑盒的微孔中，置于65'C孵育器或水浴箱孵育2小時45分鐘。
6、 從西班牙ECLIPSE50試劑盒的微孔側(cè)面觀察結(jié)果，從微孔側(cè)面觀察 結(jié)果，綠-黃色或者黃色表示抗生素不存在(陰性)，藍-紫色表示抗生素存在
(陽性)，綠-藍色表示抗生素濃度接近試劑盒的檢測限，此時要重做檢測。本 實施例的待測溶液檢測結(jié)果為黃色，不含抗生素。
以上所述僅為本發(fā)明示意性的具體實施方式
，并非用以限定本發(fā)明的范 圍。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和原則的前提下所作的 等同變化、修改與結(jié)合，均應(yīng)屬于本發(fā)明保護的范圍。
權(quán)利要求
1、一種超高溫瞬時處理的酸性乳飲料中抗生素的檢測方法，包括以下步驟1)制備堿性試劑；2)取待檢UHT酸性乳飲料樣品，加入所述堿性試劑，混合均勻，使pH值達到6.4-6.7，得到待測溶液；3)用已有的微生物快速檢測抗生素的試劑盒檢測待測溶液中是否存在抗生素，若微生物快速檢測抗生素的試劑盒中微生物生長，則所述酸性乳飲料中不含抗生素，若微生物快速檢測抗生素的試劑盒中微生物不生長，則所述酸性乳飲料中含有抗生素。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的堿性試劑以去離子水 為溶劑，溶解氫氧化鈉或氫氧化鉀制備而成。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的堿性試劑濃度為1M。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的試劑盒為西班牙的 ECLIPSE50試劑盒。
5、 如權(quán)利要求4的方法，其特征在于，在所述步驟3)前進行陰性對照 實驗，包括如下步驟取50uL不含抗生素及抗生素拮抗劑的乳，加入到所述 的試劑盒的微孔中，置于65'C孵育器或水浴箱孵育變?yōu)辄S色后再延長15分鐘， 記錄自孵育開始起所需時間之和為最佳培養(yǎng)時間。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述用ECLIPSE50試劑盒 檢測微生物存在的步驟如下取50uL步驟2)所得到的待測溶液，加入到所述的試劑盒的微孔中，置 于65"C孵育器或水浴箱孵育最佳培養(yǎng)時間，讀取結(jié)果。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述最佳培養(yǎng)時間為2小時 15分鐘到2小時45分鐘。
8、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述用ECLIPSE50試劑盒 檢測微生物存在的步驟如下取50uL步驟2)所得到的待測溶液，加入到所述的試劑盒的微孔中，置 于65匸孵育器或水浴箱孵育2小時15分鐘到2小時45分鐘。，讀取結(jié)果。
9、 如權(quán)利要求6-8任意一項所述的方法，其特征在于，所述步驟3)檢測時進行陽性對照實驗，包括如下步驟a) 以去離子水為溶劑，配制抗生素標(biāo)準溶液；b) 將所配制抗生素標(biāo)準溶液加入不含抗生素及抗生素拮抗劑的乳中，制 成陽性對照乳；c) 將所述陽性對照乳與所述待測溶液使用相同的所述試劑盒進行檢測，讀取陽性對照乳檢測結(jié)果，其檢測結(jié)果若為不含抗生素，則所用試劑盒失效， 需更換試劑盒重新檢測樣品，若其檢測結(jié)果為含有抗生素，則所用試劑盒可 以用于檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測超高溫瞬時處理(UHT)的酸性乳飲料中抗生素的方法。包括如下步驟UHT酸性乳飲料加入堿性試劑，將UHT酸性乳飲料pH值調(diào)至6.4-6.7之間，用微生物培養(yǎng)法檢測抗生素殘留試劑盒檢測UHT酸性乳飲料中抗生素的殘留情況。本發(fā)明還可以進一步的取不含抗生素和拮抗劑的原料乳，加入抗生素，制成陽性對照乳，與上述將pH值調(diào)至6.4-6.7的UHT酸性乳飲料在相同條件下檢測抗生素含量。
文檔編號C12Q1/18GK101629205SQ20091009075
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 劉志楠, 劉曉川, 喻東威, 梅 李, 薛志清, 源 趙 申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司