抑制胸腺素β₄基因表達(dá)的RNA及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：抑制胸腺素β₄基因表達(dá)的RNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抑制胸腺素P4基因表達(dá)的RNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1981年，T^被從胸腺提取物中利用凝膠層析法分離出來。研究發(fā)現(xiàn)，T^是由43個氨基酸殘基組成的疏水多肽，分子量為4964Da，等電點(diǎn)5.1，在哺乳動物中高度保守?；瘜W(xué)構(gòu)象研究表明，T04是以單鏈形式存在及發(fā)揮作用，其第31-43殘基和第18-30殘基間是一內(nèi)部重復(fù)區(qū)域，有6個氨基酸相同。雖然存在第4-12殘基和第32-40殘基兩個高度螺旋區(qū)，但是T04沒有0轉(zhuǎn)角形成。1991年，來自費(fèi)城賓夕凡尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的DanielSafer等在研究肌動蛋白單體(G-actin)是如何聚合形成纖維肌動蛋白(F-actin)的過程中偶然發(fā)現(xiàn)T^與肌動蛋白單體結(jié)合，從而阻斷纖維肌動蛋白的形成。后來的研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中編碼T^的基因位于X染色體上。盡管它最初是從胸腺中被分離，但是后來證實(shí)機(jī)體眾多組織中都有它的蹤跡，其中含量最高的分別是脾臟、胸腺、肺和腹膜巨噬細(xì)胞，其次是腦、肝、腎臟、睪丸、心臟，甚至非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞如成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等也能合成TP4。在循環(huán)系統(tǒng)中，白細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞都存在TP4，紅細(xì)胞缺乏。在血小板和白細(xì)胞中，其是含量最高的肌動蛋白阻斷蛋白，濃度可達(dá)0.3raM。在溶液中，T04對MgATP-actin的親和力達(dá)O.5-2MM，是其對MgADP-actin的50倍。淋巴組織存在不同形式的T04mRNA，提示T^亞型或是剪切體在淋巴細(xì)胞的發(fā)育和功能的形成中發(fā)揮作用。最初JulianD.WATTS等通過顯微注射發(fā)現(xiàn)Te4是胞漿蛋白而非核蛋白，2004年ThomasHuff等利用OregonGreencadaverine禾口transglutaminase標(biāo)記TP4對Hela細(xì)胞體外顯微注射，驚奇的發(fā)現(xiàn)T34在核內(nèi)富集，而在細(xì)胞槳中只是散在存在，推測T^很有可能是通過某種主動運(yùn)輸進(jìn)入核內(nèi)。除了TP4外，在核內(nèi)還含有其他幾種肌動蛋白結(jié)合蛋白和數(shù)量可觀的肌動蛋白單體，但是功能未知。鑒于核內(nèi)存在大量的Te4，有理由推測T^很有可能作為一個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，TlcDNA中缺少信號肽，盡管體內(nèi)也存在一些沒有信號肽的分泌蛋白如白細(xì)胞介素l(IL-1)、內(nèi)皮生長因子等，但大家還是傾向認(rèn)為1^4不大可能是外分泌蛋白，而可能是某些細(xì)胞基本功能所必需。T04具有很多重要功能(1)Te4在維持細(xì)胞骨架的動態(tài)平衡中起著重要作用；(2)研究表明，T04的過度表達(dá)和惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系；(3)T04對腫瘤細(xì)胞的增殖也有一定的影響；(4)血管形成參與了機(jī)體的眾多生理過程，研究發(fā)現(xiàn)T^具有促進(jìn)血管形成的作用；(5)胸腺素P4的裂解片段(N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酰，AcSDKP，N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline)是一種生理性造血系統(tǒng)生長抑制因子；(6)T04是在創(chuàng)傷愈合與損傷組織的再生和重建中發(fā)揮重要作用；(7)TP4被認(rèn)為有促進(jìn)細(xì)胞遷移，抗炎癥反應(yīng)，殺滅細(xì)菌和化學(xué)保護(hù)等特性，并且可以刺激層粘連蛋白5的合成；(8)在絕大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞中，T^是主要的肌動蛋白調(diào)節(jié)分子，可促進(jìn)細(xì)胞中所有F-肌動蛋白的解離，能作為肌動蛋白結(jié)合的競爭性抑制蛋白和肌動蛋白解聚的協(xié)同蛋白來同時調(diào)節(jié)肌動蛋白的多聚化和解聚，在組織的再生、重塑、創(chuàng)傷組織的愈合修復(fù)中發(fā)揮重要作用；(9)04在機(jī)體的免疫功能的維持方面也發(fā)揮著重要的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抑制胸腺素e4基因表達(dá)的RNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種shRNA，為由莖I、環(huán)和莖II形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA;所述莖I的序列如序列表的序列1所示，所述莖II的序列如序列表的序列2所示。所述shRNA中，所述莖I的序列可如序列表的序列1所示，所述莖II的序列可如序列表的序列2所示，所述環(huán)可為如下所示5'-UUCAAGAGA-3，。所述shRNA具體可如序列表的序列3、序列表的序列7或序列表的序列9所示。本發(fā)明還保護(hù)所述shRNA的編碼序列。所述shRNA的編碼序列中，所述莖I的編碼序列可如序列表的序列4所示，所述莖II的編碼序列可如序列表的序列5所示。所述shRNA的編碼序列中，所述莖I的編碼序列可如序列表的序列4所示，所述莖II的編碼序列可如序列表的序列5所示，所述環(huán)的編碼序列可為如下所示5'-TTCAAGAGA-3'。所述shRNA的編碼序列具體可如序列表的序列6、序列表的序列8或序列表的序列IO所示。本發(fā)明還保護(hù)一種作用于胸腺素^基因(Thymosin^)的小干擾RNA，為由序列表的序列1和序列表的序列2組成的雙鏈RNA。含有所述shRNA的編碼序列的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為如下a)或b):a)將所述shRNA的編碼序列導(dǎo)入pGCsi-U6/Neo/GFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體；b)將所述shRNA的編碼序列導(dǎo)入pGCSIL-GFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還保護(hù)一種重組慢病毒，是將b)所述的重組表達(dá)載體與pHelper1.0載體和pHelper2.0載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞得到的重組慢病毒。所述哺乳動物細(xì)胞具體可為293T細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或侵襲的藥物，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種所述shRNA、所述shRNA的編碼序列、所述小干擾RNA，所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒和所述重組慢病毒。所述腫瘤細(xì)胞具體可為U20S細(xì)胞。本發(fā)明同時保護(hù)如下物質(zhì)中的至少一種在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或侵襲的藥物中的應(yīng)用所述shRNA、所述shRNA的編碼序列、所述小干擾RNA，所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒和所述重組慢病毒。所述腫瘤細(xì)胞具體可為U20S細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制細(xì)胞中胸腺素04基因表達(dá)的藥物，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種所述shRNA、所述shRNA的編碼序列、所述小干擾RNA，所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒和所述重組慢病毒。所述細(xì)胞具體可為293T細(xì)胞或U20S細(xì)胞或原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。本發(fā)明同時保護(hù)如下物質(zhì)中的至少一種在制備抑制細(xì)胞中胸腺素34基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用所述shRNA、所述shRNA的編碼序列、所述小干擾RNA，所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒和所述重組慢病毒。所述細(xì)胞具體可為293T細(xì)胞或U20S細(xì)胞或原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。用本發(fā)明構(gòu)建的pGC-shTP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U20S，T04的表達(dá)明顯減少，抑制率為48%(P〈0.001)，pGC-shTe4質(zhì)粒能明顯地抑制U20S細(xì)胞的侵襲、增殖，侵襲抑制率為75%(P<0.05)，增殖抑制率在72h、96h、120h分別為40.0%、33.8%、28.0%(p<0.05)。本發(fā)明構(gòu)建的pGC-LV可用于制備干擾慢病毒，干擾慢病毒感染人原代成纖維細(xì)胞的感染率有所提高，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選培養(yǎng)后感染陽性細(xì)胞達(dá)99%。5圖l為雙鏈DNAoligO退火的凝膠成像圖；1#:單鏈對照；2#:雙鏈對照；3tt:DNA序列甲雙鏈DNAoligo;4#:DNA序列乙雙鏈DNAoligo。圖2為pGCsi-U6/Neo/GFP質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜；特征如下U6promoter:6035-6380Polylinker:1-24CMV'promoter:63-662GFP:667-1386SV40promoter:2056-2433Neomycin:2461-3255pUCori:3492-4660Ampicilliii:4763-5617Polylinker:BamHIAsp7181KpnlHindIII°圖3為pGC-shTP質(zhì)粒的PCR鑒定圖；ltt:陰性對照(ddH20);2#:marker;5，3，2，1.5，1Kb，750，500，250，100bp;3#:空載體對照；4tt-6#:陽性克隆抽提得到的質(zhì)粒。圖4為pGC-shT卜的測序結(jié)果。圖5為轉(zhuǎn)染24h后顯微鏡下觀察U20S綠色熒光蛋白表達(dá)(X200);A:pGC-shT^組(熒光視野)；B:pGC-shT^組(普通視野)；C:NC組(熒光視野)；D:NC組(普通視野)。圖6為RT-PCR結(jié)果圖；1:pGC-shTh組；2:PBS組；3:NC組。圖7為轉(zhuǎn)染后的U20S細(xì)胞的Thymosin蛋白表達(dá)(DAB，X200);A:NC組；B:PBS組；C:pGC-shT04組。圖8為U20S細(xì)胞肌動蛋白形態(tài)及分布的LSCM觀察；A:NC組；B:PBS組；C:pGC-shTP4組；紅色熒光示F-actin，綠色熒光示G-actin，merge為兩者合成。圖9為轉(zhuǎn)染后U20S細(xì)胞的增殖曲線。圖10為Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色顯示穿膜U20S細(xì)胞(X100);A:NC組；B:PBS組；C:pGC-shTp4組。圖11為轉(zhuǎn)染后U20S細(xì)胞FCM檢測細(xì)胞周期變化情況；A:NC組；B:PBS組；C:pGC-shTP4組。圖12為WesternBlot檢測pFAK(Try385)及FAK含量；1:pGC-shT34組；2:PBS組；3:NC組。圖13為pGCSIL-GFP質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜；特征如下亂1W5"1《8cPFT:W59"，trnncHIV-L3一UR:5S28墨5703鵬2"in:5755"6374AupLcillin;(5529-7389圖14為pGC-LV質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果；1:陰性對照(ddH20);2:pGCSIL-GFP空載體；3:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；4-6:陽性克隆。圖15為pGC-LV的測序結(jié)果。圖16為pHelper1.0載體圖譜。圖17為pHelper2.0載體圖譜。圖18為293T細(xì)胞感染LV-shTMSB4后TMSB4蛋白的表達(dá)變化(DAB，X200);A:空白對照；B陰性對照；C:LV-shTMSB4;個所示為TMSB4蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞。圖19為LV-shTMSB4感染的人成纖維細(xì)胞(流式細(xì)胞儀分選，X200);A:普通光顯微鏡下；B:熒光顯微鏡下；白箭頭所示為表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)染LV-shTMSB4成功的成纖維細(xì)胞。圖20為感染后的人原代成纖維細(xì)胞TMSB4的蛋白表達(dá)變化(DAB，X400);A:空白對照；B:陰性對照；C:LV-shTMSB4;個為TMSB4染色陽性的成纖維細(xì)胞。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實(shí)施例1、Thymosin04shRNA載體的制備一、RNA干擾序列(siRNA)DNA的設(shè)計(jì)在ThymosinP4mRNA(醒—021109，全長656bp)上選取一個擬干擾的位點(diǎn)，依據(jù)mRNA空間的可接觸性和siRNA3'的解鏈活性要高于5'的原則，合成一對互補(bǔ)DNA(SDS505)如下5'-AAGAGGTTGGATCAAGTTTAA-3，；5'-TTAAACTTGATCCAACCTCTT-3，。作為對照，合成一對互補(bǔ)DNA(NC)如下5'—TTCTCCGAACGTGTCACGT—3';5，-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3，。二、合成DNA序列甲和DNA序列乙DNA序列甲3，(序列表的序列8);其中自5'末端第7至27位核苷酸為SDS505的一條DNA鏈(序列表的序列4)，自5'末端第28至36位核苷酸為loop序列，自5'末端第37至57位核苷酸為SDS505的另一條DNA鏈(序列表的序列5)。DNA序列乙3';其中自5，末端第7至25位核苷酸為NC的一條DNA鏈，自5，末端第26至34位核苷酸為loop序列，自5'末端第35至53位核苷酸為NC的另一條DNA鏈。三、雙鏈DNAoligo制備將DNA序列甲及其互補(bǔ)序列(或DNA序列乙及其互補(bǔ)序列)進(jìn)行退火反應(yīng)，反應(yīng)體系如下DNAoligo(sense)(1Pg/W)畫oligo(antisense)(1Pg/W)5XUniversalBuffer20WddH20_^_總體積體系混勻，9(TC溫育4min，7(TC溫育10min，緩慢冷卻至室溫。3、12%非變性PAGE凝膠檢測雙鏈形成效率凝膠成像圖見圖l，可見雙鏈退火正確。四、shRNA載體的構(gòu)建和鑒定1、BamHI和HindIII酶切pGCsi—U6/Neo/GFP質(zhì)粒(圖2)(上海吉凱基因技術(shù)有限公司，目錄號SI022)以使其線性化。2、將線性化的pGCsi-U6/Neo/GFP質(zhì)粒與步驟三制備的雙鏈DNAoligo于4°C，連接12h。3、用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a。4、用步驟2得到的連接液轉(zhuǎn)化步驟3得到的感受態(tài)細(xì)胞。5、挑取陽性克隆溶于10WLB，混勻取作為模板，用如下引物進(jìn)行PCR鑒定上游引物5,-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3，；下游引物5，-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3'。連接入DNA序列甲的陽性克隆PCR片段大小應(yīng)為350bp。陽性克隆抽提質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見圖3，結(jié)果表明獲得了正確的重組質(zhì)粒。將PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了正確的重組質(zhì)粒。將含有DNA序列甲的重組質(zhì)粒命名為pGC-shT0質(zhì)粒，將含有DNA序列乙的重組質(zhì)粒命名為NC質(zhì)粒(對照質(zhì)粒)。實(shí)施例2、pGC-shTP4對U20S細(xì)胞功能的影響本實(shí)施例中，數(shù)據(jù)以"均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差"表示，數(shù)據(jù)兩兩比較方差齊時，用SPSS13.0軟件做單因素方差分析，LSD法兩兩比較(半定量RT-PCR、MTT及WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用)；方差不齊時，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)兩兩比較采用Nemenyitest法(細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測T^蛋白的表達(dá)結(jié)果采用)或用SPSS13.0軟件中Games-Howell法分析(Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞計(jì)算結(jié)果)；P〈0.05時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨腫瘤細(xì)胞系U20S:中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號TCHu88。一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分三組實(shí)驗(yàn)組(PGC-shT^組)，陰性對照組(NC組，用NC質(zhì)粒代替pGC-shTP4質(zhì)粒)和空白對照組(PBS組，用PBS代替pGC-shTP4質(zhì)粒)，每組細(xì)胞每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1、質(zhì)粒抽提用Qiagen公司的質(zhì)粒中量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)9切酶BamHI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，陽性克隆送北京諾賽生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。質(zhì)粒提取后各組的OD260/OD280的值在1.6-2.0之間，濃度在0.6-0.9化/W之間。pGC-shT^質(zhì)粒的測序結(jié)果見圖4，所攜帶的DNA與DNA序列甲完全吻合。2、轉(zhuǎn)染采用Invitrogen公司的LipofectamineLTXandPLUSReagents將pGC-shT0J舜時轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)20S細(xì)胞，具體步驟如下①取生長良好、融合度在80-90%的U20S細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基上清液，加2mlPBS洗兩次，去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞生長代謝物。②加入lml胰酶(0.25%)室溫消化，光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞回縮變圓，透過性增強(qiáng)，即可終止消化。③棄去胰酶，加3-4ral完全培養(yǎng)基(高糖DMEM+10。/。FBS)小心吹打均勻，注意吹打力度不能傷及細(xì)胞。收集培養(yǎng)基，800rmp離心5min，傾去上清液，用無青霉素和鏈霉素含10%FBS培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。④將細(xì)胞接種于直徑為60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)為5X106。⑤接種的細(xì)胞培養(yǎng)24h，使其融合度達(dá)70-80%。⑥按Invitrogen公司的LipofectamineLTXandPLUSReagents轉(zhuǎn)染i式劑的說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制如下無血清無雙抗的lOOiUDMEM培養(yǎng)基中加入pGC-shTp4質(zhì)粒6.25ixg，PLUSReagents6.25U1，室溫孵育5min;加入LipofectamineLTX15.6ul，室溫下孵育30min。⑦將孵育好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢滴加入培養(yǎng)皿中，邊滴加邊晃動培養(yǎng)皿，使復(fù)合物分布均勻。⑧將細(xì)胞重新送入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后將無血清的培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，24h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況并拍照(見圖5)，估計(jì)轉(zhuǎn)染效率。pGC-shT^組和NC組轉(zhuǎn)染24h后，在胞核胞漿中大量的綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率大約為80%左右，而PBS組則未見綠色熒光蛋白表達(dá)。二、轉(zhuǎn)染后的檢測1、半定量RT-PCR檢測ThymosinP4mRNA表達(dá)將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞平均重鋪于六孔板的3個孔中，再培養(yǎng)24h后提取細(xì)胞總RNA。將提取得到的細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR(內(nèi)參為GAPDH)。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊j^糖凝膠電泳。利用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描每個目的條帶的紫外光吸收量。測算每個標(biāo)本擴(kuò)增的目的條帶的紫外光吸收量值與其相應(yīng)內(nèi)參照基因(GAPDH)條帶的紫外光吸收量值的比值(R)，代表該樣本細(xì)胞目的基因mRNA的相對表達(dá)量。RT-PCR的結(jié)果見圖6，PBS組和NC組T04明顯表達(dá)。通過凝膠成像系統(tǒng)分析比較PBS組、NC組、pGC-shTP4的R值分別是0.669±0.03、0.661±0.02、0.341±0.03(F=265.168，P<0.001);pGC-shTP4組TP4的表達(dá)較NC組明顯減少，抑制率為48%，有顯著性差異；PBS組和NC組無差異；GAPDH表達(dá)在各組中沒有顯著性差異，說明pGC-shTP4質(zhì)粒對TP4的抑制作用是特異的。2、細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測T^蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染48h后分別將3組細(xì)胞制作細(xì)胞爬片。細(xì)胞爬片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，Oly即usSH-2光學(xué)顯微鏡觀察、攝像(見圖7)，并用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對細(xì)胞爬片的平均光密度進(jìn)行分析。抑制效率=(NC組平均光密度值-pGC-shTe4組平均光密度值)/NC組平均光密度值x100。/。。U20S細(xì)胞貼壁生長，呈多角形或短梭形，胞核大，有的細(xì)胞有多個核；棕黃色的免疫陽性反應(yīng)物質(zhì)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核(圖7的箭頭所示)，主要是胞漿著色。NC組、PBS組、pGC-shTP4組的平均光密度值分別為0.114±0.02、0.109±0.02、0.036±0.01;pGC-shTP4組與NC組相比，差別具有顯著性(X2=805.3，P〈0.001);NC組和PBS組相比，無顯著性差別；與NC組相比，pGC-shTP4組抑制率為68.4%。3、激光共聚焦顯微鏡觀察肌動蛋白①轉(zhuǎn)染后48h分別將三組細(xì)胞分別消化，重鋪于置有蓋玻片的24孔板里，第二天細(xì)胞保持單個狀態(tài)為佳；②取出蓋玻片，37。C預(yù)溫的PBS沖洗三次；4%多聚甲醛室溫固定10min，PBS洗三次，每次3min;③除去PBS，0.1%TritonX-100室溫下打孔5min;④PBS沖洗三次，每次5min;滴加1%的BSA室溫下封閉30min;⑤每個蓋玻片滴加200y1包含有AlexaFluor488DNaseI和Rhodaminephallotoxin熒光染色液，濃度分別為9Pg/ml、5U/ml，室溫下避光孵育30min;⑥PBS沖洗三次，每次5min;⑦甘油PBS=1:1(體積比)溶液封片，上機(jī)觀察。轉(zhuǎn)染后72h激光共聚焦顯微鏡觀察各組肌動蛋白的形態(tài)及分布，如圖8。各組細(xì)胞F-actin在細(xì)胞周邊形成較明顯的外周致密帶(如圖8箭頭所示)，A組和B組的胞漿內(nèi)可見少量的呈纖維狀排列的應(yīng)力纖維；轉(zhuǎn)染72h后，細(xì)胞外周致密帶依然存在，胞漿內(nèi)的應(yīng)力纖維明顯增多；G-actin在NC組和PBS組中彌散分布于細(xì)胞胞漿和胞核中；轉(zhuǎn)染pGC-shT^后G-actin依然呈彌散分布，但有向核內(nèi)聚集的趨勢。4、MTT法檢測細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)染48h后消化細(xì)胞，細(xì)胞96孔板鋪板，連續(xù)4d通過MTT法檢測細(xì)胞的增殖。結(jié)果見表1和圖9。第48小時，三組間增殖情況沒有明顯的差異，隨后pGC-shT^組逐漸出現(xiàn)抑制現(xiàn)象72h抑制率最高(達(dá)40。zO，然后逐漸降低，到120h時為28。/0。表1轉(zhuǎn)染pGC-shTP4后U20S細(xì)胞的增殖變化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*與NC組相比P〈0.05。5、細(xì)胞侵襲力測定①0.25。/。胰酶消化細(xì)胞，離心，用O.1。/oFBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5X107ml;②ECM膠和無血清培養(yǎng)基按1:1(體積比)混合，60W體積加入Transwell(膜上孔徑為8陶)上室中，置37。C培養(yǎng)箱4h，使膠完全凝固；③實(shí)驗(yàn)前一小時，Transwell上室加入200u10.1%FBS培養(yǎng)基，下室加600W的10%FBS培養(yǎng)基置培養(yǎng)箱中水化膠；水化完后，小心吸去上室培養(yǎng)基，每孔加①中的細(xì)胞懸液100W，下室用10。/oFBS培養(yǎng)基趨化；⑤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后，PBS洗膜三次，4%多聚甲醛固定15min,PBS洗三次，每次3min;擦去上室一側(cè)未穿過去的細(xì)胞；⑥室溫下自然風(fēng)干膜，0.1%結(jié)晶紫染膜30rain;⑦計(jì)數(shù):200倍光學(xué)顯著鏡下選擇濾膜6個不同視野，計(jì)數(shù)每個視野穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)間接代表細(xì)胞的侵襲能力。轉(zhuǎn)染后的侵襲抑制率=(1-pGC-shTe4組平均細(xì)胞侵襲數(shù)/NC組平均細(xì)胞侵襲數(shù))xlOO%。ECM膠可模擬天然基膜，在聚碳酸酯膜上形成薄層膠凍狀物，封閉聚碳酸酯上的小孔，具有蛋白水解能力的腫瘤細(xì)胞才能穿過，由此來模擬體內(nèi)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)染48h后的圖片見圖10。pGC-shT^組細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯少于對照組(紫色即為穿膜的細(xì)胞，圖中箭頭所示)；NC組、PBS組、pGC-shT04組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為51.5土7.5、51.1±5.8、12.7土1.6;pGC-shT卜組與NC組比較具有顯著性差異(X2=8.9，P〈0.05)，侵襲抑制率為75%;Thymosin^基因的表達(dá)下調(diào)使細(xì)胞的侵襲能力受到抑制。6、細(xì)胞周期檢測轉(zhuǎn)染96h后，檢測細(xì)胞周期，步驟如下①細(xì)胞密度約為80。/o時，0.25%胰酶消化細(xì)胞，2000rpm，離心5min收集細(xì)胞；②PBS洗滌細(xì)胞一次，2000rpm，離心5min，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107ml;③制備的單細(xì)胞懸液用70%乙醇固定，4匸保存，染色前用PBS洗去固定液；加100WRNaseA37。C水、浴30min;⑤再加入400WPI染色混勻，4。C避光30min;⑥流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)本，用細(xì)胞周期分析軟件記錄每組細(xì)胞的G。/G,期、S期和G2/M期所占的百分比。結(jié)果見圖11。NC組、PBS組、pGC-shT04組細(xì)胞S期所占的比例分別為28.65%、30.28%、33.95%。7、FAK及其磷酸化水平的檢測轉(zhuǎn)染96h后，提取總蛋白，BCA法蛋白定量。1、磷酸化FAK的檢測SDS-PAGE分離蛋白，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜在TBS中漂洗一下，放入裝有5%脫脂奶粉的平皿中，室溫下輕搖lh。將硝酸纖維素膜放入小皿中，加入適量的按l:IOOO稀釋的磷酸化FAK兔抗人一抗(液體加入量按O.lml/cm2)，置4X:搖動過夜。取出硝酸纖維素膜，用TBST漂洗膜三次，每次5min;將硝酸纖13維素膜重新放入小皿中，加入適量的按l:10000稀釋的紅外染料IRDye800CWConjugatedGoatAnti-RabbitIgG(Lincoln,USA;目錄號926-32211)標(biāo)記的羊抗兔二抗(液體加入量按O.lml/cm2)，室溫下避光水平搖動lh;取出硝酸纖維素膜用TBST避光下漂洗3次，每次IOmin;取出膜置于Odyssey成像系統(tǒng)中在800Mm光下掃描成像，分析各條帶的灰度值，同時各組設(shè)GAPDH作為內(nèi)參。2、總FAK檢測取出硝酸纖維素膜置于膜再生液(普利萊公司)中，使再生液完全浸沒膜，室溫下輕搖，洗脫膜上結(jié)合的磷酸化FAK的一抗和二抗，重新掃描確保洗脫干凈。將轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜在TBS中漂洗一下，放入裝有5%脫脂奶粉的平皿中，室溫下輕搖lh。將硝酸纖維素膜放入小皿中，加入適量的按l:IOOO稀釋的FAK兔抗人一抗(液體加入量按O.lml/cm2)，置4。C搖動過夜。取出硝酸纖維素膜，用TBST漂洗膜三次，每次5min;將硝酸纖維素膜重新放入小皿中，加入適量的按l:10000稀釋的IRDye800CWConjugatedGoatAnti-RabbitIgG標(biāo)記的羊抗兔二抗(液體加入量按O.lml/cm2)，室溫下避光水平搖動lh;取出硝酸纖維素膜用TBST避光下漂洗3次，每次10min;取出膜置于Odyssey成像系統(tǒng)中在800to光下掃描成像，分析各條帶的灰度值，同時各組設(shè)GAPDH作為內(nèi)參。以總FAK或磷酸化FAK灰度值/GAPDH的灰度值作為目的蛋白的相對表達(dá)量做統(tǒng)計(jì)。對于FAK(Tyr397)的磷酸化水平，NC組、PBS組、pGC-shT04組分別是15.0%、13.6%、5.0%，pGC-shTP4組與NC組相比減少66.7%(F=43.175，P<0.05，圖12)，三組間FAK的含量(NC組、PBS組、pGC-shTP4組分別是0.113±0.01、0.117±0.01、0.124±0.020)沒有明顯的變化。實(shí)施例3、胸腺素34RNA干擾慢病毒載體制備一、根據(jù)實(shí)施例1的步驟一設(shè)計(jì)的RNA干擾序列(siRNA)DNA合成DNA序列丙和DNA序列丁如下DNA序列丙(序列表的序列10);其中自5'末端第5至25位核苷酸為SDS505的一條DNA鏈(序列表的序列4)，自5'末端第26至34位核苷酸為loop序列，自5'末端第35至55位核苷酸為SDS505的另一條DNA鏈(序列表的序列5)。DNA序列丁其中自5'末端第5至23位核苷酸為NC的一條DNA鏈，自5'末端第24至32位核苷酸為loop序列，自5，末端第33至51位核苷酸為NC的另一條DNA鏈。二、雙鏈DNAoligo制備同實(shí)施例1的步驟三。三、shRNA載體的構(gòu)建和鑒定1、AgeI和EcoRI酶切pGCSIL-GFP質(zhì)粒(圖13，上海吉凱基因技術(shù)有限公司，目錄號SI019)。2、將線性化的pGCSIL-GFP質(zhì)粒與步驟二制備的雙鏈DNA0ligo于4"，連接12h。3、用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a。4、用步驟2得到的連接液轉(zhuǎn)化步驟3得到的感受態(tài)細(xì)胞。5、挑取陽性克隆溶于10WLB，混勻取作為模板，用如下引物進(jìn)行PCR鑒定上游引物5，-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3，；下游引物5，-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'。連接入DNA序列丙的陽性克隆PCR片段大小為343bp。陽性克隆質(zhì)粒抽提瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖14，結(jié)果表明獲得了正確的重組質(zhì)粒。將PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序(見圖15)，測序結(jié)果表明獲得了正確的重組質(zhì)粒。將含有DNA序列丙的重組質(zhì)粒命名為pGC-LV質(zhì)粒，將含有DNA序列丁的重組質(zhì)粒命名為NC2質(zhì)粒(對照質(zhì)粒)。實(shí)施例4、胸腺素04RNAi慢病毒顆粒的制備和應(yīng)用本實(shí)施例中每組設(shè)3個重復(fù)，每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用S土S表示。應(yīng)用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理。實(shí)時定量PCR數(shù)值分析采用2—""分析法，單因素方差分析組間差異，數(shù)據(jù)兩兩比較釆用LSD法；細(xì)胞免疫化學(xué)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)兩兩比較釆用Nemenyitest法；P〈0.05時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一、胸腺素04RNAi慢病毒顆粒的包裝、收獲及濃縮實(shí)施例3制備的pGC-LV質(zhì)粒20yg，pHelper1.0載體(見圖16，上海吉凱基因技術(shù)有限公司，目錄號SI029)15ug，pHelper2.0載體(見圖17,上海吉凱基因技術(shù)有限公司，目錄號SI030)10yg用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，8h后換成新鮮的含10。/。血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，48h后收集細(xì)胞上清液(含有胸腺素34RNAi慢病毒，將其命名為重組慢病毒LV-shTMSB4)，過濾，分裝，-8(TC長期保存?zhèn)溆?，利用逐孔稀釋法測定病毒滴度。病毒滴度為2E+9TU/ml。用NC2質(zhì)粒代替pGC-LV質(zhì)粒，制備對照病毒，方法同上。二、慢病毒感染293T細(xì)胞感染前一天，293T細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號GNHul7)用無青、鏈霉素的含10%血清的培養(yǎng)基鋪板于6孔板中，每孔l乂105個細(xì)胞。293T細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(感染LV-shTMSB4，M0I=50)、陰性對照組(用對照病毒代替LV-shTMSB4，M0I=50)及空白對照組(用PBS代替LV-shTMSB4)。12h后換成含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞是否表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功，以表達(dá)GFP的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。鏡下可見293T細(xì)胞為鋪路石樣。實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組的細(xì)胞都能夠表達(dá)GFP，顯示較強(qiáng)的綠色熒光，5d左右熒光最亮，感染效率達(dá)85%以上。三、病毒感染后293T細(xì)胞中TMSB4基因mRNA檢測實(shí)施例二的293T細(xì)胞，感染病毒5天后，根據(jù)Invitrogen公司的Trizol操作說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說明書使RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按下列比例配置PCR反應(yīng)體系SYBRpreraixturelO上游引物(5MM)0.5W;下游引物(5MM)0.5W;cDNA1.0W;雙蒸水8.0W。其中內(nèi)參Actin的上下游引物分別是5，-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3，和5，-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3，(PCR產(chǎn)物長度為202bp)，TMSB4的上下游引物分別是5，-AAGAAACGATTGAACAGGAGAAG-3，和5，-AGATAGATAGACAGATGGGAAA-GG-3，(PCR產(chǎn)物長度為232bp)。實(shí)時定量PCR儀(ABI3733型，美國)上機(jī)設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-TimePCR:預(yù)變性95。C，15S;之后每一步變性95。C，5S;退火延伸60°C，30S;共進(jìn)行45個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結(jié)束后，95"C變性lmin，然后冷卻至55t:，16使DNA雙鏈充分結(jié)合。從55。C開始到95。C，每一步增加0.5。C，保持30S，同時讀取吸光值，用以制作熔解曲線。實(shí)時定量PCR的熔解曲線表現(xiàn)為單一峰，說明是特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組的2—""結(jié)果分別為0.56±0.11、1.22±0.13、l.OO士O.06，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組相比明顯下降，敲減率為44%(n=9，F(xiàn)=89.673，P<0.01)。四、病毒感染后293T細(xì)胞中TMSB4基因蛋白水平的檢測實(shí)施例二的293T細(xì)胞，感染病毒5天后，進(jìn)行免疫化學(xué)染色(TMSB4抗體和PV6001試劑盒的說明進(jìn)行)。DAB顯色5分鐘，脫水，封片。顯微鏡(01y即usSH2，日本)鏡下觀察，每張?jiān)?00倍下隨機(jī)取五個視野，應(yīng)用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對平均光密度進(jìn)行測量。細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果見圖18，在空白對照和陰性對照細(xì)胞中，細(xì)胞核、細(xì)胞漿均呈現(xiàn)深染的棕黃色陽性信號，不同細(xì)胞深棕色、咖啡色著色不等。實(shí)驗(yàn)組胞質(zhì)、胞核染色程度明顯淺染。感染病毒以后，實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白對照組的平均光密度分別為0.042±0.007、0.093±0.009、0.090±0.010(n二9，H二461.342，P〈0.001)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TMSB4蛋白表達(dá)比陰性對照組明顯減少55%(X2=805.289，P〈0.001)。五、慢病毒感染原代成纖維細(xì)胞人正常皮膚成纖維細(xì)胞源自美容手術(shù)廢棄的皮膚以常規(guī)組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)并傳代，所用皮膚標(biāo)本是在患者知情同意下從北醫(yī)三院成形外科門診取材。取一例第六代成纖維細(xì)胞進(jìn)行病毒感染。細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(感染LV-shTMSB4，M0I=50)、陰性對照組(用對照病毒代替LV-shTMSB4，MOI=50)及空白對照組(用PBS代替LV-shTMSB4)。方法同步驟二。感染病毒5天后，熒光顯微鏡鏡下觀察GFP的表達(dá)情況判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染率(見圖19)。感染2周后，采用流式細(xì)胞儀(MoFlo，美國)分選綠色熒光蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，免疫組化染色檢測成纖維細(xì)胞中TMSB4蛋白的表達(dá)(見圖20)。原代成纖維細(xì)胞在鏡下呈長梭形有突起。原代成纖維細(xì)胞感染病毒經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后，與對照組相比細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，胞體較大，細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)的陽性率達(dá)99%。細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果顯示，在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均有棕黃色陽性顆粒表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞的TMSB4染色陽性信號明顯比兩個對照組減弱。序列表〈110〉北京大學(xué)第三醫(yī)院<120〉抑制胸腺素P4基因表達(dá)的RNA及其應(yīng)用<130〉CGGNARY92391<160>10<210〉1<211>21<212〉RNA<213〉人工序列<220〉<223><400>1aa_g3gguuggmjc3aguuuaa<210>2<211>21〈212>RNA<213〉人工序列<220〉<223〉18<400〉2uuaa^cuug3ucca_3ccucuu21<210〉3<211〉51<212〉RNA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400>3肌gagguuggmicaaguuu3auucaagagauu犯gicuug3ucca^accucuu51<210>4<211>21〈212〉腿〈213>人工序列<220〉〈223〉〈400〉4aagaggttggatcaagtttaa21<210>5〈211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉<400〉5ttaaacttgatccaacctctt21〈210〉6〈211>51〈212〉薩<213〉人工序列<220><223〉〈400〉6aagaggttggatcaagtttaattcaagagattaaacttgatccaacctctt51<210>7<211>66<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉7gaucccaagagguuggaucaaguuuaauucaagagauimaacuugauccaaccucuuuuu60uuggau66〈210〉<211><212>〈213〉866DNA人工序列<220〉<223〉<400〉8gatcccaagaggttggatcaagtttaattcaagagattaaacttgatccaacctcttttt60ttggat66〈210〉〈211〉〈212〉<213>961腿人工序列<220〉〈223〉〈400〉9ccgg犯g3gguuggmic肌guuuaauuc犯g3gamia^3cuugaAacc肌ccucuuuuuuu6061<210〉10〈211>61〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223>〈400〉10ccggaagaggttggatcaagtttaattcaagagattaaacttgatccaacctcttttttt60gGl權(quán)利要求1、一種shRNA，為由莖I、環(huán)和莖II形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA；所述莖I的序列如序列表的序列1所示，所述莖II的序列如序列表的序列2所示。2、如權(quán)利要求1所述的shRNA，其特征在于所述shRNA如序列表的序列3、序列表的序列7或序列表的序列9所示。3、權(quán)利要求1或2所述shRNA的編碼序列；所述莖I的編碼序列如序列表的序列4所示；所述莖II的編碼序列如序列表的序列5所示。4、作用于胸腺素l基因的小干擾RNA,為由序列表的序列1和序列表的序列2組成的雙鏈RNA。5、含有權(quán)利要求3所述編碼序列的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為如下a)或b):a)將權(quán)利要求3所述編碼序列導(dǎo)入pGCsi-U6/Neo/GFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體；b)將權(quán)利要求3所述編碼序列導(dǎo)入pGCSIL-GFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體。6、一種重組慢病毒，是權(quán)利要求5的b)所述的重組表達(dá)載體與pHelperl.O載體和pHelper2.0載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞得到的重組慢病毒。7、一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或侵襲的藥物，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種權(quán)利要求1或2所述shRNA、權(quán)利要求3所述編碼序列、權(quán)利要求4所述小干擾RNA，權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒和權(quán)利要求6所述重組慢病毒。8、如下物質(zhì)中的至少一種在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖和/或侵襲的藥物中的應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述shRNA、權(quán)利要求3所述編碼序列、權(quán)利要求4所述小干擾RNA，權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒和權(quán)利要求6所述重組慢病毒。9、一種抑制細(xì)胞中胸腺素64基因表達(dá)的藥物，它的活性成分為如下物質(zhì)中的至少一種權(quán)利要求1或2所述shRNA、權(quán)利要求3所述編碼序列、權(quán)利要求4所述小干擾RNA，權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒和權(quán)利要求6所述重組慢病毒。10、如下物質(zhì)中的至少一種在制備抑制細(xì)胞中胸腺素34基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述shRNA、權(quán)利要求3所述編碼序列、權(quán)利要求4所述小干擾RNA，權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒和權(quán)利要求6所述重組慢病毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種抑制胸腺素β₄基因表達(dá)的RNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的shRNA，為由莖I、環(huán)和莖II形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA；所述莖I的序列如序列表的序列1所示，所述莖II的序列如序列表的序列2所示。應(yīng)用本發(fā)明的RNA可以構(gòu)建重組質(zhì)粒和重組慢病毒，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖，并可以顯著抑制細(xì)胞中胸腺素β₄基因的表達(dá)，從而可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和藥學(xué)，具有深遠(yuǎn)意義。文檔編號C12N15/11GK101591657SQ200910088568公開日2009年12月2日申請日期2009年7月6日優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日發(fā)明者暢劉,秦澤蓮,黃似建申請人:北京大學(xué)第三醫(yī)院