專利名稱：昆蟲病原線蟲共生菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲病原線蟲共生菌及其應(yīng)用，特別涉及一種昆蟲病原線蟲共生 菌及其在生產(chǎn)殺蟲和/或殺卵劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
昆蟲病原線蟲共生菌是存在于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的一類革蘭氏陰性細(xì)菌， 屬腸桿菌禾斗(Enterobacteriaceae) (Hominick WM. Wallingford:CABI Publishing UK, 2002. 266-264)，包括致病桿菌屬(Xenorhabdus)和光桿狀菌屬(Photorhabdus)，其分別與 斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)的線蟲共生(Chalabaev S.，Turlin E.，Bay S.，et al. Applied and Environmental Microbiology,2008,74 1717-1725 ；Forst S., Dowds B., Boemare N. , et al. Annual review of microbiogy, 1997,51 47-72.)。在自然界，此類細(xì)菌存在于3齡侵染期線蟲的腸道內(nèi)，隨著線蟲對(duì)昆蟲的侵染，共 生菌被攜帶到昆蟲體內(nèi)并釋放到寄主血腔中，共生菌在昆蟲血腔中大量繁殖，產(chǎn)生毒素，在 48h之內(nèi)就能殺死寄主昆蟲。此外，共生菌也能分解昆蟲組織，并產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，為線蟲 的生長與繁殖提供營養(yǎng)和良好的環(huán)境。線蟲經(jīng)幾代的繁殖，侵染期線蟲攜帶著共生菌從寄 主昆蟲尸體內(nèi)鉆出，重新尋找新寄主。昆蟲病原線蟲共生菌在離體人工培養(yǎng)時(shí)，也能夠產(chǎn)生多種物質(zhì)。隨著對(duì)昆蟲病原 線蟲共生菌研究的不斷深入，這些產(chǎn)物的功能亦不斷被發(fā)現(xiàn)(Webster J. Μ. et al.，(2002) Bacterial Metabolites. In :Gaugler, R. (Ed·), Entomopathogenic Nematology. CAB International, Wallingford UK, pp99_lll.)。共生菌產(chǎn)生多種抗生素，對(duì)多種動(dòng)植物及 人類病原菌有廣泛的抑菌活性(楊懷文，張志明，楊秀芬等.中國生物防治，2000，16(3) 111-113 ；楊秀芬，楊懷文，簡恒.大豆科學(xué)，2002，24(1) =52-55.) 0共生菌可分泌產(chǎn)生一 些抗腫瘤物質(zhì)，對(duì)人類多種腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，為研制抗癌新藥物提供了新材料 (Jarosz J. Parasitology，1996，112 =545-552 ；呂秋軍，簡恒，劉衛(wèi)京等·中國新藥雜志， 2002,11 850-852 ；Paik S. , Park S.，et al.，Bull koreanchem. Soc 2001，22 :372_374)。 某些昆蟲病原線蟲共生菌可以產(chǎn)生對(duì)昆蟲具有口服殺蟲活性的Tc或Xpt蛋白毒素等 (Bowen D,Rocheleau T. A. ,Blackburn Μ. ,et al. Science, 1998,280 :2129_2132 ；Morgan, J. A. W. ,Sergeant,Μ. ,Ellis,D.,Ousley, M. and Jarrett,P. Appilied and Environmental Microbiology,2001,2062-2069 ；ffench-Constant, R. H. ， Dowling A.and Waterfield N. R. TOXicOn，2007，49，436-451.)，共生菌口服殺蟲毒素的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)生物殺蟲劑提供了 新的途徑。昆蟲病原線蟲共生菌已成為一類新型的具有開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的能夠殺蟲防 病的生物資源。所有已發(fā)表或公開的文獻(xiàn)指出，昆蟲病原線蟲的共生細(xì)菌或共生細(xì)菌分泌 的殺蟲蛋白對(duì)昆蟲有口服殺蟲活性，但是仍不清楚其殺蟲譜，特別是未發(fā)現(xiàn)這類細(xì)菌的上 清代謝產(chǎn)物具有殺昆蟲或螨類卵的活性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種昆蟲病原線蟲共生菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的昆蟲病原線蟲共生菌，為致病桿菌屬Xenorhabdus嗜線蟲致病桿菌 (Xenorhabdus nematophila)HB408。上述嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)HB408,已于2009年4月8日保 藏于中國微生物菌種保藏管委理員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝 陽區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCC Na . 3004。本發(fā)明提供的昆蟲病原線蟲共生菌的應(yīng)用是嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila) CGMCC Na . 3004在生產(chǎn)殺蟲和/或殺卵劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種殺蟲和/或殺蟲劑，該殺蟲和/或殺蟲劑的活性成分為嗜線蟲 致病桿菌CGMCC Na . 3004的發(fā)酵液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發(fā)酵液上清 液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004菌體和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的 發(fā)酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液的獲得方法為將嗜線蟲致病桿菌 CGMCC Na . 3004接種于液體培養(yǎng)基中，在28°C 30°C培養(yǎng)36 48小時(shí)得到發(fā)酵液。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液菌體的獲得方法為嗜線蟲致病桿 菌CGMCC Na . 3004接種于液體培養(yǎng)基中，在28°C 30°C培養(yǎng)36 48小時(shí)得到發(fā)酵液，然 后將發(fā)酵液過濾和/或離心得到濾渣或沉淀部分，即為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的 發(fā)酵液菌體。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液上清液的獲得方法為嗜線蟲致病 桿菌CGMCC Na . 3004接種于液體培養(yǎng)基中，在28°C 30°C培養(yǎng)36 48小時(shí)得到發(fā)酵液， 然后將發(fā)酵液過濾和/或離心得到液體部分，即為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵
液上清液。所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液上清液的乙酸乙酯萃取物的獲得 方法為嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004接種于液體培養(yǎng)基中，在28°C 30°C培養(yǎng)36 48 小時(shí)得到發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液過濾或者離心收集液體，將液體中加入乙酸乙酯萃取收集 有機(jī)相，得到嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。所述液體培養(yǎng)基為含牛肉蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L的培養(yǎng)基。上述殺蟲和/或殺卵劑中還可加入可接受的輔劑如防腐劑、粘著劑、引誘劑、保護(hù) 劑和增效劑，配制成水劑、可濕性粉劑、顆粒劑、油劑和濃縮劑等不同的劑型。上述殺蟲和/或殺卵劑是對(duì)鱗翅目昆蟲和/或鞘翅目昆蟲和/或直翅目昆蟲和/ 或膜翅目昆蟲和/或螨類的殺蟲和/或殺卵劑。本發(fā)明的嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液具有對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲的殺蟲 殺卵作用。利用該菌株的發(fā)酵液制備的殺蟲殺卵劑可用于植物表面和生長環(huán)境中，防治鱗 翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目和螨類等多種農(nóng)業(yè)害蟲。施用量和施用次數(shù)根據(jù)所防治害蟲 的發(fā)生期、發(fā)生數(shù)量以及氣候條件等而定。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)例是進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的說明，不應(yīng)當(dāng)成為對(duì)本發(fā)明的限制。
下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、嗜線蟲致病桿菌HB408菌株的獲得本發(fā)明人自1997年-2006年，利用大蠟螟誘集法從采自河北省不同地區(qū)的土樣 中分離出多個(gè)昆蟲病原線蟲品系。按下列方法分離初生型的共生細(xì)菌用昆蟲病原線蟲感 染大蠟螟5齡幼蟲，蟲體死亡后，用75% (體積百分濃度)酒精浸泡IOmin后，用無菌水沖 洗3遍，并用滅菌濾紙吸干蟲體上的水分。用滅菌鑷子將蟲體的頭和尾夾起，再用滅菌的 剪子剪去一只腹足，將流出的體液直接滴到NBTA鑒別培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂45g，氯化三本基 四氮唑0.04g，溴百里酚藍(lán)0.025g，水IOOOmL, pH 7. 2-7.4)上，用接種環(huán)劃線后，放于28°C 生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h 72h時(shí)，挑取藍(lán)色單菌落為初生型共生菌。應(yīng)用生物測定的方法 對(duì)這些菌株的殺蟲活性行進(jìn)到了測定，發(fā)現(xiàn)其中HB408菌株對(duì)小菜蛾、菜粉蝶等多種供試 昆蟲的幼蟲的口服殺蟲活性最強(qiáng)。根據(jù)Akhurst (1980) (Akhurst R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. ,bacteria symbiotically associate with the instect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis[J]. Journal of General Microbiology, 1980,121 303-309)描述的方法結(jié)合部分 16s rDNA 序列測定 對(duì)HB408菌株進(jìn)行種類鑒定，確定該菌株為嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)。 其中，HB408菌株的生理生化特征如表1所示，16s rDNA序列如序列表中序列1。表1 HB408菌株主要生理生化特征 注+，陽性；-，陰性；U，奶酪色。上述致嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)HB408菌株，已于2009年4 月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國 北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCC Na . 3004。
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實(shí)施例2、嗜線蟲致病桿菌HB408菌株的口服殺蟲活性及殺蟲譜的測定將嗜線蟲致病桿菌HB408菌種劃線于NBTA培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂45g，氯化三本基四 氮唑0. 04g，溴百里酚藍(lán)0. 025g，水1000mL，pH 7. 2-7. 4)平板上，在28°C -30°C培養(yǎng)36h 48h，挑取初生型單菌落接入20mL牛肉湯培養(yǎng)基(牛肉蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水 IOOOmL, pH 7. 2-7. 4，121°C下高壓滅菌 30min)中，置于 28°C -30°C、200rpm/min 恒溫振蕩 培養(yǎng)過夜，得到種子菌液。然后將種子菌液按(體積比1 100)接菌量轉(zhuǎn)接于200mL 牛肉湯培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48h，得到的HB408發(fā)酵菌液，直接用于殺蟲活性的測定。以室內(nèi)飼養(yǎng)的云斑粉蝶、菜粉蝶、小菜蛾、楊扇舟蛾、黃翅菜葉蜂、蘋掌舟蛾、馬鈴 薯二十八星瓢蟲、東亞飛蝗、枸杞負(fù)泥蟲、蓼藍(lán)齒脛葉甲和月季葉蜂幼蟲為試蟲，采用浸葉 法進(jìn)行生測；具體方法為以上述嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004HB408菌液為處理樣品 (樣品中含0. 3%的土溫-80)，設(shè)無菌牛肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照(樣品中含0. 3%的土溫-80)， 取新鮮的寄主植物葉片在HB408發(fā)酵上清液或無菌牛肉湯培養(yǎng)基中浸漬10s，自然晾干，放 入無菌的6. 5cmX IOcm塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每盒根據(jù)試蟲大小接入5 20頭(具體蟲態(tài)如表1 所示)，置于(27士 l)°C、14h光照的生化培養(yǎng)箱中。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)不少于 20頭試蟲。每天檢查死亡蟲數(shù)，最后記錄活蟲數(shù)并稱量活蟲體重。以棉鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟、粘蟲、甘藍(lán)夜蛾和黃地老虎(具體蟲態(tài)如表1所示) 為試蟲，以嗜線蟲致病桿菌HB408發(fā)酵液為處理樣品，以無菌牛肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照。每一處 理設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24頭幼蟲。按照ImL IOg的比例將嗜線蟲致病桿菌HB408發(fā)酵 液或無菌牛肉湯培養(yǎng)基分別與各試蟲的人工飼料混合作為飼喂食物(棉鈴蟲、甘藍(lán)夜蛾、 黃地老虎和芳香木蠹蛾人工飼料配方玉米粉20g，黃豆粉10g，酵母粉9g，山梨酸0. 2g，尼 泊金0. 2g，Vc 0. 6g，復(fù)合Vb 3. 14g，蔗糖5g，瓊脂2g，無菌水IOOmL ；甜菜夜蛾人工飼料的 配方玉米粉10g，黃豆粉15g，酵母粉8g，麥麩5g，菜葉粉lg，防微靈0. 6g，干酪素0. 5g，Vc 0. 4g，復(fù)合Vb 3. 77g，紅霉素0. 006g,山梨酸0. 3g，尼泊金0. 2g，檸檬酸0. 3g，膽固醇0. Ig, 氯化膽堿0. lg，蔗糖lg，瓊脂2g，水IlOmL;玉米螟人工飼料配方玉米糝19g，酵母粉9g， 大豆糝15g，多維葡萄糖7. 5g，山梨酸0. 5g，瓊脂2g，甲醛0. 2mL，水IlOmL ；粘蟲人工飼料配 方玉米葉粉6g，黃豆粉3. 4g，酵母粉6. Sg,干酪素1. 5g，膽固醇0. 7g，抗壞血酸0. 5g，山 梨酸0. 15g，尼泊金0. 3g，復(fù)合Vb3. 93g，蔗糖2. 8g，瓊脂2. 5g，水IOOmL)，混勻后分裝于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔放一頭供試幼蟲，為防止試蟲逃逸，先覆一層保鮮膜，然后蓋上盒蓋，置于 (26士 1) °C、14h光照的生化培養(yǎng)箱中。每天記錄死亡蟲數(shù)，72h或120h時(shí)記錄活蟲數(shù)并稱 量活蟲體重。按Ig麥麩加150 μ L嗜線蟲致病桿菌ΗΒ408發(fā)酵液或無菌牛肉湯培養(yǎng)基，拌勻后 分裝入IOcmX6. 5cm的塑料養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每盒放10頭2齡黃粉蟲幼蟲，每個(gè)處理60頭，放入 (26士 1) °C、14h光照的生化培養(yǎng)箱中，每天記錄死亡蟲數(shù)，最后稱量活蟲體重。校正死亡率=(處理組死亡率_對(duì)照組死亡率)/ (1-對(duì)照組死亡率)X 100%。用上述方法對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB408發(fā)酵液的口服殺蟲活性的生測結(jié)果如表1所 示。由表2可以看出嗜線蟲致病桿菌HB408發(fā)酵液對(duì)鱗翅目、鞘翅目和膜翅目中的18種昆 蟲都顯示了一定程度的口服殺蟲活性，但是不同昆蟲對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB408的敏感性差 異比較大，小菜蛾2齡幼蟲、云斑粉蝶1齡幼蟲、馬鈴薯瓢蟲1齡幼蟲、枸杞負(fù)泥蟲2齡幼蟲、 黃翅菜葉蜂2齡幼蟲、月季葉蜂2齡幼蟲對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB408敏感性強(qiáng)，在飼毒72h時(shí)這幾種試蟲的校正死亡率均達(dá)到100 %，其次是菜粉蝶1齡幼蟲、葉甲、舟形毛蟲1齡幼蟲和 東亞飛蝗2齡蝗蝻，在飼毒72h時(shí)死亡率也達(dá)到55. 51% 91. 52%。盡管對(duì)芳香木蠹蛾、 甜菜夜蛾、棉鈴蟲、粘蟲、玉米螟、甘藍(lán)夜蛾初孵幼蟲、楊扇舟蛾2齡幼蟲和黃地老虎的致死 作用較低(0 39. 24% )，但是對(duì)這些幼蟲的生長有較高抑制作用，對(duì)活蟲的相對(duì)生長抑制 率分別為 15. 21%,93. 87%,97. 24%,52. 75%,85. 43%,68. 52%,72. 60%和 32. 53%;對(duì)黃 粉蟲也有一定的活性，處理120h時(shí)對(duì)其相對(duì)生長抑制率達(dá)到29. 39%。
表2. HB408菌株對(duì)18種昆蟲的口服胃毒活性 實(shí)施例3、嗜線蟲致病桿菌HB408的發(fā)酵液中的上清液和菌體的殺蟲活性按實(shí)施例2中的方法制備嗜線蟲致病桿菌HB408菌液，然后將部分HB408菌液在 10000r/min、4°C條件下離心15min，吸取上清經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾后得到ΗΒ408菌液上清液 備用。離心后所得沉淀加適量的PBS緩沖液(0. 02mol/L，pH為7. 4)在10000r/min、4°C離 心15min洗滌2次后，所得菌體用PBS緩沖液(0. 02mol/L,pH為7. 4)重新懸浮至與HB408 原菌液同樣的體積的菌體細(xì)胞懸液備用。
將甘藍(lán)葉片(飼喂小菜蛾幼蟲)或玉米葉片(飼喂東亞飛蝗)分別在供試HB408 菌液、HB408菌液上清液、菌體細(xì)胞懸液或無菌水(內(nèi)含0.3% (質(zhì)量含量)的土溫80，CK) 中浸漬5s，自然涼干后分別放入養(yǎng)蟲盒內(nèi)，盒內(nèi)再放入供試?yán)ハx，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè) 重復(fù)20頭幼蟲，放入(26士 1)°C、光照時(shí)間為14h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔24h檢查其死亡情 況，連續(xù)檢查3d。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明HB408菌液、HB408菌液上清液、菌體細(xì)胞懸液 對(duì)小菜蛾幼蟲和東亞飛蝗均有很高的殺蟲活性。表3嗜線蟲致病桿菌HB408菌液及其不同組分對(duì)小菜蛾的殺蟲活性(72h) 實(shí)施例4、嗜線蟲致病桿菌HB408菌液殺卵活性測定采用浸漬法檢測嗜線蟲致病桿菌HB408發(fā)酵液昆蟲卵或螨類卵的殺卵活性。實(shí)驗(yàn) 所用昆蟲的卵為新產(chǎn)1日齡的小菜蛾卵、菜粉蝶卵、山楂葉螨卵和朱砂葉螨卵，將這些蟲卵 分別在按實(shí)施例2中的方法制備嗜線蟲致病桿菌HB408菌液中浸泡5s，取出后室溫條件下 待其自然晾干，然后將其放入經(jīng)過滅菌且有透氣孔內(nèi)裝有甘藍(lán)葉的養(yǎng)蟲盒(Φ =9cm)中， 置于(25士 1) °C、14h光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)(每個(gè)重復(fù)約30粒卵)。 本實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)滅菌水和無菌牛肉湯培養(yǎng)基對(duì)照，所有供試樣品以及滅菌水和無菌牛肉湯培 養(yǎng)基對(duì)照中均加入0.3% (質(zhì)量百分含量)的土溫-80。處理后定期檢查小菜蛾、菜青蟲、 朱砂葉螨和山楂葉螨的孵化蟲數(shù)并計(jì)算孵化率。結(jié)果如表4所示，實(shí)驗(yàn)證明，用嗜線蟲致病桿菌HB408培養(yǎng)的菌液對(duì)小菜蛾、菜粉 蝶、朱砂葉螨和山楂葉螨卵有明顯的觸殺作用。120h后(表4)，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過HB408菌液處 理的小菜蛾、菜粉蝶、山楂葉螨和朱砂葉螨卵已經(jīng)全部孵化，而經(jīng)過HB408菌液處理的小菜 蛾、菜粉蝶、山楂葉螨和朱砂葉螨、卵還完全沒有孵化，孵化率分別為3. 33%U8. 33%,0% 和0%，由此可見HB408菌液對(duì)小菜蛾、菜粉蝶、山楂葉螨和朱砂葉螨卵具有很好的觸殺作 用。表4. HB408發(fā)酵液對(duì)不同卵的活性測定(120h) 實(shí)施例5、嗜線蟲致病桿菌HB408的菌液不同組分的的殺卵活性
將按照實(shí)施例3所述方法獲得的嗜線蟲致病桿菌HB408發(fā)酵上清液，用0. 45 μ m 濾膜過濾，澄清液用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，連續(xù)萃取3次，然后將有機(jī)相合并后減壓 濃縮得到萃取浸膏，用乙酸乙酯溶解后濃度為20mg/mL作為昆蟲的殺卵劑，按照實(shí)施例4所 述的方法進(jìn)行殺卵活性檢測。同時(shí)將按照實(shí)施例3所述方法獲得的嗜線蟲致病桿菌HB408 發(fā)酵液，HB408發(fā)酵上清液，HB408菌體懸液，作為殺卵劑，它們?cè)季后w積和作為殺卵劑 的體積與上述乙酸乙酯萃取得到的殺卵劑相同，進(jìn)行同樣的殺卵活性檢測。以無菌水和無 菌牛肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照。結(jié)果表5所示，結(jié)果證明，嗜線蟲致病桿菌HB408菌液的上清液用乙酸乙酯萃取 后，所得的萃取物及其各組分處理小菜蛾的卵，在96h后嗜線蟲致病桿菌HB408菌液，上清 液及其上清液的乙酸乙酯提取物使小菜蛾卵不能正常發(fā)育，孵化率分別為4. 54%,3. 33% 和0%，和對(duì)照有明顯的差異，而經(jīng)細(xì)胞處理96h孵化率為76. 51 %，可見其殺卵作用的物質(zhì) 主要存在于發(fā)酵液的上清液中，對(duì)小菜蛾的卵有明顯的抑制生長發(fā)育作用。表5. HB408發(fā)酵液各組分對(duì)小菜蛾卵的活性(96h) 序列表
<160>1
<210>1
<211>432
<212>DNA
<213>嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)
<400>1
gccagggggccgccttcgccaccggtattc ctccacatctctacgcatttcaccgctaca60
cgtggaattctacccccctctacgagactc cagccaaccagtcttggatgCCgttCCCgg120
gttaagcccggggatttcacatccaactta attgaccgcctgcgtgcgctttacgcccag180
taattccgattaacgcttgcaccctccgta ttaccgcggctgctggcacggagttagccg240
gtgcttcttctgcgggtaacgtcaatcgta agccctgttcagacttacgccttcctcccc300
gctgaaagtactttacaacccgaaggcctt cttcatacacgcggcatggctgcatcaggc360
ttgcgcccat tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 420agtcccagtg ta43權(quán)利要求
嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)CGMCC №.3004。
2.嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) CGMCC Ns . 3004在生產(chǎn)殺蟲和/或殺 卵劑中的應(yīng)用。
3.—種殺蟲和/或殺卵劑，其活性成分為嗜線蟲致病桿菌CGMCC N2. 3004的發(fā)酵 液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液上清液和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004菌體和/或嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發(fā)酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺蟲和/或殺卵劑，其特征在于所述嗜線蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發(fā)酵液的獲得方法為將嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004接種于液體培養(yǎng)基中， 在28°C 30°C培養(yǎng)36 48小時(shí)得到發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺蟲劑，其特征在于所述嗜線蟲致病桿菌CGMCCNo . 3004 的發(fā)酵液上清液和菌體的獲得方法為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004接種于液體培養(yǎng)基 中，在28°C 30°C培養(yǎng)36 48小時(shí)得到發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液過濾和/或離心，得到液體 部分即為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004的發(fā)酵液上清液，得到濾渣或沉淀部分即為嗜線 蟲致病桿菌CGMCC Na . 3004的發(fā)酵液菌體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺卵劑，其特征在于所述嗜線蟲致病桿菌CGMCCNo . 3004 的發(fā)酵液上清液的乙酸乙酯萃取物的獲得方法為嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004接種于 液體培養(yǎng)基中，在28°C 30°C培養(yǎng)36 48小時(shí)得到發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液過濾或者離心 收集液體，將液體中加入乙酸乙酯萃取收集有機(jī)相，得到嗜線蟲致病桿菌CGMCC No . 3004 的發(fā)酵液上清液的乙酸乙酯萃取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任意一項(xiàng)所述的殺蟲和/或殺卵劑，其特征在于所述液體培 養(yǎng)基為含牛肉蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種昆蟲病原線蟲共生菌及其應(yīng)用。具體該昆蟲病原線蟲共生菌，為嗜線蟲致病桿菌CGMCC №.3004。該菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵液上清液、菌體或其發(fā)酵液上清液的乙酸乙酯萃取物具有對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲的殺蟲或殺卵作用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101892170SQ20091008428
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者南宮自艷, 孔繁芳, 宋萍, 曹克強(qiáng), 王勤英 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)