專利名稱：：一種檢測傳染病病原體的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，特別是涉及檢測傳染病病原體的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：在傳染病流行的初期，準(zhǔn)確、快速、便捷地對傳染病的病原體進(jìn)行檢測，是控制傳染病流行的關(guān)鍵。雖然國內(nèi)和國際上已經(jīng)建立了傳染病的監(jiān)測系統(tǒng)，但是現(xiàn)有的檢測手段各有局限性。血清學(xué)檢查利用相應(yīng)的抗體與抗原結(jié)合檢測到病原體，此方法診斷快速，簡單、易于操作，但必須制備出針對該病原體的抗體后才能夠進(jìn)行檢測，尤其是在還沒有抗體來源的情況下不適用于傳染病的早期診斷。病原體分離法是通過直接對病原體進(jìn)行分離培養(yǎng)，檢測鑒定病原體。此方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(至少要花費(fèi)一周時間)，對實(shí)驗(yàn)室生物安全條件要求非常高，所以很難在疫情發(fā)生現(xiàn)場采用，而且不是所有的病原體都能通過病原體分離法獲得。核酸檢測技術(shù)操作簡便，反應(yīng)快速，尤其是近年來發(fā)展的實(shí)時熒光定量PCR(RealtimePCR),靈敏度高，且能夠監(jiān)控整個反應(yīng)進(jìn)程，但一直存在DNA污染造成的假陽性率高的問題，而且由于其臨界值不明顯，因此檢測結(jié)果灰區(qū)較寬，無法標(biāo)準(zhǔn)化，而且由于儀器要求高，投入大，對操作人員要求高，需要進(jìn)行專業(yè)技能培訓(xùn)，還限制了多重^r測的應(yīng)用。同時該方法對于病原體含量極低的樣本仍然無法檢測。NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA,依賴核酉^f^列的擴(kuò)增技術(shù))是一項連續(xù)、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的反應(yīng)體系包括反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H、噬菌體T7核糖核酸聚合酶和兩條特別設(shè)計的寡核苷酸引物，其上游引物3'末端與模板的末端互補(bǔ)，5，末端含有噬菌體T7的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動子序列，下游引物3'末端序列與模板的5'末端序列一致，5，末端含有與捕獲探針互補(bǔ)的序列。在擴(kuò)增起始階段，上游引物與正義RNA模板結(jié)合后，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成與靶標(biāo)RNA互補(bǔ)的反義cDNA,而原來的的RNA模板則被RnaseH降解。接著下游引物與cDNA雜交，在反轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶特性的作用下合成雙鏈cDNA,即對應(yīng)輩巴標(biāo)RNA的雙鏈cDNA拷貝。由于雙鏈cDNA—端包含有T7RNApolymerase的啟動子序列，從而誘導(dǎo)了RNA聚合酶的活性，合成大量的與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的反義RNA鏈。如此循環(huán)反復(fù)，RNA拷貝數(shù)被不斷放大。同時由于雙《連cDNA的另一末端還整合了與捕獲探針互補(bǔ)的序列，因此所產(chǎn)生的互補(bǔ)RNA又能特異的結(jié)合捕獲探針，以用于下一步的檢測。"—酶連接寡核苷酸捕獲技術(shù)原理是NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物首先特異性地與捕獲探針一端結(jié)合，后者的另一端能固定連接在微孔板上，然后加入病原體特異性檢測探針及反應(yīng)底物，檢測產(chǎn)生的比色信號，這一檢測讀數(shù)與RNA的擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，以此來檢測NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物總量，判斷病毒模板的感染情況。此方法操作簡單，特異性強(qiáng)，適用于大量樣品的快速檢測。流感病毒A、B亞型、人副流感病毒l，2,3,4亞型、呼吸道合胞病毒、風(fēng)滲病毒、柯薩奇病毒引起的呼吸道傳染病共同癥狀為發(fā)燒、流弟及其它流感樣癥狀，主要通過呼吸道傳播，發(fā)病急、傳染快。這些病原體都是RNA病毒，致病性高并且難以區(qū)分，極易延誤診斷和治療的最佳時機(jī)。目前尚未見報道同時能檢測及鑒別上述九種傳染病病原體的纟全測方法，也沒有相應(yīng)的臨床檢測試劑盒上市。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不能同時檢測多種傳染病病原體的缺陷，提供一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行;險測的方法，包括(i)擴(kuò)增生物樣品的核酸片段，所述核酸片段為以下的一種或一種以上的組合流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白l基因的如SEQIDNO.l所示的核酸片段；流感病毒B亞型的第八節(jié)段基因的如SEQIDNO.2所示的核酸片H人副流感病毒1亞型核衣殼蛋白基因的如SEQIDNO.3所示的核酸片段；人副流感病毒2亞型核衣殼蛋白基因的如SEQIDNO.4所示的核酸片段；人副流感病毒3亞型核衣殼蛋白基因的如SEQIDNO.5所示的核酸片段；人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因的如SEQIDNO.6所示的核酸片段；呼吸道合胞病毒N基因的如SEQIDNO.7所示的核酸片段；風(fēng)滲病毒的糖蛋白El基因的如SEQIDNO.8所示的核酸片段；柯薩奇病毒B1型基因組的如SEQIDNO.9所示的核酸片,史；(ii)用探針進(jìn)行檢測，所述探針與步驟(i)擴(kuò)增產(chǎn)物中的一種特異性雜交。本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案是所述步驟(i)利用NASBA技術(shù)擴(kuò)增樣品的核酸片段。NASBA優(yōu)選的運(yùn)行條件為4rC45。C溫育90150分鐘。本發(fā)明步驟(ii)中優(yōu)選的是所述探針與步驟(i)所得擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在固體支持物上進(jìn)行?？梢怨潭ㄌ结樅秃怂崞蔚囊环N或多種，例如，固定在反應(yīng)板上。術(shù)語"固體支持物"是指保持其雜交特性前提下寡核苦酸探針可以偶聯(lián)的固體底物，通常，固體底物是尼龍末、纖維素膜、微珠、芯片或反應(yīng)板。在固定之前，可以修飾探針，以促進(jìn)固定或提高雜交效率。這樣的修飾包括同聚物加尾，與NH2基團(tuán)或生物素、半抗原偶聯(lián)?；蛘撸结樅秃怂崞味际遣还潭ǖ?，雜交可以在液體介質(zhì)中進(jìn)行，其檢測可以用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明還提供步驟(i)使用的引物，其核苷酸序列如下所示第l組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，其下游引物核苷S吏序列如SEQIDNO.11所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，其下游引物核苦酸序列如SEQIDNO.14所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.16所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；第5組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.22所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.23所示；第6組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.6所示的核酸片段，其上游引物核普酸序列如SEQIDNO.25所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；第7組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.7所示的核酸片段，其上游引物核香酸序列如SEQIDNO.28所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.29所示；第8組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.8所示的核酸片段，其上游引物核普酸序列如SEQIDNO.31所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.32所示；第9組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.9所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.34所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.35所示。上述第1組至第9組引物分別對應(yīng)4全測流感病毒A亞型、流感病毒B亞型、人副流感病毒1亞型、人副流感病毒2亞型、人副流感病毒3亞型、人副流感病毒4亞型、呼吸道合胞病毒、風(fēng)瘆病毒、柯薩奇病毒。在實(shí)際應(yīng)用中，還有一種可能是使用上述引物組別中的任意一種或一種以上的組合，來擴(kuò)增并4企測流感病毒A亞型、流感病毒B亞型、人副流感病毒1亞型、人副流感病毒2亞型、人副流感病毒3亞型、人副流感病毒4亞型、呼吸道合胞病毒、風(fēng)滲病毒和柯薩奇病毒中某一種或幾種，如使用第3組和第7組的序列進(jìn)行人副流感病毒1亞型和呼吸道合胞病毒的檢測等。本發(fā)明還提供所述步驟(ii)使用的捕獲探針，其核苷酸序列如SEQIDN0.37所示，其直接或間接的連接在固體支持物上，且與步驟(i)所得擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。本發(fā)明還提供步驟(ii)中使用的檢測探針序列1如SEQIDNO.12所示，檢測如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.15所示，檢測如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.18所示，檢測如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDNO.21所示，斥企測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDNO.24所示，-險測如SEQIDNO.5所示的核酸片段；序列6如SEQIDNO.27所示，檢測如SEQIDNO.6所示的核酸片段；序列7如SEQIDNO.30所示，檢測如SEQIDNO.7所示的核酸片段；序列8如SEQIDNO.33所示，斥企測如SEQIDNO.8所示的核酸片l殳；序列9如SEQIDN0.36所示，檢測如SEQIDNO.9所示的核酸片段。上述序列16分別對應(yīng)纟企測擴(kuò)增后的流感病毒A亞型、流感病毒B亞型、人副流感病毒1亞型、人副流感病毒2亞型、人副流感病毒3亞型、人副流感病毒4亞型、呼吸道合胞病毒、風(fēng)滲病毒和柯薩奇病毒。檢測探針可用多種生物方法進(jìn)行檢測。優(yōu)選地，所述檢測探針由生物素或地高辛標(biāo)記，力口入底物，經(jīng)過終止反應(yīng)步驟后經(jīng)分光光度計讀耳又吸光度值進(jìn)行結(jié)果判定。本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方案是由多個反應(yīng)管在同一時間進(jìn)行步驟(ii)所述檢測步驟，每個反應(yīng)管使用的檢測探針為序列1至序列9中的一種且與步驟(i)所使用的引物對應(yīng)共同檢測某一種病原體的存在。上述方法的吸光度結(jié)果處理可以采取如下方案測試K個陰性對照樣品，取其吸光度值，按以下公式確定臨界值m+KxSD,m為陰性對照吸光度算術(shù)平均值，SD為陰性對照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差，K依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)條件而定，如檢測的群體數(shù)或樣本數(shù)。檢測讀數(shù)大于臨界值則判定為檢測結(jié)果"陽性"；檢測讀數(shù)小于臨界值則判定為檢測結(jié)果"陰性"。本發(fā)明的術(shù)語"引物"指作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸序列，其與待復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)，長度和序列必須適合于延伸產(chǎn)物的合成。本發(fā)明術(shù)語"探針"指單鏈寡核苷酸，用于與核酸片段特異性雜交。"特異性雜交"指所述探針與核酸的整個區(qū)域或一部分在特定的實(shí)-險條件下形成雙鏈體，且在這些條件下，所述探針不與待檢測樣品中存在的其他核酸或核酸的其他區(qū)域形成雙鏈體。探針和核酸片段雜交后，可以通過任意合適的方式，進(jìn)行雜交的檢測，例如可以檢測的標(biāo)記探針和/或核酸片段，為了輔助檢測，優(yōu)選靶核酸片段進(jìn)行NASBA擴(kuò)增或PCR擴(kuò)增。本發(fā)明還提供一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1如SEQIDNO.l所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增流感病毒B亞型的第八節(jié)段基因如SEQIDNO.2所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增人副流感病毒1亞型核衣殼蛋白基因如SEQIDNO.3所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增人副流感病毒2亞型核衣殼蛋白基因如SEQIDN0.4所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增人副流感病毒3亞型核衣殼蛋白基因如SEQIDNO.5所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因如SEQIDNO.6所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增呼吸道合胞病毒N基因如SEQIDNO.7所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增風(fēng)滲病毒的糖蛋白El基因如SEQIDNO.8所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增柯薩奇病毒Bl型的基因組如SEQIDN0.9所示核酸片段的引物中的一組或一組以上的組合。優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒的引物選自以下9組引物第1組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.10所示，其下游引物核普酸序列如SEQIDNO.ll所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.13所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.3所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.16所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核香酸序列如SEQIDNO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；第5組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核芬酸序列如SEQIDN0.22所示，其下游引物核香酸序列如SEQIDN0.23所示；第6組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.6所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；第7組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.7所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.28所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDN0.29所示；第8組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.8所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.31所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.32所示；第9組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.9所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.34所示，其下游引物核苦酸序列如SEQIDNO.35所示。優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒還包含如核香酸序列SEQIDN0.37所示的捕獲探針。更優(yōu)選地，本發(fā)明所述試劑盒還包含以下至少一種與引物對應(yīng)的4全測探針序列1如SEQIDNO.12所示，檢測如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDN0.15所示，檢測如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.18所示，檢測如SEQIDNO.3所示的核酸片段；序列4如SEQIDNO.21所示，檢測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDN0.24所示，檢測如SEQIDNO.5所示的核酸片段；序列6如SEQIDNO.27所示，檢測如SEQIDNO.6所示的核酸片段；序列7如SEQIDNO.30所示，檢測如SEQIDNO.7所示的核酸片段；序列8如SEQIDNO.33所示，檢測如SEQIDNO.8所示的核酸片段；序列9如SEQIDNO.36所示，檢測如SEQIDNO.9所示的核酸片段。本發(fā)明所述試劑盒還可以包含一種或多種下述組分雜交緩沖液或制備所述雜交緩沖液的說明書；洗滌溶液或制備所述洗滌溶液的說明書；檢測形成的雜交體的組分；用于將探針附著到固體支持物上的組分。本發(fā)明所述對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行4企測的方法，對比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于(1)檢測速度快，效率高，可根據(jù)需要，隨機(jī)兩重、三重或多重組合同時檢測多種致病病原體，也可檢測單個病原體；(2)靈敏度高，NASBA可檢測到病毒的最小濃度為lO"1pM,高于經(jīng)典的病原分離法的敏感性；(3)特異性強(qiáng)，由于外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不能被擴(kuò)增，這就顯著提高了NASBA反應(yīng)的特異性；由于擴(kuò)增過程中的引物和檢測過程中的探針雙重作用，再次保證了病原體檢測的特異性，而且NASBA的反應(yīng)條件溫和，且比PCR反應(yīng)需要的時間短，因此轉(zhuǎn)錄更力。忠實(shí)于模板，進(jìn)一步減少了4晉配率；(4)操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定，整個檢測過程只需要酶標(biāo)儀這種常規(guī)的儀器；(5)適用于早期診斷，適用于不明原因發(fā)熱引起的重大傳染疾病的早期快速檢測、多種病原體的隨機(jī)組合檢測以及大量樣品的檢驗(yàn)。(6)適用范圍廣，取樣簡單。樣品中DNA、肝素、EDTA、檸檬酸鹽、血紅蛋白、白蛋白和脂質(zhì)等的污染將不會對結(jié)果造成影響，因而適用于各種待才企樣品如咽喉拭子、糞便、血液等。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對其進(jìn)行各種改造和修改，這些等價形式同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1設(shè)計和制備引物、探針序列。根據(jù)NCBI搜索選取流感病毒A亞型、流感病毒B亞型、人副流感病毒1亞型、人副流感病毒2亞型、人副流感病毒3亞型、人副流感病毒4亞型、呼吸道合胞病毒、風(fēng)疹病毒、柯薩奇病毒的特異性基因序列，它們分別是流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1基因序列，其GENEBANK登錄號為EU716171,選取序列高度保守部分作為靶核酸序列，本發(fā)明選取的耙序列是基質(zhì)蛋白1基因32-274，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；流感病毒B亞型的第八節(jié)段基因序列，GENEBANK登錄號為CY033960,本發(fā)明選取的靶核S吏序列為第八節(jié)段基因的716-839,其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；人副流感病毒l亞型的核衣殼蛋白基因序列，GENEBANK登錄號為U70948,本發(fā)明選取的靶核酸序列是核衣殼蛋白基因的858-1051，其核苷酸序列如SEQIDNO,3所示；人副流感病毒2亞型的核衣殼蛋白基因序列，GENEBANK登錄號為AF213352,本發(fā)明選取的靶核酸序列是核衣殼蛋白基因的515-689,其核苦酸序列如SEQIDNO.4所示；人副流感病毒3亞型的核衣殼蛋白基因序列，GENEBANK登錄號為M18760,本發(fā)明選取的靶核酸序列是核衣殼蛋白基因的1076-1200,其核苦酸序列如SEQIDNO,5所示；人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因序歹l),GENEBANK登錄號為M55976，本發(fā)明選取的耙核酸序列是磷酸蛋白基因的951-1088，其核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。呼吸道合胞病毒N基因序列，GENEBANK登錄號為D00736,本發(fā)明選取的靶核酸序列是N基因的1681-1809，其核苦列如SEQIDNO,7所示。風(fēng)疹病毒的糖蛋白E1基因序列，GENEBANK登錄號為M15240,本發(fā)明選取的乾核酸序列是糖蛋白El基因的8788-8891，其核香酸序列如SEQIDN0.8所示。柯薩奇病毒B1型的基因組序列，GENEBANK登錄號為Ml6560,本發(fā)明選取的靶核酸序列是柯薩奇病毒Bl型基因組的457-600，其核香酸序列如SEQIDN0.9所示。分析上述病毒特異性基因的信息，經(jīng)序列分析軟件DNAman進(jìn)行31物間設(shè)計出針對上述病原體沖企測的NASBA引物和4笨針。捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDNO.37所示；引物及對應(yīng)的^r測纟笨針如下所示第1組用于擴(kuò)增流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1如SEQIDNO.l所示的核酸片段的上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.10所示、下游引物核香酸序列如SEQIDNO.11所示、檢測探針如SEQIDNO.12所示；第2組用于擴(kuò)增流感病毒B亞型的第八節(jié)^:基因如SEQIDNO,2所示的核酸片段的上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.13所示、下游引物核苦酸序列如SEQIDNO.14所示、檢測探針如SEQIDN0.15所示；第3組用于擴(kuò)增人副流感病毒1亞型核衣殼蛋白基因如SEQIDNO.3所示的核酸片段的上游引物核苦酸序列如SEQIDNCU6所示、下游引物核苦酸序列如SEQIDNO.17所示、檢測探針如SEQIDNO.18所示；第4組用于擴(kuò)增人副流感病毒2亞型核衣殼蛋白基因如SEQIDNO.4所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.19所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示、檢測探針如SEQIDNO.21所示；第5組用于擴(kuò)增人副流感病毒3亞型的核衣殼蛋白基因如SEQIDNO.5所示的核酸片^^殳的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.22所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.23所示、檢測探針如SEQIDNO.24所示；第6組用于擴(kuò)增人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因如SEQIDNO,6所示核酸片段的上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.25所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.26所示、檢測探針如SEQIDN0.27所示。第7組用于擴(kuò)增呼吸道合胞病毒N基因如SEQIDNO.7所示核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.28所示、下游引物核苦酸序列如SEQIDNO.29所示、檢測探針如SEQIDNO.30所示。第8組用于擴(kuò)增風(fēng)滲病毒的糖蛋白El基因如SEQIDNO.8所示核酸片段的上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.31所示、下游引物核香酸序列如SEQIDNO.32所示、檢測探針如SEQIDNO.33所示。第9組用于擴(kuò)增柯薩奇病毒B1型的基因組如SEQIDNO.9所示核酸片卞爻的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.34所示、下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.35所示、檢測探針如SEQIDNO.36所示。實(shí)施例2制備本發(fā)明所述試劑盒。組成為1、擴(kuò)增體系引物(9組)Tris/HC1氯化鉀BSA二硫蘇糖醇三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苦等濃度混合物反轉(zhuǎn)錄酶核糖核酸酶HRNaseH噬菌體T7核糖核酸聚合酶陰性對照為無RNA酶水陽性對照是5pM人工合成的流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1、流感病毒B亞型的第八節(jié)段基因、人副流感病毒1亞型的核衣殼蛋白基因、人副流感病毒2亞型的核衣殼蛋白基因、人副流感病毒3亞型的核衣殼蛋白基因、人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因、呼吸道合胞病毒N基因、風(fēng)滲病毒的糖蛋白El基因、柯薩奇病毒B1型的基因組。每組10uM10-100mM1-10mM1-5g/ml1-5mM200-1000uM5-300U5-300U5-300U2、；險測體系檢測探針(9組，均由地高辛標(biāo)記)26(iM捕獲探針(生物素標(biāo)記)26pM清洗緩沖液1xTBS雜交緩沖液10mg/mlBSA,50mMTris-HCl(pH7.5)檢測緩沖液lxTBS:1.4MNaCl，30mMKCl，260mM才全測濃縮液堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛的抗體終止液3MNaOH底物10mM對硝基苯磷酸鹽溶液陰性對照為無RNA酶水；陽性對照是5pM人工合成的流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1、流感病毒B亞型的第八節(jié)段基因、人副流感病毒1亞型的核衣殼蛋白基因、人副流感病毒2亞型的核衣殼蛋白基因、人副流感病毒3亞型的核衣殼蛋白基因、人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因、呼吸道合胞病毒N基因、風(fēng)瘠病毒的糖蛋白El基因、柯薩奇病毒B1型的基因組。對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測的方法，同時也是本發(fā)明所述試劑盒的使用方法。1、核酸提取取待測痰液樣品，離心取上清，加入lml異硫氰酸胍，混勻后再加入lmlTRIZOL,振蕩混勻，冰浴中放置5分鐘.加入350ul氯仿，充分振蕩混勻，靜止分層后，立即于4。C,12000r/min離心20分鐘.將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預(yù)冷)混勻.-20。C放置lh，4。C,12000r/分鐘離心20分鐘，沉淀即總RNA.力口入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C，12000r/分鐘離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫;故置10分鐘，加適實(shí)施例3:量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測核酸樣品，-80。C保存?zhèn)溆谩?、NASBA擴(kuò)增反應(yīng)在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中配制如下所示的20plNASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，在41°C溫育90分鐘，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)檢測。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20^1)的終濃度具體為待測核酸樣品引物AMVRNaseHT7RNA聚合酶Tris/HC1氯化鉀BSA二硫蘇糖醇三^^酸核苷與脫氧三^200pMlpM10U10U10U10mM1mM100mg/ml1mM脧核苷等濃度混合物200uM3、NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物^r測取步驟2所得5|ilNASBA產(chǎn)物，加1pl檢測探針溶液(每孔各加一種)和lpl捕獲探針溶液，和43|il雜交緩沖液混勻后加入包被了抗生物素蛋白鏈菌素的微孔板(購自Thermofisherscientific)每個獨(dú)立的孔中，在45。C溫育l小時，以250^1lxTBS,pH7.4清洗小孔三次。每次傾去溶液后要拍干微孔板，每孔加lOO^tl檢測援沖液與檢測濃縮液的混合物(按檢測濃縮液檢測緩沖液=1:500稀釋)，檢測濃縮液購自Sigma，P/NN7653,在室溫下溫育30分鐘，以250pilxTBS，pH7.4清洗小孔三次，每次傾去溶液后要拍干微孔板，微孔加100pl底物，避光室溫溫育5分鐘，lOO(il終止液并輕輕搖動來終止顯色反應(yīng)，將微孔板和微孔板板框放入標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板分光光度計并讀取405nm吸光度。100pl底物加100pl終止液作為背景參照。4、；險測結(jié)果分析上述吸光度結(jié)果處理采取如下方案測試8個陰性對照樣品測定其吸光度值，按以下公式確定臨界值m+8xSD,m為陰性對照吸光度算術(shù)平均值，SD為陰性對照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差。臨界值為0.15+0.035x8=0.43。4全測讀數(shù)大于臨界值則判定為"陽性"；檢測讀數(shù)小于臨界值則判定為"陰性"。實(shí)施例4:對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行才全測的方法，同時也是本發(fā)明所述試劑盒的使用方法。1、核酸提取取待測血液樣品，取新鮮全血2ml力。1ml3%檸檬酸鈉，混勻后4°C,3OOOr/分鐘離心，10分鐘，取上清，加入lml異硫氰酸胍，混勻后再加入1mlTRIZOL，振蕩混勻，水浴中放置5分鐘，加入350ul氯仿，充分振蕩混勻，靜止分層后，立即于4-C,12000r/分鐘離心20分鐘.將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預(yù)冷)混勻.-20"放置1h，4。C,12000r/min離心20分鐘，沉淀即總RNA.力口入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C,12000r/min離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫放置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測核酸樣品，-80°<:保存?zhèn)溆谩?、NASBA擴(kuò)增在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中配制如下所示的20^1NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，在41°C溫育90分鐘，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)檢測。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20^1)的終濃度具體為:4寺測核酸樣品600uM引物2uMAMV150URNaseH150UT7脂A聚合酶150UTris/HCl10mM氯化鉀lmMBSA200mg/ml二石危蘇#唐醇3mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物600uM3、NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物纟企測取步驟2所得5(ilNASBA產(chǎn)物，加1pl檢測探針溶液(每孔各加一種)和1[il捕獲揮:針溶液，和43^1雜交緩沖液混勻并加入包凈皮了抗生物素蛋白鏈菌素的微孔板(購自Thermofisherscientific公司)每個獨(dú)立的孔中，在45。C溫育1小時，以250pilxTBS,pH7.4清洗小孔三次。每次傾去溶液后要拍干微孔板，每孔加100^1檢測緩沖液和檢測緩沖液的混合物(按檢測濃縮液檢測緩沖液=1:500配置)，在室溫下溫育30分鐘，以250[xllxTBS,pH7.4清洗小孔三次，每次傾去溶液后要拍干微孔板，微孔加100^1lOmMTris/HC1,避光室溫溫育5分鐘，力。lOOiil終止液并輕輕搖動來終止顯色反應(yīng)，將微孔板和微孔板板框放入標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板分光光度計并讀取405nm吸光度，使用100^110mMTris/HCl加100pl終止液作為背景參照。當(dāng)檢測待測樣品中是否含有某3種病原體時，只需在配制擴(kuò)增體系時，分別在3個反應(yīng)管加入該3種病原體對應(yīng)的引物，檢測時加入該3種病原體對應(yīng)的揮:針溶液，其他步驟同。4、檢測結(jié)果分析測定10個已知的陰性樣品的吸光度，臨界值是m(陰性對照吸光度算術(shù)平均值)+10xSD(陰性對照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差)，臨界值通常為0.15+0.03x10=0.45。檢測讀數(shù)大于臨界值則判定為檢測結(jié)果"陽性"；檢測讀數(shù)小于臨界值則判定為檢測結(jié)果"陰性"。實(shí)施例5:檢測流感病毒A亞型的靈敏度實(shí)驗(yàn)1、核酸擴(kuò)增取lml流感病毒A亞型標(biāo)準(zhǔn)品加入1ml異硫氰酸胍，混勻后再加入1mlTRIZOL,振蕩混勻，水浴中方丈置5分鐘.加入350ul氯仿，充分4展蕩混勻，靜止分層后，立即于4。C，12000r/min離心20分鐘.將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，加等體積的異丙醇(4。C預(yù)冷)混勻.-20。C放置lh,4。C,12000r/min離心20分鐘，沉淀即總RNA.加入0.5ml75%乙醇洗滌，4°C,12000r/min離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫放置10分鐘，加適量DEPC處理過的水溶解沉淀，即得到待測核酸樣品，測定其濃度。在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中分別標(biāo)記，配制如下所示的20piNASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，并同時i殳置兩個陰性對照，流感病毒A亞型RNA配制為l(T9pm、10"。pm、10-Upm、10-12pm的終濃度，每種濃度設(shè)置復(fù)管，以無RNA酶水作為陰性對照，4rC水浴95分鐘。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù);險測。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20^1)的終濃度具體為流感病毒A亞型RNA引物(第1組)lpMAMV10URNaseH10UT7脂A聚合酶10UTris/HCl10mM氯化鉀1mMBSA100mg/ml二碌u蘇糖醇1mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物200uM取擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列分析，其核苦酸序列如SEQIDNO.l所示，與流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1基因序列32-274段一致。2、核酸4企測1)在支持板框上安放一個微孔板板條，該微孔板包被了抗生物素蛋白鏈菌素(購自Thermofisherscientific公司)。2)每個微孔中依次加入43^1雜交緩沖液、力卩1(il檢測探針溶液(第1組)和l(il捕獲探針溶液，5^1擴(kuò)增產(chǎn)物，輕敲支持板以混合溶液(注意避免產(chǎn)生氣泡)。3)牢牢蓋上封口膜避免蒸發(fā)，45。C水浴60分鐘。4)傾去溶液后，以25(HdlxTBS,pH7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s，傾去溶液后拍干微孔板。5)每孔加lOOiil檢測緩沖液和檢測濃縮液的混合物(按檢測濃縮液緩沖液=1:500配置)，牢牢蓋上封口膜避免蒸發(fā)。6)在室溫下溫育30分鐘。7)傾去溶液后，以250^1lxTBS,pH7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s,每次傾去溶液后拍干微孔板。8)微孔加lOO(ll連接液(小心避免在孔中引入泡沫)。9)避光室溫溫育5分鐘。10)樣i孔加lOO)il終止液并輕輕搖動來終止顯色反應(yīng)。11)將微孔板和微孔板板框放入標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板分光光度計并讀取405nrn吸光度。、結(jié)果如表l所示。表l.本發(fā)明所述方法檢測不同濃度A亞型流感病毒(AIV)的吸光度值<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>4、結(jié)果分析經(jīng)分光光度計讀取吸光度值進(jìn)行結(jié)果判定，測定7個已知的陰性樣品(水)的吸光度，臨界值是m(陰性對照吸光度算術(shù)平均值)+7xSD(陰性對照吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差)，臨界值為0.17+0.04x7=0.45。檢測讀數(shù)大于臨界值則判定為檢測結(jié)果"陽性"；檢測讀數(shù)小于臨界值則判定為檢測結(jié)果"陰性"。即組別2的引物與組別2的檢測探針可以檢測到流感病毒A亞型的最低濃度是10—11pM。實(shí)施例6:檢測其他病原體的靈敏度實(shí)驗(yàn)參照實(shí)施例5,配制不同濃度的流感病毒B亞型、人副流感病毒1亞型、人副流感病毒2亞型、人副流感病毒3亞型、人副流感病毒4亞型、呼吸道合胞病毒、風(fēng)滲病毒和柯薩奇病毒，用其對應(yīng)的引物進(jìn)行NASBA擴(kuò)增后測定擴(kuò)增產(chǎn)物序列，其核苷酸與靶基因一致。用相應(yīng)的捕獲探針和檢測探針進(jìn)行-險測，4企測到的每種病原體最低濃度均能達(dá)到l(T"pM。實(shí)施例7:;險測流感病毒A亞型的引物特異性試-驗(yàn)將流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1基因如SEQIDNO.l所示的基因片段的38-41位置進(jìn)行突變，突變后的核苷酸序列如SEQIDN0.38所示，為了敘述方便，將其稱為流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白l基因片段的的干擾序列。取等濃度的實(shí)施例5流感病毒A亞型標(biāo)準(zhǔn)品、上述干擾序列以及人DNA序列，取其中之一或兩兩混合或三種混合共配制成7種不同的待測樣品，每種待測樣品設(shè)置復(fù)管，在0.5ml無RNA酶的滅菌離心管中分別標(biāo)記，配制如下所示的20plNASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系，并同時"i殳置兩個無RNA酶水的陰性對照，41。C水浴95分鐘。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)檢測。NASBA擴(kuò)增反應(yīng)體系(20|il)的終濃度具體為待測樣品800pM引物(第1組)lpMAMV10U脂aseH10UT7脂A聚合酶10UTris/HCl10mM氯化鉀1mMBSA100mg/ml二》克蘇糖醇1mM三磷酸核苷與脫氧三磷酸核苷等濃度混合物200uM進(jìn)行SDS—PAGE電泳分析，結(jié)果表明僅混合了流感病毒A亞型標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)管有擴(kuò)增產(chǎn)物，取擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列分析，其序列即為如SEQIDNO.l所示的核苷酸序列的5'連接了一段與捕獲探針互補(bǔ)的序列。實(shí)施例8:其他引物的特異性實(shí)驗(yàn)參照實(shí)施例7,將流感病毒B亞型的第八節(jié)段基因如SEQIDNO.2所示的核酸片段、人副流感病毒1亞型的核衣殼蛋白基因如SEQIDNO,3所示的核酸片段、人副流感病毒2亞型的核衣殼蛋白基因如SEQIDNO.4所示的核酸片段、人副流感病毒3亞型的核衣殼蛋白基因如SEQIDNO.5所示的核酸片段、人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因如SEQIDNO.6所示的核酸片段、呼吸道合胞病毒N基因如SEQIDN0.7所示的核酸片段、風(fēng)滲病毒的糖蛋白El基因如SEQIDNO.8所示的核酸片段、柯薩奇病毒B1型的基因組如SEQIDN0.9所示的核酸片段幾個堿基隨機(jī)突變后形成的干擾序列與耙核酸片段、人DNA進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，即取其中之一或兩兩混合或三種混合共配制成7種不同的待測樣品，分別在不同的反應(yīng)管用相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，SDS一PAGE電泳分析表明僅有混合了耙核酸的反應(yīng)管有擴(kuò)增產(chǎn)物，取擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列分析，其序列即為耙核酸序列連接了一段與捕獲探針互補(bǔ)序列。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明提供的引物特異性強(qiáng)，分析原因在于由于外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不能被擴(kuò)增，這就顯著提高了NASBA反應(yīng)的特異性；而且NASBA的反應(yīng)條件溫和，且比PCR反應(yīng)需要的時間短，因此轉(zhuǎn)錄更加忠實(shí)于模板，進(jìn)一步減少了錯配率。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>北京?？祷蛐酒_發(fā)有限公司<120>—種4企測傳染病病原體的方法及試劑盒<130>MP090691<160>38<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉242<212〉DNA<213>流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1基因32-274<400>1tctaacgaggtcgaaacgtacgttctctctatcgtcccatcaggccccctcaaagccgag60atcgcgcagagacttgaggatgtttttgcagggaagaacacagatcttgaggctctcatg120gaatggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaagggaattttagggtttgtg180ttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgatttgtccaaaatgcc240ct242<210>2<211>124<212>DNA<213>流感病毒B型的第八節(jié)段基因716-839<400>2atcggatcctcaactcactcttcgagcgtcttaatgaaggacatccaaagccaattcgag60cagctgaaactgcggtgggagtcttatcccaatttggtcaagagcaccgattatcaccag120aaga124<210〉3<211>194<212>DNA<213>人副流感病毒1亞型核衣殼蛋白基因的858-1051<400>3tatcagttatgctccttgcccactgtgaatgagactacagattactcgagtgaaggtata60gaagacttagtatttgacatattagatctcaaaggaaagaccaaatctcatcgatacaaa120aatgaagatataacttttgaccatcctttttctgcaatgtatccaagtgtaggaagtggg180ataaagattgaaaa194<210>4<211>175<212>DNA<213>人副流感病毒2亞型核衣殼蛋白基因的515-689<400>4tgaatcatacaatgggacgcctaaatatggacctctcctaaatatacccagctttatccc60ctcagcaacatctccccatgggtgtactagaataccatcattttcactcatcaagaccca120ttggtgttacactcacaatgtaatgcttggagattgtcttgatttcacggcatct175<210〉5<211>125<212>DNA<213>人副流感病毒3亞型核衣殼蛋白基因的1076-1200<400>5ctcgggtatggaggtcttgaacatccaataaatgagaatgcaatctgcaacacaactggg60tgtcccgggaaaacgcaaagagactgcaatcaggcatctcatagtccctggttttcagac120agaag125<210>6<211>138<212>DNA<213>人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因的951-1088<400>6ggagtcccatcaaaagtaagtctcagaagtttaaacaaagggccagagcaagttcctata60atcgtcactggcactggcgatgtctcaaaatttgttgatcaagacaatacaattacactt120gatccgttagcaagaccc138<210>7<211>129<212>DNA<213>呼吸道合胞病毒N基因的1681-1809<400〉7cctcataccaaaggatatagctaacagtttttatgaagtgtttgaaaaacaccctcatct60tatagatgtttttgtgcactttggcattgcacaatcatccacaagagggggtagtagagt120tgaaggaat129<210>8<211〉104<212>DNA<213>風(fēng)滲病毒糖蛋白El基因的8788-8891<400>8actgaacacccgttctgcaacacgccgcacggacasctcgaggtccaggtcccgcccgac60cccggggacctggttgagtacattatgaattacaccggcaatca104<210>9<211〉144<212>DNA<213>柯薩奇病毒B1型基因組的457-600<400>9ctgaatgcggctaatcctaactgcggagcacataccctcaaaccagggggcagtgtgtcg60taacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttcattttattcct120atactggctgcttatggtgacaat144<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><210〉14<211>56<212>DNA<213>引物InfB陽R<400>14aattctaatacgactcactatagggagaaggtcttctggtgataatcggtgctctt56<210>15<211>23<212>DNA<213>探針I(yè)nffl-P<400>15acatccaaagccaattcgagcag23<210>16<211>44<212>DNA<213〉引物HPIVl-F<400>16gatgcaaggtcgcatatgagtatcagttatgctccttgcccact44<210>17<211>56<212>DNA<213>引物HPIVl-R<400>17aattctaatacgactcactatagggagaaggttttcaatttttatcccacttccta56<210>18<211>25<212>DNA<213>探針HPIV1-P<400>18gaccatcctttttctgcaatgtatc25<210>19<211>43<212>DNA<213>引物HPIV2-F<400〉19gatgcaaggtcgcatatgagtgaatcatacaatgggacgccta43<210>20<211>55<212>DNA<213>引物HPIV2-R<400>20aattctaatacgactcactatagggagaaggagatgccgtgaaatcaagacaatc55<210>21<211>25<212>DNA<213>探針HPIV2-P<400>21cccagctttatcccctcagcaacat2533<210>22<211>44<212>DNA<213>引物HPIV3-F<楊〉22gatgcaaggtcgcatatgagctcgggtatggaggtcttgaacat44<210>23<211>57<212>DNA<213>引物HPIV3-R<400>23aattctaatacgactcactatagggagaaggcttctgtctgaaaaccagggactatg57<210〉24<211>25<212>DNA<213>探針HPIV3-P<400>24tgagaatgcaatctgcaacacaact25<210〉25<211>46<212>DNA<213>引物HPIV4-F<400>25gatgcaaggtcgcatatgagggagtcccatcaaaagtaagtctcag46<210〉26<211>56<212>DNA<213>引物HPIV4-R<400>26aattctaatacgactcactatagggagaagggggtcttgctaacgaatcaagtgta56<210>27<211〉25<212>DNA<213>探針HPIV4-P<400〉27ggcgatgtctcaaaatttgttgatc25<210>28<211>46<212>DNA<213>引物RSV畫F<400>28gatgcaaggtcgcatatgagcttactacccaaggacatagccaaca46<210>29<211>55<212>DNA<213〉引物RSV-R<400>29aattctaatacgactcactatagggagaaggatcccttcaactctactaccacct55<210>30<211>23<212>DNA<213>探針RSV陽P<400>30accaaaggacatagctaacagtt23<210>31<211>42<212>DNA<213>引物RV-F<400>31gatgcaaggtcgcatatgagactgaacacccgttctgcaaca42<210>32<211>56<212>DNA<213>引物RV-R<400>32aattctaatacgactcactatagggagaaggtgattgccagtgtaattcataatgt56<210>33<211>24<212>DNA<213〉探針RV-P<400>33cggggacctggttgagtacattat24<210〉34<211>42<212>DNA<213>引物Cox-F<權(quán)>34gatgcaaggtcgcatatgagctgaatgcggctaatcctaacc42<210>35<211>51<212>DNA<213>引物Cox-R<400>35aattctaatacgactcactatagggagaaggattgtcaccataagcagcca51<210>36<211>23<212>DNA<213>探針Cox-P<400>36cgactactttgggtgtccgtgtt23<210>37<211>20<212>DNA<213>捕獲探針<400>37gatgcaaggtcgcatatgag20<210>38<211>242<212>DNA<213>流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白l基因片段的的干擾序列<400>38tctaacatcttcgaaacgtacgttctctctatcgtcccatcaggccccctcaaagccgag60atcgcgcagagacttgaggatgtttttgcagggaagaacacagatcttgaggctctcatg120gaatggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaagggaattttagggtttgtg180ttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgatttgtccaaaatgcc240ct24238權(quán)利要求1、一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測的方法，包括(i)擴(kuò)增生物樣品的核酸片段，所述核酸片段為以下的一種或一種以上的組合流感病毒A亞型基質(zhì)蛋白1基因的如SEQIDNO.1所示的核酸片段；流感病毒B亞型的第八節(jié)段基因的如SEQIDNO.2所示的核酸片段；人副流感病毒1亞型核衣殼蛋白基因的如SEQIDNO.3所示的核酸片段；人副流感病毒2亞型核衣殼蛋白基因的如SEQIDNO.4所示的核酸片段；人副流感病毒3亞型核衣殼蛋白基因的如SEQIDNO.5所示的核酸片段；人副流感病毒4亞型磷酸蛋白基因的如SEQIDNO.6所示的核酸片段；呼吸道合胞病毒N基因的如SEQIDNO.7所示的核酸片段；風(fēng)疹病毒的糖蛋白E1基因的如SEQIDNO.8所示的核酸片段；柯薩奇病毒B1型基因組的如SEQIDNO.9所示的核酸片段；(ii)用探針進(jìn)行檢測，所述探針與步驟(i)擴(kuò)增產(chǎn)物中的一種特異性雜交。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)利用NASBA技術(shù)擴(kuò)增樣品的核酸片,殳，NASBA運(yùn)行條件為41°C~45°C溫育90~150分鐘。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中所述4笨針與步驟(i)所得擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交在固體支持物上進(jìn)行。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(i)使用以下9組寡核苷酸序列的一種或一種以上的組合作為引物進(jìn)行擴(kuò)增第1組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.ll所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.3所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.16所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.4所示的核酸片段，其上游引物核脊酸序列如SEQIDNO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；第5組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核香酸序列如SEQIDNO.22所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.23所示；第6組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.6所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；第7組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.7所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.28所示，其下游引物核普酸序列如SEQIDNO.29所示；第8組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.8所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.31所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.32所示；第9組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.9所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.34所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.35所示。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(ii)使用捕獲探針，其核苦酸序列如SEQIDN0.37所示，所述捕獲探針直接或間接的連接在固體支持物上。6、根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中使用以下的核苷酸序列作為檢測探針序列1如SEQIDNO.12所示，檢測如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.15所示，檢測如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.18所示，一全測如SEQIDNO.3所示的核酸片l殳；序列4如SEQIDN0.21所示，檢測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDNO.24所示，；險測如SEQIDN0.5所示的核酸片,爻；序列6如SEQIDNO.27所示，檢測如SEQIDNO.6所示的核酸片段；序列7如SEQIDNO.30所示，才企測如SEQIDNO.7所示的核酸片革殳；序列8如SEQIDNO.33所示，才企測如SEQIDNO.8所示的核酸片段；序列9如SEQIDNO.36所示，4全測如SEQIDNO.9所示的核酸片段。7、一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測的試劑盒，其包含用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.2所示核酸片^:的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.3所示核酸片^:的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.4所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.5所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDN0.6所示核酸片段的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.7所示核酸片,殳的引物、用于擴(kuò)增如SEQIDNO.8所示核酸片段的引物和用于擴(kuò)增如SEQIDNO.9所示核酸片段的引物中的一組或一組以上的組合。8、如權(quán)利要求7所述的試劑盒，所述引物選自第l組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.l所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，其下游引物核苷S吏序列如SEQIDNO.11所示；第2組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.2所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.13所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；第3組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.3所示的核酸片段，其上游引物核苦酸序列如SEQIDNO.16所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；第4組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；第5組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.5所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.22所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.23所示；第6組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.6所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.25所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.26所示；第7組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.7所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.28所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.29所示；第8組引物用于擴(kuò)增如SEQIDNO.8所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDN0.31所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.32所示；第9組引物用于擴(kuò)增如SEQIDN0.9所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.34所示，其下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.35所示。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包含如核苷酸序列SEQIDNO.37所示的捕獲4笨4十。10、根據(jù)權(quán)利要求7至9任一項所述的試劑盒，其特征在于，還包含以下至少一種與引物對應(yīng)的檢測探針序列1如SEQIDNO.12所示，檢測如SEQIDNO.l所示的核酸片段；序列2如SEQIDNO.15所示，檢測如SEQIDNO.2所示的核酸片段；序列3如SEQIDNO.18所示，才企測如SEQIDNO.3所示的核酸片^殳；序列4如SEQIDNO.21所示，檢測如SEQIDNO.4所示的核酸片段；序列5如SEQIDN0.24所示，檢測如SEQIDNO.5所示的核酸片段；序列6如SEQIDNO.27所示，檢測如SEQIDNO.6所示的核酸片段；序列7如SEQIDNO.30所示，檢測如SEQIDN0.7所示的核酸片段；序列8如SEQIDNO.33所示，檢測如SEQIDNO.8所示的核酸片段；序列9如SEQIDNO.36所示，檢測如SEQIDNO.9所示的核酸片段。全文摘要本發(fā)明公開一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進(jìn)行檢測的方法，所述傳染病病原體包括流感病毒A亞型、流感病毒B亞型、人副流感病毒1亞型、人副流感病毒2亞型、人副流感病毒3亞型、人副流感病毒4亞型、呼吸道合胞病毒、風(fēng)疹病毒和柯薩奇病毒，包括擴(kuò)增生物樣品的核酸片段和用探針進(jìn)行檢測。本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增的引物以及用于檢測的探針。本發(fā)明還提供包含上述引物的試劑盒。本發(fā)明所述方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡單，樣本范圍廣，可同時檢測多種病原體，適用于呼吸道傳染病的早期診斷。文檔編號C12Q1/68GK101545015SQ200910083898公開日2009年9月30日申請日期2009年5月11日優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日發(fā)明者于常海,馮曉燕,劉樂庭申請人:北京海康基因芯片開發(fā)有限公司