專利名稱：：一種聯(lián)合檢測(cè)五種烈性病原菌的基因液相芯片及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種聯(lián)合檢測(cè)炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌五種烈性病原菌的基因液相芯片的方法，本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
：可能用于生物恐怖的烈性病原體有很多種，包括炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西絲菌、布魯菌、鼻疽伯克霍爾德菌、類鼻疽伯克霍爾德桿菌、出血熱病毒、肉毒毒素和蓖麻毒素等?，F(xiàn)有的病原體檢測(cè)技術(shù)，如生物傳感器或膠體金技術(shù)等均見于生物恐怖因子的檢測(cè)。這些技術(shù)或靈敏或特異，但受限于多重檢測(cè)能力，難以對(duì)可#是樣本進(jìn)行多因子篩^^。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(liquidarray,1iquidchip),結(jié)合了PCR技術(shù)的靈壽丈度和核酸探測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短，通量大，可實(shí)現(xiàn)對(duì)疑似樣本多靶標(biāo)的同時(shí)篩查。炭疽芽孢桿菌ciHusrac")是人獸共患傳染病-炭疽的病原體，為粗大的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，具有強(qiáng)烈的致病性、傳染性和生存能力。鼠疫耶爾森菌(Kers^iapes"s)是嚴(yán)重危害人類健康的烈性傳染病-鼠疫的病原體，革蘭氏陰性卵圓形桿菌，其天然宿主是嚙齒類動(dòng)物，通過鼠蚤傳播。。土拉弗朗西斯菌(Frai7"'sei7a"7are/isis)是急性傳染病-土拉菌病(兔熱病)的病原體，革蘭氏陰性3泉桿菌，毒性強(qiáng)，傳播快。布魯菌(&uce7!a)是布魯菌病(brucellosic)的病原體，一組微小的球桿狀的革蘭氏陰性菌，自然界中抵抗力較強(qiáng)。類鼻疽伯克霍爾德菌(5lir^o油riapseudo鵬7/ei)是人獸共患病-類鼻疽病的病原體，革蘭陰性桿菌，自然界中抵抗力較強(qiáng)。本發(fā)明的炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土4立弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌多重檢測(cè)液相芯片，實(shí)現(xiàn)重要病原菌的多元化、高通量篩查，對(duì)于預(yù)防和控制跨境傳播傳染病的傳播、應(yīng)對(duì)生物恐怖、維護(hù)國(guó)家和人民生命健康安全具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種聯(lián)合檢測(cè)炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯片可以用于同時(shí)檢測(cè)炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌五種病原體。本發(fā)明還涉及利用所迷的基因液相芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。現(xiàn)有的病原體檢測(cè)技術(shù)受限于多重檢測(cè)能力的困境，而許多可疑樣本需要進(jìn)行多靶標(biāo)的篩查，本發(fā)明的目的是通過提供一種同時(shí)檢測(cè)五種烈性病原菌液相芯片及其制備方法和應(yīng)用，為五種烈性病原菌的快速檢測(cè)提供一種靈敏、特異、快速、可靠的方法。本發(fā)明的工作原理是選擇五種細(xì)菌的特異基因片段，il計(jì)針對(duì)五種細(xì)菌的特異性引物；然后設(shè)計(jì)位于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)五種細(xì)菌的特異性探針，探針偶聯(lián)不同編號(hào)的編碼微球，制備出可對(duì)上述五種細(xì)菌同時(shí)檢測(cè)的液相芯片，在應(yīng)用時(shí)，首先使用上述引物對(duì)五種細(xì)菌進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后加入擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，使微球上的捕獲探針捕獲相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，再與鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)反應(yīng)，通過LUMINEX檢測(cè)系統(tǒng)(如LUMINEX100，L畫INEX200,Bio-plex,LIQUICHIP等),實(shí)現(xiàn)對(duì)五種細(xì)菌的一次性檢測(cè)。本發(fā)明的液相芯片包括編碼微球、與編碼微球偶聯(lián)的捕獲探針、生物素化的引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素一藻紅蛋白(SA-PE)。本發(fā)明所述的PCR反應(yīng)體系包括IOxPCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶(Taq酶)、生物素化的引物、去離子水。本發(fā)明所用的編碼微球可以來(lái)源于L函INEX、BI0-RAD、QIAGEN、GENE等公司，可以選用任意編號(hào)作為編碼微球，例如選自上述公司的第044，042,032,025，034,027號(hào)微球。本發(fā)明的引物可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的范圍內(nèi)采用常規(guī)生物技術(shù)進(jìn)行篩選、設(shè)計(jì)或購(gòu)買，本發(fā)明的引物序列可以例如是炭疽芽孢桿菌(Sacinusa/3"racfsj(簡(jiǎn)稱炭疽菌)兩對(duì)引物，其中一對(duì)位于染色體、一對(duì)位于質(zhì)粒，序列如下BA-1-F:5，-TGGACGCATACGAGACATAAT-3'BA-1-R:5，-TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG-3，BA-2-F:5，-TTTCATAATCATGGATTTCCCG-3，BA-2-R:5，-TTACCCAACATCATCTTCGCA-3'鼠疫耶爾森菌(rers/dapes"s)(簡(jiǎn)稱鼠疫菌)位于染色體YP-F:5，-ACTCAATGTTGTGACGAGGATG-3'YP-R:5，-TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC-3，布魯菌(Sriice』h):Bru-F:5，-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3'Bru-R:5，-GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3'土拉弗朗西斯菌(Fra/i"'senaM7are;isis)(簡(jiǎn)稱土拉菌)fopAFT-F:5，-GGGCAAATCTAGCAGGTCMG-3,FT-R:5，-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT-3，類鼻疽伯克霍爾德菌drWwMeWapset^o,朋nei)(下面簡(jiǎn)稱類鼻疽菌)BP-F:5，-CGATCTCGTCAAGGTGTCGG-3'BP-R:5，-ccccagttcatctgatacttgc-3'本發(fā)明所述的生物素化是指在引物合成時(shí)將引物序列5'端用生物素進(jìn)行標(biāo)記。在本發(fā)明的PCR體系中，引物對(duì)的濃度分別可以是60-150nmol/L。在上述PCR體系中,dNTPs的濃度可以是O.05-0.5nnol/L。在上述PCR體系中，Taq酶濃度可以是l-5U/30jj1。優(yōu)選的pcr反應(yīng)體系為30jjl體系1(^pcr緩沖液3jj1;Taq酶2U;2.5mmol/LMg2+;0.2Ilnol/LdNTP引物FT-F、FT-R的濃度分別為60-100nmol/L,;引物BP-F、BP-R的濃度分別為60-lOO細(xì)ol/L;引物BA-1-F、BA-1-R、BA-2_F、BA-2-R、YP-F、YP-R的濃度分別為90-110nmol/L;引物Bru-F、Bru-R的濃度分別為100-150mnol/L;DNA模板2jal;ddH20補(bǔ)足至30ju1。PCR反應(yīng)的條件94°C10分鐘；94°C30s，58°C30秒，72°C30秒，30個(gè)循環(huán)；72。C延伸7分鐘。上述反應(yīng)條件為根據(jù)ABI9700的擴(kuò)增儀優(yōu)化的反應(yīng)條件，采用其他儀器可根據(jù)情況對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。本發(fā)明所述的捕獲探針序列如下炭疽菌探針l:5，-GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT-3'炭疽菌探針2:5，-CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC-3，鼠疫菌探針5，-AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA-3'布魯菌探針5，-TTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT-3，土拉菌探針5，-TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG-3，類鼻疽菌探針5，-AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT-3，上面所述探針在合成時(shí)5'端都氨基修飾且連上15-2O個(gè)T作為間隔，然后偶聯(lián)所述的編碼微球本發(fā)明涉及一種上述液相芯片的制備方法，該方法包括(1)微球與捕獲探針偶聯(lián)(2)分別選取一定編號(hào)的編碼微球，例如所述編碼微球選自044,042,032,025，034,027號(hào)微球；洗滌，活化；分別對(duì)應(yīng)加入炭疽菌探針1和探針2，鼠疫菌探針，布魯菌探針，土拉菌探針，類鼻疽菌探針；混勻，室溫下孵育3060min;重復(fù)l~2次；用PBST(即磷酸鹽-吐溫緩沖液)洗l~2次；用0.1%SDS(即十二烷基磺酸鈉)洗l~2次；微球重懸于TE緩沖液中，計(jì)數(shù)單位濃度；4t:避光保存。本發(fā)明涉及利用上述液相芯片同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)上述五種生物恐怖菌的檢測(cè)方法，該方法包括1、待檢測(cè)樣本核酸的提取，2、進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，其中配制一定組分濃度的、一定體積例如30ia1的PCR反應(yīng)體系，3、捕獲探針捕獲PCR產(chǎn)物將偶聯(lián)有探針的微球與生物素化標(biāo)記的多重PCR產(chǎn)物混合，在95。C變性5-10分鐘，456(TC雜交1030分鐘，探針即可特異性捕獲對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物，然后再加入鏈親和素-藻紅蛋白。在第一步的待檢測(cè)樣本核酸的提取中，待檢樣本核酸的提取可以采用酚-氯仿抽提方法，或者使用一般的商品化試劑盒提取，或者采用NaI(即碘化鈉)裂解-玻璃粉吸附法。在上述多重PCR反應(yīng)中，最優(yōu)選按照以下濃度配置PCR反應(yīng)體系，30ial體系1(^PCR緩沖液3(i1;Taq酶2U;2.5醒ol/LMg'+;0.2rbol/LdNTP;FT-F、FT-R各80nmol/L,BP-F、BP-R各80nmol/L，BA-1-F、BA-1-R、BA-2-F、8BA-2-R、YP—F、YP—R各IOOnmol/L,Bru—F、Bru—R各120nmol/L;向PCR管中加入模板2ial，再加ddH2O補(bǔ)足30ja1。反應(yīng)條件94°CIO分鐘；94°C3Q秒，58°C30秒，72°C30秒，30個(gè)循環(huán)；72。C延長(zhǎng)至7分鐘。在捕獲探針捕獲PCR產(chǎn)物的步驟中，將偶聯(lián)有4笨針的微球與生物素化標(biāo)記的多重PCR產(chǎn)物混合，在95。C變性5~IO分鐘，4560。C雜交1030分鐘，探針即可特異性捕獲對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物，然后再加入鏈親和素一藻紅蛋白，帶有熒光的報(bào)告分子則與生物素結(jié)合，此復(fù)合體通過懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)，通過紅、綠兩束激光檢測(cè)，紅色激光激發(fā)孩i球基質(zhì)的染料從而對(duì)微球編號(hào)進(jìn)行識(shí)別，綠色激光對(duì)表面結(jié)合的熒光染料進(jìn)行識(shí)別，實(shí)現(xiàn)捕獲探針捕獲的PCR產(chǎn)物的定量分析。附圖為DNA濃度——編碼微球表面的平均熒光強(qiáng)度(MFI)劑量反應(yīng)曲線，橫坐標(biāo)為濃度f(wàn)g/反應(yīng)體系，縱坐標(biāo)為MFI值，其中圖1為土拉弗朗西斯菌DNA濃度一MFI劑量反應(yīng)曲線；圖2為布魯菌(M5抹)DNA濃度一MFI劑量反應(yīng)曲線；圖3為炭疽芽孢桿菌探針1檢測(cè)的DNA濃度一MFI劑量反應(yīng)曲線；圖4為炭疽芽孢桿菌探針2檢測(cè)的DNA濃度一MFI劑量反應(yīng)曲線；圖5為類鼻疽伯克霍爾德菌DNA濃度一MFI劑量反應(yīng)曲線；圖6為鼠疫耶爾森菌(EV76林)DNA濃度一MFI劑量反應(yīng)曲線。具體實(shí)施例方式本發(fā)明以檢測(cè)五種生物恐怖菌的檢測(cè)方法，下面通過具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不以任何方式受下列實(shí)施例的限定。實(shí)施例l:采用五種細(xì)菌六對(duì)引物的多重PCR反應(yīng)1.樣本中核酸的提取Nal裂解-玻璃粉吸附法提取核酸。2.按以下體系配制多重PCR反應(yīng)體系，總體積30pl:10xPCRbuffer:3piTaqE:0.4^1dNTPs:0.6)^1BA-1-F,BA-1-R(IOBO:各O.3EEBA-2-F，BA-2-R(10m):各O.3EEYP-F,YP-R(10FM):各O.3niBru-F,Bru-P():各O.36niFT-F，F(xiàn)T-R(IOEM):各O.24IHBP-F,BP-R(1OEM):各O.24rE模板DNA:2EI1ddH20:加至30m3.按以下的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)預(yù)變性94°CIG分鐘32個(gè)循環(huán)94°C30秒58°C30秒72°C40秒延伸72°CIG分鐘反應(yīng)結(jié)束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增情況。PCR陰性對(duì)照除不加模板而以(1朋20代替外，其余體系相同。實(shí)施例2:捕獲探針與微球偶聯(lián)1.分別選耳又044，042,032，025,034，027號(hào)的編碼《設(shè)J求，用》走渦才展蕩器振蕩微球懸液，使微球混合均勻。2.分別取上述微球大約1.25xl0'個(gè)，分別轉(zhuǎn)移至離心管，14000g離心3-5Min，小心吸出上清。3.加入50TI0.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩20-30S,超聲20-30s,使微球重懸。4.用蒸餾水將合成的寡核苦酸探針稀釋到0.lmmol/L。5.將in稀釋的探針加于微球懸浮液中，對(duì)應(yīng)于044,042，032,025，034,027號(hào)編碼微球分別加入炭痘菌探針i,探針2,鼠疫菌探針，布魯菌探針，土拉菌探針，類鼻疽菌探針，振蕩混勻。6.加入2.5ni新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻。7.用鋁箔包裹離心管避光，漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫孵育30分鐘。8.再次加入新鮮配制的10mg/mLEDC。9.再次在漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫避光孵育30分鐘。10.用0.02°/。PBSTlml洗滌1次，離心14000g3-5分鐘.11.移棄上清，微球重懸于lmlG.r/。SDS中，洗滌，離心。12.移棄上清，微球重懸于100rapH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測(cè)微球。13.用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)微球的數(shù)量，換算出每種微球的單位濃度。14.把偶聯(lián)好的檢測(cè)微球放在4。C避光保存，一般每種探針偶聯(lián)的微球單獨(dú)保存，使用時(shí)，根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目選擇要混合的微球種類。實(shí)施例3:用上述五種烈性病原菌的液相芯片檢測(cè)待測(cè)樣本1.取上述各種偶聯(lián)微球各3500個(gè)混合，分裝于PCR管中(根據(jù)微球計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算相應(yīng)加入量)2.向各管中加5~17n五種細(xì)菌混合模板的PCR產(chǎn)物使其終體積為5oni，吹打混勻。3.95"C變性10分鐘。4.4560。C反應(yīng)10~30分鐘。5.轉(zhuǎn)移至96孔濾板抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物。6.再向各孔加75H14ng/mSA-PE,室溫避光孵育10分鐘，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE。7.再向各孔加入75m懸浮液，振蕩使微球重懸。8.反應(yīng)結(jié)束后上機(jī)檢測(cè)。9.懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)，通過紅、綠兩束激光檢測(cè)，紅色激光激發(fā)微球基質(zhì)的染料從而對(duì)微球編號(hào)進(jìn)行識(shí)別，綠色激光對(duì)表面結(jié)合的萸光染料進(jìn)行識(shí)別，實(shí)現(xiàn)捕獲探針捕獲的PCR產(chǎn)物的定量分析。下表為上迷五種待測(cè)病原菌的懸浮芯片檢測(cè)結(jié)果。ii<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表中Type為樣本類型，B代表陰性對(duì)照，C代表已知樣本，X代表未知樣本；BA-l為炭疽芽孢桿菌探針l，BA-2為炭疽芽孢桿菌探針2，BSA為陰性對(duì)照，Yp-2為鼠疫耶爾森菌探針，Bru-2為布魯菌探針，F(xiàn)t-2為土拉弗朗西斯菌探針，Bp-2為類鼻疽伯克霍爾德菌探針，Biotin(045)為生物素陽(yáng)性對(duì)照；Cl、C2、C4為炭疽芽孢桿菌樣本，C6、C7、C8為鼠疫耶爾森菌樣本，C9、C10為布魯菌樣本，Cll為陰性樣本；檢測(cè)熒光值大于等于三倍本底焚光值判為陽(yáng)性，因此已知樣本全部正確識(shí)別，未知樣本X1、X2均為炭疽芽孢桿菌強(qiáng)陽(yáng)性，類鼻疽伯克霍爾德弱陽(yáng)性。附圖所示為DNA濃度一編碼微球表面的焚光強(qiáng)度劑量反應(yīng)曲線。從圖中可以看出編碼微球表面焚光強(qiáng)度與加入的模板量在一定的范圍內(nèi)成正相關(guān)，其中橫坐標(biāo)為多重PCR時(shí)管中加入的模板DNA的量，縱坐標(biāo)代表相應(yīng)編碼微球表面的熒光強(qiáng)度?？梢酝ㄟ^擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的半定量分析。結(jié)論從上述結(jié)果可以得出，本發(fā)明的懸浮芯片和檢測(cè)方法具有以下優(yōu)越性1.靈敏較之于普通的多重PCR反應(yīng)，本發(fā)明的靈敏度提高從以下兩個(gè)方面體現(xiàn)l)檢測(cè)儀器存在信號(hào)的放大系統(tǒng)；2)PCR產(chǎn)物帶上的生物素與熒光染料藻紅蛋白連接的親和素結(jié)合的放大作用。2.特異采用核酸探針技術(shù)對(duì)標(biāo)記上生物素的PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性的識(shí)別，而非傳統(tǒng)的電泳方法通過PCR產(chǎn)物片段大小進(jìn)行識(shí)別。3.高通量一次PCR反應(yīng)一次檢測(cè)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)菌的同時(shí)檢測(cè)。4.準(zhǔn)確高效整合核酸體外擴(kuò)增、核酸分子雜交、編碼微球、生物素標(biāo)記、熒光檢測(cè)和流式細(xì)胞技術(shù)于一體，同時(shí)實(shí)現(xiàn)核酸樣品的檢測(cè)、鑒定，使結(jié)果準(zhǔn)確，工作高效。5.芯片制作方便只用設(shè)計(jì)好待檢目標(biāo)菌的引物，優(yōu)化PCR條件，標(biāo)記對(duì)應(yīng)的探針于編碼微球，即可組裝成檢測(cè)體系。6.多重檢測(cè)目標(biāo)靈活可調(diào)可根據(jù)不同檢測(cè)目標(biāo)，選擇對(duì)應(yīng)的引物和微球，組成不同目標(biāo)組合的檢測(cè)體系。1權(quán)利要求1、一種聯(lián)合檢測(cè)多種病原體的方法，其特征在于，該方法使用液相芯片，所述芯片包括微球、捕獲探針、生物素化的引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，所述病原體為炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽博克霍爾德菌。2、如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系包括10xPCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶、生物素化的引物、去離子水。3、如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法使用的引物序列如下炭疽芽孢桿菌(5ac;'n"saWArac"):兩對(duì)引物，其中一對(duì)位于染色體一對(duì)位于質(zhì)粒，序列如下BA-1-F:TGGACGCATACGAGACATAATBA-1-R:TGCTTTAGCGGTAGCAGAGGBA-2-F:TTTCATAATCATGGATTTCCCGBA-2-R:TTACCCAACATCATCTTCGCA鼠疫耶爾森菌(Fersi/n'apes"s):位于染色體，序列如下，YP-F:ACTCAATGTTGTGACGAGGATGYP-R:TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC布魯菌(SruceHa):序列如下，Bru-F:TGGCTCGGTTGCCAATATCAABru-R:GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG土拉熱弗朗西絲菌(Fra/3"'se7ia"2are/2sis):fopA,序歹'J如下，F(xiàn)T-F:GGGCAAATCTAGCAGGTCAAGFT-R:GCTGTAGTCGCACCATTATCCT類鼻癥十?？嘶魻柕?菌(5urici]o/cer/apseudoffla77ei):序歹lj:i口下BP-F:CGATCTCGTCAAGGTGTCGGBP—R:CCCCAGTTCATCTGATACTTGC。4、權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法中所用的捕獲探針序列如下炭疽菌探針l:GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT炭疽菌探針2:CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC鼠疫菌探針AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA布魯菌探針TTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT土拉菌探針TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG類鼻疽菌探針AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT5、如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括步驟1、待檢測(cè)樣本核酸的提取，2、多重PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的30ji1PCR反應(yīng)體系，3、捕獲探針捕獲PCR產(chǎn)物將偶聯(lián)有探針的微球與生物素化標(biāo)記的多重PCR產(chǎn)物混合，在95。C變性5~IO分鐘，45~60°C雜交1030分鐘，探針即可特異性捕獲對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物，然后再加入鏈親和素-藻紅蛋白。6、如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在引物合成時(shí)將序列5，端進(jìn)行生物素標(biāo)記。7、如權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述的PCR體系中，引物對(duì)的濃度分別為60-150腿ol/L。8、如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述的PCR體系中，dNTPs的濃度為O.05-0.50kU/L。9、如權(quán)利要求l-4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述的PCR體系中，Taq酶濃度為l-5U/30ju1。10、如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為30p1體系IO氺PCR緩沖液3|a1;Taq酶2U;2.5麵l/LMg'+;0.20iol/LdNTP引物FT-F、FT-R的濃度分別為60-100nmol/L,;引物BP-F、BP-R的濃度分別為60-100nmol/L;引物BA-卜F、BA-1-R、BA-2-F、BA+R、YP-F、YP-R的濃度分別為90-110nmol/L;引物Bru-F、Bru-R的濃度分別為lOO-150nmol/L;DNA模板2jj1;(1犯20補(bǔ)足30u1。11、如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所迷PCR反應(yīng)的條件94°CIO分鐘；94°C30秒，58°C30秒，72°C30秒，30個(gè)循環(huán)；72。C延伸7分鐘。12、如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為30jal體系IO葉CR緩沖液3ul;Taq酶2U;2.5mmol/LMg,0.2mK)l/LdNTP引物FT-F、FT-R的濃度分別為60-10Onmol/L,;引物BP-F、BP-R的濃度分別為60—100mnol/L;引物BA-l-F、BA-1-R、BA-2-F、BA-2-R、YP-F、YP-R的濃度分別為90-110nmol/L;引物Bru-F、Bru-R的濃度分別為100—150腿ol/L;DNA模板2ial;ddtW)補(bǔ)足30|i1。13、一種制備權(quán)利要求i-4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)烈性病原體的液相探針的方法，具體為分別選取一定編號(hào)的編碼微球；洗滌，活化；分別對(duì)應(yīng)加入炭疽菌探針1和探針2，鼠疫菌探針，布魯菌探針，土拉菌探針，類鼻疽菌探針；混勻，室溫下孵育3060min;重復(fù)12次；用PBST(即磷酸鹽-吐溫緩沖液)洗12次；用O.1%SDS(即十二烷基磺酸鈉)洗12次；微球重懸于TE緩沖液中，計(jì)數(shù)單位濃度；4X:避光保存。全文摘要本發(fā)明公開了一種五種烈性病原菌炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌、土拉弗朗西斯菌、類鼻疽伯克霍爾德菌的快速檢測(cè)基因液相芯片。本發(fā)明所提供的檢測(cè)五種烈性病原菌的液相芯片具有通量大，所需樣本量少，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確高效等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12R1/01GK101560557SQ20091007881公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者劉衡川,孫肖紅,文海燕,宇楊,靜王,胡孔新申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院