專利名稱：：具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種來源于大豆NAC類轉(zhuǎn)錄因子家族的抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的相關(guān)多肽及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，它可以通過結(jié)合特異的DNA元件來調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。一些轉(zhuǎn)錄因子起轉(zhuǎn)錄激活作用，一些起轉(zhuǎn)錄抑制作用，而另外一些既有轉(zhuǎn)錄激活活性，也有轉(zhuǎn)錄抑制活性。研究轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域，對于了解轉(zhuǎn)錄因子的作用方式和生物功能非常重要，既有理論意義，也非常有應(yīng)用價值。例如當(dāng)已知某一序列與抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性相關(guān)時，就可將其加在某個轉(zhuǎn)錄因子的前/后面，使其失去轉(zhuǎn)錄激活活性，分析表型的改變即可了解其功能；同時通過調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄水平，可達到所需植物表型的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種來自大豆NAC轉(zhuǎn)錄因子的具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抑制轉(zhuǎn)錄激活活性多肽，名稱為NARD(NAC-Active-Impression-Domain)，來源于大豆屬大豆(Glycinemax(L.))，是如下l)或2)的多肽1)名稱為NARD，由序列表中SEQIDNs:2所示的氨基酸殘基組成的多肽；2)序列表中SEQIDNs:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或十幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQIDNS:2衍生的多肽。上述2)的多肽可以是下述A)、B)或C)之一A)名稱為NARD(1/16)，由SEQIDN2:2的自氨基末端第1-16位氨基酸殘基組成的多肽；B)名稱為NARD(1/22)，由SEQIDNs:2的自氨基末端第1-22位氨基酸殘基組成的多肽；C)由序列表中SEQIDNq:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個到十九個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQIDN2:2衍生的多肽。上述C)具體可以是如下a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的多肽之一a)名稱為GmNACll(110-140)，由SEQIDNa:3的自氨基末端第1-31位氨基酸殘基組成的多肽；4b)名稱為NST1(113-146)，由SEQIDNq:4的自氨基末端第1-34位氨基酸殘基組成的多肽；c)名稱為AtNAC2(114-147)，由SEQIDNq:5的自氨基末端第1-34位氨基酸殘基組成的多肽；d)名稱為ATAF1(100-133)，由SEQID6的自氨基末端第1-34位氨基酸殘基組成的多肽；e)名稱為RD26(108-141)，由SEQIDN2:7的自氨基末端第1_34位氨基酸殘基組成的多肽；f)名稱為SNAC(109-142)，由SEQIDN2:8的自氨基末端第1-34位氨基酸殘基組成的多肽；g)由SEQIDNS:2的下列位置之外進行1個到5個的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQIDNQ:2衍生的多肽自氨基末端第7位、第10位、第12—15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29_34位。實驗證明序列表中的SEQIDNS:2的多肽在酵母系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到90%以上，在原生質(zhì)體系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到約80%;序列表中SEQIDNQ:2的氨基酸殘基序列自羧基末端缺失19個氨基酸殘基(SEQIDn2:2的自氨基末端第17-35位氨基酸殘基)的多肽NARD(1/16)具有抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性(在酵母系統(tǒng)中抑制75%);序列表中SEQIDNS:2的氨基酸殘基序列自羧基末端缺失13個氨基酸殘基(SEQIDNs:2的自氨基末端第23-35位氨基酸殘基)的多肽NARD(1/22)仍具有抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性(在酵母系統(tǒng)中抑制60%);序列表中SEQIDNS:3所示的氨基酸殘基組成的多肽GmNACll(110-140)在原生質(zhì)體系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到75%以上；序列表中SEQIDNS:4所示的氨基酸殘基組成的多肽NST1(113-146)在原生質(zhì)體系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到85%以上；序列表中SEQIDNa:5所示的氨基酸殘基組成的多肽AtNAC2(114-147)在原生質(zhì)體系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到80%以上；序列表中SEQIDNQ:6所示的氨基酸殘基組成的多肽ATAF1(100-133)在原生質(zhì)體系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到卯％以上；序列表中SEQIDN2:7所示的氨基酸殘基組成的多肽RD26(108-141)在原生質(zhì)體系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到80%以上；序列表中SEQIDNS:8所示的氨基酸殘基組成的多肽SNAC(109-142)在原生質(zhì)體系統(tǒng)中抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性達到80%以上。為了使所述的NARD便于純化，可在上述多肽的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表l標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)纖RRPoly-His2-10(通常為6個)HH朋HHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述NARD可以人工合成，也可以先合成其編碼基因，再通過生物表達得到。其中，NARD編碼基因可以通過將序列表中SEQIDNs:1自5'末端第1至105位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。上述的具有抑制轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性的各個多肽的編碼基因?qū)儆诒景l(fā)明的保護范圍。上述具有抑制轉(zhuǎn)錄激活活性作用多肽的編碼基因，具體可為如下i)或2)或3)的DNA分子之一1)其編碼序列是序列表中SEQIDNS:1的DNA分子；2)與l)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA分子；3)在高嚴謹條件下與與1)或2)限定的DNA序列進行雜交且編碼相同功能多肽的DNA分子。上述高嚴謹條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65T下雜交并洗膜。含有本發(fā)明多肽的編碼基因的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及重組宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增NARD全長或其任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明中，攜帶有NARD編碼基因的植物表達載體可通過使用包含但不限于Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主包含水稻、小麥、玉米等單子葉植物，或者黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等雙子葉植物。本發(fā)明的NARD可作為構(gòu)建植物表達載體的元件，將其連接在目的轉(zhuǎn)錄因子基因的前或后，均可抑制該轉(zhuǎn)錄因子的激活活性。因此本發(fā)明的NARD對研究具有轉(zhuǎn)錄激活功能的轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能及通過抑制此類轉(zhuǎn)錄因子的激活活性達到改變轉(zhuǎn)基因植物(含有具6有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子)表型的目的具有重要意義。下面結(jié)合實驗及附圖對本發(fā)明的要旨做進一步闡述，但本發(fā)明并不局限于以下實驗或?qū)嵤├?。圖1為GmNAC在酵母中的轉(zhuǎn)錄活性分析。圖2為GmNAC20各結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活活性分析。左側(cè)為GmNAC20基因不同區(qū)段載體構(gòu)建示意圖，數(shù)字表示氨基酸位置，右側(cè)為酵母生長狀態(tài)和半乳糖苷酶活性分析。圖3為GmNAC20中轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(NARD)的鑒定，圖左側(cè)為6fe7^ICi^不同區(qū)段載體構(gòu)建示意圖，數(shù)字表示氨基酸位置，圖右側(cè)為酵母生長狀態(tài)和半乳糖苷酶活性分析。圖4為6半乳糖苷酶定量分析NARD不同區(qū)段的抑制作用。圖5為!3半乳糖苷酶定量分析NARD對不同類型轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用。圖6A為原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)的驗證報告基因表達質(zhì)粒和內(nèi)參基因表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化活性測定。圖6B為原生質(zhì)體系統(tǒng)中的效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD的部分結(jié)構(gòu)示意圖。圖6C為原生質(zhì)體系統(tǒng)中的效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-目的片段的部分結(jié)構(gòu)示意圖。圖6D為雙熒光素酶定量分析NARD在原生質(zhì)體系統(tǒng)中對VP16的抑制作用。圖7為不同NAC多肽中NARD同源氨基酸序列比對。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法；下述實施例所涉及的所有實驗材料，如無特別說明，均從商業(yè)途徑得到。實施例1、NARD的發(fā)現(xiàn)及NARD基因的克隆與制備1.1.酵母系統(tǒng)中GmNAC基因的轉(zhuǎn)錄活性分析該實驗中，選擇了3個GmNAC基因GmNAC11、GmNAC20和GmNAC35作為分析對象。將上述基因全長開放閱讀框(0RF)分別克隆到pBDGAL4(pBD-GAL4Cam，Stratagene)載體并轉(zhuǎn)化酵母菌株YRG2(Stratagene)，經(jīng)過色氨酸缺陷培養(yǎng)基篩選陽性克隆，再將陽性克隆涂在組氨酸缺陷并加入3-AT的SD培養(yǎng)基平板上生長。同時利用X-Gal和ONPG對0-半乳糖苷酶酶活性進行定性及定量分析。結(jié)果如圖l所示，表明3個基因中，GmNACll具有轉(zhuǎn)錄激活活性，轉(zhuǎn)化子能在SD/-His+3-AT培養(yǎng)基平板上生長，且X-Gal分析I3-Galactosidase酶活也呈陽性。GmNAC20沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。1.2.GmNAC20基因不同區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性分析及NARD的發(fā)現(xiàn)、命名與克隆根據(jù)已有的報道，NAC類基因的保守NAC結(jié)構(gòu)域一般為DNA結(jié)合域，而呈多態(tài)性的C末端一般為轉(zhuǎn)錄激活域，在本發(fā)明的實施例中，將GmNAC20(其氨基酸序列是序列9，其7編碼基因是序列10)分成N端和C端兩部分，分別包含1-175(序列表中序列9的第1到175位)、162-268(序列表中序列9的第162到268位);和141-268(序列表中序列9的第141到268位)氨基酸區(qū)段。轉(zhuǎn)錄活性分析表明，C端都具有很強的轉(zhuǎn)錄激活活性，是作為轉(zhuǎn)錄激活域起作用的，將氨基酸序列是序列表中序列9的第162到268位的多肽命名為20AD，而N端均沒有檢測到轉(zhuǎn)錄激活活性。又將C末端向N端延伸20個氨基酸測定其轉(zhuǎn)錄活性，它們?nèi)匀痪哂泻軓姷募せ罨钚?圖2)。圖2中，左側(cè)為GmNAC基因不同區(qū)段載體構(gòu)建示意圖，數(shù)字表示氨基酸位置，右側(cè)為酵母生長狀態(tài)和半乳糖苷酶活性分析。該實驗中，為了進一步闡述GmNAC20編碼蛋白N端中存在的轉(zhuǎn)錄抑制域，如圖3所示，將GmNAC20劃分為更細的若干個區(qū)段進行轉(zhuǎn)錄活性的分析。圖3左側(cè)為GmNAC20不同區(qū)段載體構(gòu)建示意圖，數(shù)字表示氨基酸位置，右側(cè)為酵母生長狀態(tài)和半乳糖苷酶活性分析。"GAL4"表示轉(zhuǎn)入pBDGAL4質(zhì)粒的重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4作為空質(zhì)粒對照。"None"表示酵母菌株YRG2作為空菌對照。結(jié)果表明C端延伸至141位，141/268(序列表中序列9的第141到268位)仍然具有轉(zhuǎn)錄激活活性，而延伸至100位或49位，100/268(序列表中序列9的第100到268位)和49/268(序列表中序列9的第49到268位)均沒有轉(zhuǎn)錄激活活性，看來100/140(序列表中序列9的第100到140位)具有類似轉(zhuǎn)錄抑制域的功能。為了驗證其它區(qū)段是否有轉(zhuǎn)錄抑制功能，分別將1/61(序列表中序列9的第1到61位)和55/106(序列表中序列9的第55到106位)連接到轉(zhuǎn)錄激活域162/268(序列表中序列9的第162到268位)的N端，結(jié)果表明這兩段序列不能抑制162/268的轉(zhuǎn)錄激活活性。為了證明100/134區(qū)段-GmNAC20(100/134)(其氨基酸序列是序列表中的SEQIDN2:2,即NARD)(該氨基酸序列區(qū)段也是序列表中序列9的第100到134位，故以100/134表示)可使轉(zhuǎn)錄活性域喪失激活活性，進行如下實驗。1.2.1.GAL4DBD-GmNACs融合基因表達載體的構(gòu)建1)pBDGAL4-162/268及pBDGAL4-100/134*162/268等重組載體的構(gòu)建pBDGAL4-162/268的構(gòu)建方法如下提取大豆南農(nóng)1138-2(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心)幼苗經(jīng)lOOmMNaCl處理12小時后提取的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用表1中的相應(yīng)引物對PCR擴增GmNAC20(102/268)，將擴增產(chǎn)物連接到pBD-GAL4Cam的限制性內(nèi)切酶EcoRI和Pstl的位點間得到重組載體pBDGAL4-162/268。pBDGAL4-162/268中含有序列9的第162到268位氨基酸殘基的編碼DNA(序列表10中486—804位核苷酸)。pBDGAL4-100/134'162/268的構(gòu)建方法如下提取經(jīng)100mMNaCl處理12小時的南農(nóng)1138-2幼苗的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用表l中的相應(yīng)引物對(正向引物中帶有EcoRI識別序列，反向引物中帶有SalI識別序列)經(jīng)PCR擴增GmNAC20(100/134)。用表1中的相應(yīng)引物對(正向引物中帶有Sail識別序列，反向引物中帶有Pstl識別序列)經(jīng)PCR擴增GmNAC20(162/268)。GmNAC20(100/134)和GmNAC20(162/268)兩個片段以Sail位點相連，再以EcoRI和Pstl位點插入pBD-GAL4Cam的相應(yīng)位點，得到重組載體pBDGAL4-100/134'162/268。重組載體pBDGAL4-100/134'162/268中含有序列9的第100到134位氨基酸殘基的編碼DNA(序列表10的298至402位核苷酸)與序列9的第162到268位氨基酸殘基的編碼核苷酸(序列10的484—804位核苷酸)相連接。2)其它GAL4DBD-GmNACs融合基因表達載體的構(gòu)建分別含有GmNAC20(141/268)、GmNAC20(100/268)、GmNAC20(1/175)、GraNAC20(49/268)、GmNAC20(1/61)、GmNAC20(55/106)、GmNAC20(162/268)、GmNAC20(100/134)和GmNAC20(55/106*162/268)等蛋白編碼基因的重組載體參照pBDGAL4-162/268和pBDGAL4-100/134162/268的構(gòu)建方法，將這些蛋白編碼基因擴增產(chǎn)物分別連接到pBD-GAL4Cam的相應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點，得到重組載體。表1.pBDGAL4載體克隆所需引物列表引物方酶切位基因名稱_^_^_引物序列_正向引GmNAC20(162/268)物EcoRIGCAGAATTCGCAATTGAGAAGCAGCAACC反向引_^_PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(141/268)物EcoRICGTGAATTCCGCAAAAAGAACAGCTTAAGG反向弓l_^_PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(100/268)物EcoRIGAGGAATTCGGCAAACCGAAACCTGTTGG反向弓(_^_PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(1/175)物.EcoRITTCGAATTCATGGCCGCAGCAACACAACTCC反向引_^_^_TTTCTGCAGCCCACTCGGTGGTGGCGGTGCT正向引GmNAC20(49/268)物EcoRIGAGGAATTCTACGACCCATGGGACCTTCC反向引物PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(1/61)物反向弓lEcoRITTCGAATTCATGGCCGCAGCAACACAACTCC物SailCGTGTCGACTCCGTACAAAGCCATTCCTGG正向引GmNAC20(55/106)物反向引EcoRICGTGAATTCCCAGGAATGGCTTTGTACGGA物SailCGTGTCGACCCCAACAGGTTTCGGTTTGCC正向引GmNAC20(162/268)物反向引SailGCAGTCGACGCAATTGAGAAGCAGCAACC物PstlGTGCTGCAGTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC正向引GmNAC20(100/134)物反向引EcoRIGAGGAATTCGGCAAACCGAAACCTGTTGG物SailATCGTCGACGGCGAGACGATACTCGTGCATG正向引GmNAC20(100/134)物反向引SailGAGGTCGACGGCAAACCGAAACCTGTTGG物PstlATCCTGCAGGGCGAGACGATACTCG丁GCATG正向引GmDof4物反向引SailTCATCGTCGACATGCAGCAAATACACTCCATG物PstlATCCTGCAGTCAGGGAGATGAAGAGAGAAG正向引DREB1A物反向引SailCTTGTCGACATGAACTCATTTTCTGCTTT物PstlCTTCTGCAGTTAATAACTCCATAACGATAC正向引GmWRKY53物反向引SailATCAGTCGACATGGAGAATTATTCCATGTT物PstlGATGCTGCAGTCAGAAGGGAGTGTATATTT正向弓lVP16物反向引EcoRIGGGGAATTCACCGATGTCAGCCTGGGGGAC物SailGCTGTCGACCCCACCGTACTCGTCAATTCC正向弓lVP16物SailGGGGTCGACACCGATGTCAGCCTGGGGGAC反向引_^__GCTCTGCAGCCCACCGTACTCGTCAATTCC正向引ATAF1RD物EcoRICGTGAATTCCCTAAACCGGTCGGAATTAAG反向弓l_^_§^_CGTGTCGACGTCGGCGAGACGGTACTCGTG正向引RD26RD物EcoRICGTGAATTCGGTCGTCGTGTCGGGATT反向弓l_^__CGTGTCGACTTCTATTAAGCGATACTCG正向引SNACRD物EcoRICGTGAATTCGGGCGCACGCTTGGGATCAAG反向引_^_^_CGTGTCGACATCGGCGAGCCGGTACTCATG正向引A維C2RD物EcoRICGTGAATTCAAATCACTTGTGGGTATGAAG反向引_物Sail_CGTGTCGACGCCTTCTAAACGATATTCATG正向引NST1RD物EcoRICGTGAATTCGGCCGTAGAATTGGGATGAG反向引_^_^_CGTGTCGACGTCATCGAGTCTATATTCATG正向引GmNACllRD物EcoRICAAGAATTCGTTGGTGTGAAGAAGGCTTTG反向弓l物SailCAAGTCGACGTCTACAAGGCGATATTCATG1.2.2.轉(zhuǎn)化酵母及功能分析將1.2.1.構(gòu)建的GAL4DBD-GmNACs融合基因表達載體導(dǎo)入酵母菌株YRG-2(蒯7^ZKS^.'.'〃A^"-7>!7>L"-〃i^做M.',〃A,'7脂幼-7^7Xcra-7ac》(Stratagene))。同時將來自GAL4Two-HybridPhagemidVectorKit(Stratagene)的正對照質(zhì)粒pGAL4controlplasmid、負對照質(zhì)粒pBD-WTcontrolplasmid分別轉(zhuǎn)化酵母細胞YRG2。分別將在SD/Trp—培養(yǎng)基上(Stratagene,美國)(生長出的轉(zhuǎn)化子涂于SD/His—11(Stratagene，美國)平板上培養(yǎng)，3(TC培養(yǎng)3天，然后對能夠生長的酵母細胞進行B-Galactosidase活性分析。其中，酵母菌株YRG2的基因組中含有兩個報告基因/Z/5^和7acZ，每個報告基因啟動子中包含重復(fù)拷貝的GAL4結(jié)合位點(UAS,)(Stratagene，美國)。RT-PCR驗證酵母轉(zhuǎn)化子中基因的表達情況。酵母轉(zhuǎn)化子用YPAD培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時，取lml菌液收集酵母菌，然后按照酵母總RNA小量提取試劑盒(華舜，中國上海)提取酵母總RNA。然后用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，稀釋25倍取lpl作為模板，用pBDGAL4通用引物(5'-GCCTCTAACATTGAGACAGC-3'，5，-AAGAGTTACTCAAGAACAA-GAA-3，)擴增目的片段；酵母Actin作為對照，引物序列為5，-CAGCCAACT-TTCTCAAATCAG-3'，5'-GCCAAGGGTCACTACAC-3'。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。將轉(zhuǎn)入pBDGAL4-162/268的重組酵母菌株命名為YRG2/pBDGAL4-l62/268,轉(zhuǎn)入pBDGAL4—100/134'162/268的重組酵母菌株命名為YRG2/pBDGAL4_100/134*162/268，轉(zhuǎn)入pGAL4的重組酵母菌株命名為YRG2/pGAL4。實驗結(jié)果表明酵母Actin基因參照基因得到約1128bp的PCR產(chǎn)物；酵母轉(zhuǎn)化子YRG2/pBDGAL4-162/268中得到約300—400bp的PCR產(chǎn)物；酵母轉(zhuǎn)化子YRG2/pGAL4作為陽性對照，由于無多克隆位點，因此沒有檢測到PCR產(chǎn)物；酵母轉(zhuǎn)化子YRG2/pBDGAL4—100/134162/268得到約450bp的PCR產(chǎn)物；不轉(zhuǎn)質(zhì)粒的酵母菌株YRG2空菌對照"None"因為沒有外源質(zhì)粒導(dǎo)入，故沒有PCR產(chǎn)物的條帶出現(xiàn)。再將陽性克隆涂在組氨酸缺陷并加入3-AT的SD培養(yǎng)基平板上(Stratagene,美國)檢測其生長情況。并利用X-Gal和ONPG對e-半乳糖苷酶酶活性進行定性及定量分析。根據(jù)酵母實驗手冊(Yeasthandbook,Clonetech)ONPG顯色法對!3-Galactosidase活性進行定量分析。具體步驟如下取酵母轉(zhuǎn)化子陽性克隆至3mlYPAD培養(yǎng)基(Stratagene,美國)中搖8-12小時，OD值在1.2左右；取lml測定0D6。。；取1.5ml菌液收集酵母菌，12000rpm離心1分鐘；去上清，用Z-Buffer0.3ml重懸；取重懸液0.lml至新離心管，在液氮中速凍1分鐘，迅速取出在37'C溫育1分鐘，重復(fù)此操作4-5次；菌體裂解后加入0.7ml含巰基乙醇的Z-Buffer;混勻后加入4mg/ml的ONPG溶液0.2ml;30。C反應(yīng)，記錄開始時間，待溶液變?yōu)辄S色加入0.4ml1MNa2C03溶液終止反應(yīng)，記錄終止反應(yīng)時間，計算得顯色反應(yīng)時間T(反應(yīng)終止時間-反應(yīng)開始時間)；12000rpm離心5分鐘去除沉淀；取上清液測定0D42。(沒有菌體的空白組為對照)；利用公式(1000XOD42。)/(0.5XTXOD600)計算13-Galactosidase活性。其活性單位為OD42。/(培養(yǎng)物0D600的光密度X測定體積X時間)。實驗設(shè)三次重復(fù)。同時分別以pGAL4controlplasmid的重組酵母菌株YRG2/pGAL4(圖3中以"GAL4"表示)作為空質(zhì)粒對照以檢驗質(zhì)粒系統(tǒng)的可靠性，以未轉(zhuǎn)質(zhì)粒載體和12基因的酵母菌株YRG2(圖3中以"None"表示)作為空菌對照以檢驗酵母菌株的可靠性。在圖3中，"162/268"表示重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268的實驗結(jié)果；"100/134162/268"表示重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4_100/134*162/268的實驗結(jié)果。實驗結(jié)果如下A)在YPAD培養(yǎng)基上以上各重組菌及其對照均能生長，平均每皿約50個菌落。B)在組氨酸缺陷并加入3-AT的SD培養(yǎng)基平板(圖3中以"-His"表示)上"GAL4"重組酵母菌株YRG2/pGAL4作為陽性對照，每皿>50個菌落；"None"未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2無菌落；"162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-l62/268每皿>50個菌落；"100/134*162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4—100/134162/268無菌落;C)在X-Gal培養(yǎng)基平板(Stratagene，美國)(圖3中以"X—Gal"表示)"GAL4"重組酵母菌株YRG2/pGAL4每皿>50個菌落；"None"未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2無菌落；"162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268每皿>50個菌落；"100/134*162/268"重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4—100/134162/268無菌落;D)e-半乳糖苷酶酶活性其活性單位為0D42。/(培養(yǎng)物0D600的光密度X測定體積X時間)。重組酵母菌株YRG2/pGAL4的e-半乳糖苷酶酶活性為19±4;未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2的對照0-半乳糖苷酶酶活性為0;重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268P-半乳糖苷酶酶活性為22士5;重組酵母菌株YRG2/pBDGAL4-100/134*162/268的e-半乳糖苷酶酶活性為1.5±0.2。上述實驗證明100/134(即NARD)具有顯著抑制轉(zhuǎn)錄因子激活活性的作用，抑制率達到90%以上。NARD編碼基因的編碼序列長度為105bp，編碼35個氨基酸殘基的多肽(即SEQIDN2:2)。1.3.NARD分段功能分析在本發(fā)明中，為了進一步對NARD中具體起作用的氨基酸進行描述，將NARD進一步分段，其中一段是NARD(1/16)(氨基酸序列是序列表中SEQIDNs:2的自氨基末端第1-16位氨基酸殘基的NARD)、一段是NARD(1/22)(氨基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-22位氨基酸殘基的NARD)、一段是NARD(23/35)(氨基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第23-35位氨基酸殘基的NARD)、一段是NARD(1/9)(氨基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-9位氨基酸殘基的NARD)、一段是NARD(1/12)(氨基酸序列是序列表中SEQID他2的自氨基末端第1-12位氨基酸殘基的NARD)。分別將其連接GmNAC20的激活域20AD(其氨基酸序列是序列9的自氨基末端第162-268位氨基酸殘基)。將NARD(1/16)的編碼序列(序列表1的1至48位核苷酸)、NARD(1/22)的編碼序列(序列表1的1至66位核苷酸)、NARD(23/35)的編碼序列(序列表1的67至105位核苷酸)、NARD(1/9)的編碼序列(序列表1的1至27位核苷酸)、NARD(1/12)的編碼序列(序列表1的1至36位核苷酸)分別與20AD的編碼序列(序列10的484—804位核苷酸)的5'端連接后插入pBD-GAL4Cam的多克隆位點，得到重組載體pBDGAL4—NARD(1/16).162/268，pBDGAL4—NARD(1/22).162/268，pBDGAL4—NARD(23/35).162/268，pBDGAL4—NARD(1/9).162/268，pBDGAL4—NARD(1/12).162/268。將重組載體pBDGAL4—NARD(1/16).162/268，pBDGAL4—NARD(1/22).162/268，pBDGAL4—NARD(23/35).162/268，pBDGAL4—NARD(1/9).162/268，pBDGAL4—NARD(1/12)162/268分別導(dǎo)入酵母菌株YRG-2，得到重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/16).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(1/22).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(23/35).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(1/9).162/268，YRG2/pBDGAL4—NARD(1/12).162/268。按照1.2.2.所提供的方法進行13-Galactosidase定量檢測，實驗設(shè)三次重復(fù)。同時分別以重組酵母YRG2/pBDGAL4-162/268和未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2作為對照。轉(zhuǎn)錄活性檢測表明它們都無法如完整的NARD—樣抑制20AD的激活活性，因此NARD只是在序列完整時才能起到最強的轉(zhuǎn)錄抑制作用。表達氨基酸序列為序列9的自氨基末端第1-22位氨基酸殘基組成的NARD(1/22)抑制了55%以上20AD的活性，其B-Galactosidase值下降了一半以上。NARD(1/16)可以將20AD的活性抑制75%，而證D(1/9)卻沒有太大影響(圖4)。圖4中，陽性對照"20AD"表示表達氨基酸序列是序列9自氨基末端第162-268位氨基酸殘基的20AD的重組酵母YRG2/pBDGAL4-162/268的活性檢測結(jié)果；陰性對照"None"表示未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2;"NARD(1/35).20AD"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQIDNa:2的自氨基末端第1-35位氨基酸殘基的NARD和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—100/134162/268的活性檢測結(jié)果；"NARD(1/22).20AD"表示:表達氨基酸序列是序列表中SEQIDNs:2的自氨基末端第1-22位氨基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/22).162/268的活性檢測結(jié)果；"NARD(23/35).20AD"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第23-35位氨基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(23/35).162/268的活性檢測結(jié)果；"NARD(1/9).20AD"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-9位氨基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸殘基組成的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/9).162/268;的活性檢測結(jié)果；"NARD(1/12).20AD"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQID2的自氨基末端第1-12位氨基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/12).162/268的活性檢測結(jié)果；"NARD(1/16).20AD"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQIDN2:2的自氨基末端第1-16位氨基酸殘基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸殘基的20AD相連接的重組酵母YRG2/pBDGAL4—NARD(1/16).162/268的活性檢測結(jié)果。實施例2.NARD的功能驗證2.1.NARD抑制作用的普遍性本發(fā)明的上述實驗已證明來自GmNAC20的NARD對GmNAC20中的轉(zhuǎn)錄激活域有很強的抑制作用。為了證明NARD抑制作用的普遍性，檢測了NARD對其它類型轉(zhuǎn)錄因子是否也具有抑制作用，以pBD-GAL4Cam(Stratagene，美國)為出發(fā)載體，構(gòu)建了NARD與其它轉(zhuǎn)錄因子融合的重組載體，在酵母系統(tǒng)中驗證了它們的轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果表明GmDof4、DREB1A、GmWRKY53和GmNACll的轉(zhuǎn)錄激活活性均能被NARD強烈抑制。本實驗中選用以下的轉(zhuǎn)錄因子GmDof4屬于Dof類轉(zhuǎn)錄因子，可以提高種子油脂含量，其氨基酸序列如GenBankAccessionNoDQ857254所示；DREB1A和GmWRKY53分別屬于AP2/EREBP和WRKY家族，均與植物的非生物脅迫耐性相關(guān)，它們在GenBank中的AccessionNo分別為FJ169302和DQ322693。根據(jù)表l所列出的相應(yīng)引物，以大豆南農(nóng)1138—2cDNA為模板進行PCR擴增，分別得到Gm沐RKY53,GmNACll和GmDof4的cDNA;以擬南芥cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增，得到DREB1AcDNA。將這些PCR擴增產(chǎn)物插入pBD-GAL4Cam的Sail和Pstl酶切位點，得到重組載體pBD-GmWRKY53、pBD-GmNAC11、pBD-GmDof4、pBD-DREB1A。pBD-NARD'GmWRKY53、pBD-NARD'GmNACll、pBD-NARD'GmDof4和pBD-NARD'DREB1A的構(gòu)建方法如下提取經(jīng)100mMNaCl處理12小時的南農(nóng)1138-2幼苗的總認A，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以大豆南農(nóng)1138—2cDNA為模板進行PCR擴增，用表1中的相應(yīng)引物對(正向引物中帶有EcoRI識別序列，反向引物中帶有SalI識別序列)PCR擴增GmNAC20(100/134)，得到的100/134片段，再分別與上述各擴增片段以Sail位點相連，之后再以EcoRI和Pstl位點與載體pBD-GAL4Cam連接獲得重組載體pBD-NARD'GmWRKY53、pBD-NARD*GmNACll、pBD-NARD'GmDof4或pBD-NARD'DREB1A。15將重組載體pBD-GmWRKY53、pBD-GmNACll、pBD-GmDof4、pBD-DREBlA、pBD-NARD'GmWRKY53、pBD-NARD*GmNACll、pBD-NARD*GmDof4和pBD-NARD*DREB1A分別導(dǎo)入酵母菌株YRG-2，得到重組酵母YRG2/pBD-GmWRKY53、YRG2/pBD-GmNACll、YRG2/pBD-GmDof4、YRG2/pBD-DREB1A、YRG2/pBD-NARD*GmWRKY53、YRG2/pBD-NARD'GmNACll、YRG2/pBD-NARDGmDof4和YRG2/pBD-賺D'DREB1A。按照1.2.2.所提供的方法進行B-Galactosidase定量檢測，實驗設(shè)三次重復(fù)。同時以未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2作為對照。實驗結(jié)果表明未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2的I3-Galactosidase活性為0.8±0.1，YRG2/pBDGAL4—GmDof4的13-Galactosidase活性為12.5±0.1，YRG2/pBDGAL4—NARDGmDof4fi-的Galactosidase活性為2.5±0.8，YRG2/pBDGAL4—DREBIA的13-Galactosidase活性為16.5±4，YRG2/pBDGAL4—NARDDREBIA的13-Galactosidase活性為2.3±1，YRG2/pBDGAL4—GmWRKY53的fi-Galactosidase活性為4.5±1，YRG2/pBDGAL4—NARDGmWRKY53的13-Galactosidase活性為l土O.1，YRG2/pBDGAL4—GmNAC11的13-Galactosidase活性為9.2±0.3，YRG2/pBDGAL4—NARDGmNACll的13-Galactosidase活性為0.5±0.1。說明NARD可以將所檢測的不同類型轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性抑制90%以上。該實驗證明NARD對轉(zhuǎn)錄激活域的抑制作用是普遍的。在圖5中，陰性對照"None"表示未轉(zhuǎn)基因的酵母菌株YRG2的活性檢測結(jié)果；"GmDof4"表示表達GmDof4轉(zhuǎn)錄因子的重組酵母YRG2/pBD—GmDof4的活性檢測結(jié)果；"NARDGmDof4"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQIDNq:2的NARD和GmDof4轉(zhuǎn)錄因子連接的重組酵母YRG2/pBD—NARD■GmDof4的活性檢測結(jié)果；"DREBIA"表示表達DREBIA轉(zhuǎn)錄因子的重組酵母YRG2/pBD—DREBIA的活性檢測結(jié)果；"NARDDREBIA"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQIDNq:2的NARD和DREBIA轉(zhuǎn)錄因子相連接的重組酵母YRG2/pBD_NARD'DREB1A的活性檢測結(jié)果；"GmWRKY53"表示表達GmWRKY53轉(zhuǎn)錄因子的重組酵母YRG2/pBD_GmWRKY53的活性檢測結(jié)果；"NARD.GmWRKY53"表示表達氨基酸序列是序列表中SEQIDNs:2的NARD和GmDof4轉(zhuǎn)錄因子相連接的重組酵母YRG2/pBD—NARD'GmWRKY53的活性檢測結(jié)果；2.2.NARD在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)錄活性系統(tǒng)中的抑制作用16近年來，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)錄活性分析系統(tǒng)因為其靈敏度高、更接近于植物本體分析等優(yōu)點逐漸成為植物轉(zhuǎn)錄因子活性分析強有力的工具之一。在前面的實驗中，分析證明了NARD在酵母系統(tǒng)中具有很強的轉(zhuǎn)錄抑制作用，為了提供更深入的實驗證據(jù)，利用原生質(zhì)體分析系統(tǒng)作進一步研究。首先做了一系列實驗來驗證原生質(zhì)體系統(tǒng)的可行性。根據(jù)JanSheen實驗室提供的操作流程(http:〃genetics.mgh.harvard,edu/sheenweb/protocols/)，分離了哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體，單質(zhì)粒GFP轉(zhuǎn)化結(jié)果表明PEG轉(zhuǎn)化效率可以達到90%;報告基因表達質(zhì)粒(螢火蟲熒光素酶基因表達質(zhì)粒(Promega，E6651))和內(nèi)參基因表達質(zhì)粒(海腎熒光素酶基因表達質(zhì)粒(Promega，E6881))轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體，按照雙熒光素酶報告試劑盒(Dual-LuciferaseR印orterAssaySystem,Promega，E1910)的操作規(guī)程檢測報告基因和內(nèi)參基因的熒光素酶活性。報告基因和內(nèi)參基因的熒光素酶活性比值即為熒光素酶相對活性。檢測儀器為GlomaxT20/20(Promega,美國)。實驗結(jié)果表明隨著質(zhì)粒比例的變化雙熒光素報告系統(tǒng)的比值呈線性，表明質(zhì)粒的量與報告基因的表達呈正相關(guān)(圖6A)。圖6A中，質(zhì)粒比為報告基因表達質(zhì)粒和內(nèi)參基因表達質(zhì)粒的摩爾比。其中，上述轉(zhuǎn)化方法采用PEG-CaCl2方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。10|^1質(zhì)粒(總計10-20嗎)加入100|al原生質(zhì)體MMg懸液(0.4Mmannitol，15mMMgCl2，4mMMES，約含原生質(zhì)體150-200Pg)，再加入11(V1PEG-CaCl2(4gPEG4000,3mlH20，2.5ml0.8MMannitol，lmllMCaCh)溶液，吹吸混勻，轉(zhuǎn)化20分鐘。轉(zhuǎn)化完后，加入440jxlW5溶液(154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKCl，2mMMESpH5.7)混勻后100g緩慢離心3分鐘，去上清后加入lmlW5溶液過夜培養(yǎng)16h。然后用上述原生質(zhì)體系統(tǒng)來驗證NARD的作用。構(gòu)建原生質(zhì)體系統(tǒng)的載體報告基因表達載體、效應(yīng)基因表達載體和內(nèi)參基因表達載體。報告基因表達載體為報告基因表達質(zhì)粒(螢火蟲熒光素酶基因表達質(zhì)粒(Promega，E6651))。效應(yīng)基因表達載體中的效應(yīng)基因(effecter)為35S啟動子驅(qū)動的包含GAL4結(jié)合域的融合蛋白，GAL4DBD可以結(jié)合GAL4結(jié)合位點，依靠轉(zhuǎn)錄因子的作用來調(diào)控螢火蟲熒光素酶的表達。在本發(fā)明實施例中構(gòu)建了一系列效應(yīng)基因的載體(effectors)來分析它們的轉(zhuǎn)錄活性。效應(yīng)基因載體包含35S啟動子和NOS終止子。將GAL4DNABindingDomain(GAL4DBD，其編碼基因如序列12)和所分析的全基因或部分基因序列構(gòu)建的融合基因克隆到35S啟動子后面。以單獨GAL4DBD為負對照，以VP16為正對照，然后分別將NARD按照讀碼框拼接在VP16的前端或后端，來闡述NARD的作用。1)作為負對照的效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD(圖6B)的具體構(gòu)建方法如下pUC19-35S-N0S的構(gòu)建方法如下用分別含有Kpnl和Sail位點的引物，以植物雙元表達載體pBin438(李太元，田穎川，秦曉峰，等.高效抗蟲轉(zhuǎn)基因煙草的研究[J].中國科學(xué)(B輯)，1994,24(3):276-282.)為模板PCR擴增CaMV35S、Q和N0S片段，再以上述酶位點插入pUC19的相應(yīng)位點中，得到重組載體pUC19-35S-N0S。用分別含有EcoRI和Pstl位點的引物將GAL4DNABindingDomain的編碼基因(序列12)構(gòu)建到pUC19-35S-N0S中Q和NOS點間，得到重組載體pGAL4DBD(圖6B)。2)效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-目的片段(圖6C)的具體構(gòu)建方法如下A)pGAL4DBD-VP16的構(gòu)建用表1中的引物從HSV病毒中PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，將該擴增產(chǎn)物連入pGAL4DBD的EcoRI和Sail位點，得到重組載體pGAL4DBD-VP16。B)pGAL4DBD-VP16VP16的構(gòu)建用表1中的兩對引物分別從HSV病毒中PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列l(wèi)l)，將2個VP16以SalI相連再以EcoRI和PstI位點與pGAL4DBD連接得到重組載體pGAL4DBD-VP16VP16。C)pGAL4DBD-NARDVP16的構(gòu)建利用表l中的引物對(正向引物具有EcoRI位點，反向引物具有SalI位點)PCR擴增NARD(GmNAC20(100/134))，利用表l中的引物對(正向引物具有Sail位點，反向引物具有PstI位點)PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，再將NARD和VP16的擴增產(chǎn)物以Sail位點相連再以EcoRI和Pstl位點與pGAL4DBD連接得到重組載體pGAL4DBD-NARDVP16。D)pGAL4DBD-VP16NARD的構(gòu)建利用表l中的引物對(正向引物具有SalI位點，反向引物具有PstI位點)PCR擴增賺D(GmNAC20(100/134))，利用表1中的引物對(正向引物具有EcoRI位點，反向引物具有SalI位點)PCR擴增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11),再將VP16和NARD的擴增產(chǎn)物以Sail位點相連再以EcoRI和Pstl位點與pGAL4DBD連接得到重組載體pGAL4DBD-VP16證D。內(nèi)參基因表達載體pPTRL(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)按照如下文獻中描述的方法構(gòu)建OhtaMOhme-TakagiM,ShinshiH(2000)Threeethylene-responsivetranscriptionfactorsintobaccowithdistincttransactivationfunctions.PlantJ22:29-38。將報告基因表達載體、上述一種效應(yīng)基因表達載體和內(nèi)參基因表達載體pPTRL以6:10:1的摩爾比采用上述PEG-CaCl2方法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體。按照雙熒光素酶報告試劑盒(Promega，E1910)的操作規(guī)程檢測報告基因和內(nèi)參基因的熒光素酶活性。報告基因和內(nèi)參基因的熒光素酶活性比值即為熒光素酶相對活性。檢測儀器為GlomaxT20/20(Promega，美國)。實驗結(jié)果如圖6D所示，圖中的數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實驗的均值土標準差。表明VP16具有很強的轉(zhuǎn)錄激活活性，VP16VP16的轉(zhuǎn)錄激活活性高于VP16，表明兩個轉(zhuǎn)錄激活域融合在一起時具有一定的疊加效應(yīng)；而NARDVP16和VP16NARD的轉(zhuǎn)錄激活活性下降了約80%。說明在原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中NARD可以強烈抑制VP16的轉(zhuǎn)錄活性，而且這種抑制作用沒有位置的選擇性，也即NARD無論在VP16的前端或后端均具有轉(zhuǎn)錄抑制的作用。圖6D中，"GAL4DBD"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD作為陰性對照和pPTRL共轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的檢測結(jié)果；"VP16"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-VP16作為陽性對照和pPTRL共轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的檢測結(jié)果；"VP16'VP16"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-VP16.VP16和pPTRL共轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的檢測結(jié)果；"NARDVP16"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-NARD.VP16和pPTRL共轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的檢測結(jié)果；"VP16NARD"代表報告基因表達載體，pGAL4DBD-VP16.NARD和pPTRL共轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體的檢測結(jié)果。實施例3、nard同源序列的轉(zhuǎn)錄抑制作用Blast分析表明NARD序列僅存在于NAC類蛋白中。NARD位于NAC類蛋白的N端，在NAC類蛋白中具有一定保守性，本發(fā)明選擇了GmNACll、NST1、AtNAC2、ATAF1、RD26、SNAC等6個NAC蛋白，克隆其中NARD的同源序列NACsRD(NACActiveR印ressionDomain,)，它們都具有同nard—致的保守序列，如。其序列分別為GmNAC20(100-134):見SEQIDNa2，GmNAC11(110-140):見SEQIDNa3，nst1(113-146):見SEQIDNq4，AtNAC2(114-147):見SEQIDNs:5，ATAF1(100-133):見SEQID6，RD26(108-141):見SEQIDNa:7，SNAC(109-142):見SEQIDN28。其中，NST1，來自擬南芥，Ara6油;w'st/ah'a朋,ACCESSIONQ84WP6;AtNAC2，來自擬南芥，Jra&Wo/^i'st/a"a朋，ACCESSIONNM—123323;19ATAF1，來自擬南芥，^raW叩w'st力ah'a朋，ACCESSIONNM_100054;RD26,來自擬南芥，AraWoA^s^ah'a朋，ACCESSIONBAB63913;SNAC，來自水稻，firj^asWira，ACCESSIONABD52007.1。如圖7所示，以上多肽是由SEQIDN2:2的下列保守位置之外進行1個到5個的取代和/或缺失和/或添加所得到的具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQID2衍生的多肽自氨基末端第7位、第10位、第12—15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29—34位。這些與NARD在上述位點具有100%同源性且編碼相同功能的多肽，總稱為NACsRD，將GmNACl1(110-140)、NST1(113-146)、AtNAC2(114-147)、ATAF1(100-133)、RD26(108-141)和SNAC(109-142)分別命名為GmNACllRD，NST1RD,AtNAC2RD,ATAF1RD,RD26RD和SNACRD)。實驗結(jié)果表明這些NACsRD與NARD—樣具有相同程度的對轉(zhuǎn)錄因子激活的轉(zhuǎn)錄抑制作用。效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-目的片段(圖6C)pGAL4DBD-GmNACllRDVIP16、pGAL4DBD-NST1RDVP16、pGAL4DBD-AtNAC2RDVP16、pGAL4DBD-ATAFlRDVP16、pGAL4DBD-RD26RDVP16和pGAL4DBD-SNACRDVP16的構(gòu)建方法同實施例2.2.的2)。GmNACllRD,NST1RD，AtNAC2RD，ATAF1RD,RD26RD和SNACRD的PCR引物見表1.按照實施例2的方法，用報告基因表達載體、內(nèi)參基因表達載體pPTRL和下述一種效應(yīng)基因表達載體轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體pGAL4DBD、pGAL4DBD-VP16、pGAL4DBD-VP16VP16、pGAL4DBD-NARDVP16、pGAL4DBD-GmNACllRDVIP16、pGAL4DBD-NSTlRDVP16、pGAL4DBD-AtNAC2RDVP16、pGAL4DBD-ATAFlRDVP16、pGAL4DBD-RD26RDVP16和pGAL4DBD-SNACRD'VP16。按照實施例2的方法，并檢測報告基因和內(nèi)參基因的熒光素酶活性。報告基因和內(nèi)參基因的熒光素酶活性比值即為熒光素酶相對活性。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為1.5±0，轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-VP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為20.0±3.0;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-VP16VP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為33.0±4.5;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-NARDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為4.2±0.8;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-GmNACllRDVIP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為2.6±0.3;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-NSTlRDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為2.8±0.5;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-AtNAC2RDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為3.0±0.9;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-ATAFlRDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為2.5±0.8;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-RD26RDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為3.2±0.8;轉(zhuǎn)染效應(yīng)基因表達載體pGAL4DBD-SNACRDVP16的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體的熒光素酶相對活性為4.2±0.8。上述熒光素酶相對活性均為3-5次重復(fù)實驗的均值土標準差。說明圖7所示的6個NACsRD與NARD—樣可以分子內(nèi)明顯地抑制VP16的活性，起到轉(zhuǎn)錄抑制的作用。序列表<110〉中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所〈120〉具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽及其編碼基因與應(yīng)用<160>12〈210〉1〈211〉105<212〉畫<213〉大豆屬大豆[Glycinemax(L.)Merr]〈221>CDS〈222>(1)..(105)<400>1ggcaaaccgGlyLysPro1ggaaaagcgGlyLysAlacgtetcgccArgLeuAla35aaacctgttgggateaagaaagcattggttttttacgccLysProValGlylieLysLysAlaLeuValPheTyrAla51015cccaagggagtgaaaactaactggateatgcacgagtatProLysGlyValLysThrAsnTrplieMetHisGluTyr2025304896105〈210〉2〈211〉35〈212>PRT〈213>大豆屬大豆[Glycine隨(L.)Merr]<400〉2GlyLysProLysProValGlylieLysLysAlaLeuValPheTyrAla151015GlyLysAlaProLysGlyValLysThrAsnTrplieMetHisGluTyr202530ArgLeuAla35〈210〉3<211>31<212〉PRT〈213〉大豆屬大豆[Glycinemax(L.)Merr]〈400〉3ValGlyValLysLysAlaLeuVal15GlyValLysThrAsnTrplieMet20PheTyrLysGlyArgProProLys1015HisGluTyrArgLeuValAsp2530<210>4<211>34<212>PRT<213〉擬南芥〈400〉4GlyArgArg1AlaProHisAspAsplieGlyMetArgLysThrLeuValPheTyrLysGlyArg51015GlyGinLysSerAspTrplieMetHisGluTyrArgLeu202530〈210〉5〈211〉34〈212>PRT〈213〉擬南芥"raWc/o/wis<400>5LysSerLeuValGlyMetLysLys15AlaProLysGlyValLysThrAsn20GluGlyThrLeuValPheTyrLysGlyArg1015TrpValMetHisGluTyrArgLeu2530<210〉6〈211〉34<212〉PRT<213〉擬南芥(v4ra6Wop^血//朋<3)〈400>6ProLysProValGlylieLysLys15AlaProLysGlyGluLysThrAsn20AlaAspAlaUuValPheTyrAlaGlyLys1015TrplieMetHisGluTyrArgLeu2530<210〉7〈211〉34〈212>PRT<213>擬南芥(爿ra6油/757^<400>7GlyArgArg1AlaProLyslieGluValGlylieLysLysAla5GlyThrLysThrAsnTrp2025LeuValPheTyr10lieMetHisGluAlaGlyL>ys15TyrArgLeu30<210>8〈211〉34〈212〉PRT<213〉水稻(Oyza^m'va)<400>8GlyArgThrUuGlylieLysLysAlaLeuValPheTyrAlaGlyLys151015AlaProArgGlyValLysThrAspTrplieMetHisGluTyrArgLeu202530AlaAsp〈210〉9〈211〉268〈212〉PRT<213>大豆屬大豆[Glycinemax(L)Merr]〈400〉9MetAlaAlaAlaThrGinUuHisLeuProProGlyPheArgPheHis151015LeuThrAspGluGluLeuValValHisTyrLeuCysArgLysCysAla202530SerGinGlulieAlaValProlielieAlaGlulieAspLeuTyrLys354045TyrAspProTrpAspLeuProGlyMetAlaLeuTyrGlyLysLysGlu505560TrpTyrPhePheThrProArgAspArgLysTyrProAsnGlySerArg65707580ProAsnArgSerAlaGlyThrGlyTyrTrpLysAlaThrGlyAlaAsp859095LysProValGlyLysProLysProValGlylieLysLysAlaLeuVal100105110PheTyrAlaGlyLysAlaProLysGlyValLysThrAsnTrplieMet115120125HisGluTyrArgLeuAlaAspValAspArgSerValArgLysLysAsn130135140SerLeuArgLeuAspAspTrpValLeuCysArglieTyrAsnLysLys145150155160GlyAlalieGluLysGinGinProAlaProProProProSerGlyVal165170175HisLyslieGluCysTyrGluMetGluAspValLysProGluTyrThr180185190AlaAlaAspCysLeuTyrPheGluAlaSerAspSerValProArgLeu195200205HisThrThrGluSerSerCysSerGluGinValValSerAlaGluPhe210215220AlaSerGluValGinSerGluArgLysArgGinGlyAsnSerGluPhe225230235240SerTyrAsnTyrMetAspAlaThrLeuGlyAsnAsnGinMetSerPro245250255LeuGinAspliePheMetTyrLeuSerArgProPhe260265<210〉10〈211〉807<212>腿〈213>大豆屬大豆[Glycinemax(L)Merr]〈220>〈221〉CDS〈222〉(1)..(807)<400>10atggccgcagcaacacaaetccacttaccccctggattccgattccac48MetAlaAlaAlaThrGinLeuHisLeuProProGlyPheArgPheHis151015etcaccgatgaagaaetcgtcgttcactatetctgccgcaaatgcget%LeuThrAspGluGluLeuValValHisTyrLeuCysArgLysCysAla202530tcgcaagaaategcagttccaataategccgaaategatetctacaag144SerGinGlulieAlaValProlielieAlaGlulieAspLeuTyrLys354045tacgacccatgggaccttccaggaatggetttgtacggaaagaaagag192TyrAspProTrpAspLeuProGlyMetAlaLeuTyrGlyLysLysGlu505560tggtattttttcacgccgagggaccgcaagtacccgaacggttcgegg240TrpTyrPhePheThrProArgAspArgLysTyrProAsnGlySerArg65707580ccgaaceggtecgcggggaccggatactggaaggcaaccggagcggat288ProAsnArgSerAlaGlyThrGlyTyrTrpLysAlaThrGlyAlaAsp859095aaaccggttggcaaaccgaaacctgttgggateaagaaagcattggtt336LysProValGlyLysProLysProValGlylieLysLysAlaLeuVal100105110ttttacgccggaaaagcgcccaagggagtgaaaactaactggateatg384PheTyrAlaGlyLysAlaProLysGlyValLysThrAsnTrplieMet115120125cacgagtatcgtetcgccgacgtggatcgttcggttcgcaaaaagaac432HisGluTyrArgLeuAlaAspValAspArgSerValArgLysLysAsn130135140agettaaggctggatgactgggtgctgtgtcgaatttacaacaagaaa480SerLeuArgLeuAspAspTrpValLeuCysArglieTyrAsnLysLys14515015516026ggtgcaattgagaagcagcaaccagcaccgccaccaccgagtggggtc528GlyAlalieGluLysGinGinProAlaProProProProSerGlyVal165170175cacaaaattgaatgttacgaaatggaagacgtgaagccggagtatacg576HisLyslieGluCysTyrGluMetGluAspValLysProGluTyrThr180185190gcggcggattgcctgtacttcgaggettecgactcggtgccgeggctg624AlaAlaAspCysLeuTyrPheGluAlaSerAspSerValProArgLeu195200205cacacgacggagtcgagetgttcggagcaggtggtgtcggcggagttt672HisThrThrGluSerSerCysSerGluGinValValSerAlaGluPhe210215220gcgagegaggtgcagagegageggaagaggcagggcaacagegagUt720AlaSerGluValGinSerGluArgLysArgGinGlyAsnSerGluPhe225230235240tcgtataattacatggatgccactetcgggaataatcagatgtcgccg768SerTyrAsnTyrMetAspAlaThrLeuGlyAsnAsnGinMetSerPro245250255etccaggatatettcatgtacetctecaggcccttctga807LeuGinAspliePheMetTyrLeuSerArgProPhe260265<210〉11<211〉837〈212〉醒<213〉HSV病毒〈400〉11atg33gCt3Ctgtcttctatcg犯c犯gcatgcgatatttgecgacttaaaaagctcsag60tgctccaaaggtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctac120tctcccaaaacca已a已ggtctccgctgactagggcacstctgax^gaagt180tggaacagctatttctactgatttttcctcg已ga^gaccttgacatgatt240ttgaaaatggattctttacagcattgttaacaggattatttgtacaagat300aagatgccgtcacagatsgattggcttcagtgg卿ctgatatgectcta360acattgagacagcatagaat犯gtgcgacateatcategg420ca犯gacagttgactgt已tcgattgaattcgsaccagaaaca已ctacggc480tctaccatcgagggcttgetcgacctcccagacgacgacgacgctccagccgaagcaggt540ctcgttgctccaagaatgtctttcctctccgctggac卿gaccaag犯gactttctacc600accgctccaatcaccgacgtttctttggttgacgaattgagattggaeggcgagg已ggtt660<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權(quán)利要求1.一種多肽，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中SEQID№2所示的氨基酸殘基組成的多肽；2)序列表中SEQID№2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或十幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQID№2衍生的多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述2)的多肽為下述A)、B)或C)之一A)由SEQIDNs:2的自氨基末端第1-16位氨基酸殘基組成的多肽；B)由SEQIDN2:2的自氨基末端第卜22位氨基酸殘基組成的多肽；C)由序列表中SEQIDNQ:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個到十九個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQIDN2:2衍生的多肽。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于所述C)是如下a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的多肽之一a)由SEQIDNs:3的自氨基末端第1-31位氨基酸殘基組成的多肽；b)由SEQIDn2:4的自氨基末端第1-34位氨基酸殘基組成的多肽；c)由SEQID5的自氨基末端第l-34位氨基酸殘基組成的多肽；d)由SEQIDN"6的自氨基末端第l-34位氨基酸殘基組成的多肽；e)由SEQIDNq:7的自氨基末端第1-34位氨基酸殘基組成的多肽；f)由SEQIDN2:8的自氨基末端第1-34位氨基酸殘基組成的多肽；g)由SEQIDN"2的下列位置之外進行l(wèi)個到5個的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQIDNa:2衍生的多肽自氨基末端第7位、第10位、第12—15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29—34位。4.權(quán)利要求1、2或3所述多肽的編碼基因。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因是如下l)或2)或3)的DNA分子之一1)其編碼序列是序列表中SEQID1的DNA分子；2)與1)限定的DNA分子具有90y。以上同源性，且編碼相同功能多肽的麗A分子;3)在高嚴謹條件下與l)或2)限定的DNA序列進行雜交且編碼相同功能多肽的DNA分子。6.擴增權(quán)利要求4或5所述基因的全長或其任一片段的引物。7.含有權(quán)利要求4或5所述基因的表達盒、重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。8.權(quán)利要求4或5所述基因在抑制植物轉(zhuǎn)錄因子激活活性中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將權(quán)利要求3或4所述基因連接到具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子的前或后。10.權(quán)利要求4或5所述基因在改變轉(zhuǎn)基因植物表型中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物中含有具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子。全文摘要本發(fā)明公開了具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽及其編碼基因與應(yīng)用。該多肽，是如下1)或2)的多肽1)由序列表中SEQID№2所示的氨基酸殘基組成的多肽；2)序列表中SEQID№2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或十幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性的由SEQID№2衍生的多肽。該多肽對研究具有轉(zhuǎn)錄激活功能的轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能及通過抑制此類轉(zhuǎn)錄因子的激活活性達到改變轉(zhuǎn)基因植物(含有具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子)表型具有重要意義。文檔編號C12N15/82GK101538322SQ20091007862公開日2009年9月23日申請日期2009年2月27日優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日發(fā)明者張萬科,張勁松,晴林,郝宇鈞,陳受宜申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所