專(zhuān)利名稱：銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相關(guān)基因pa5022及其應(yīng)用的制作方法
銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相皿因尸^W2及其，
fe^領(lǐng)域本發(fā)明屬于m^物生t/^領(lǐng)域，特別涉及一種銅綠假單胞菌7jC解彈性蛋白能 力相，因iM5022及其自。
背景技術(shù)：
銅綠假單胞菌(P促wdbwowoy您《<§/ 0似，PA)，屬于假單胞菌禾斗(Family pseudomonas)假單胞菌屬(Pseudomonas)，又稱為綠JW菌。革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界 中(如土壤、7柳空氣)，正常人體的艦、M3t和上呼鵬中，是一種觀的^f頓織。在一 些漫'Ki)i、難導(dǎo)致宿主免疫功能受損的因素中，易引起支氣管-肺部的原發(fā)性銅綠假單胞菌感 染。同時(shí)也FS^5、創(chuàng)傷感染病人，囊性纖維頓A&晚期腫瘤患者死亡的觀原因，常引 起菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)麟、燒傷感染和支氣管擴(kuò)張、慢肢氣管 *性纖維{ ^感染 等頓，嚴(yán)離害著人類(lèi)的麟和生命。
銅綠假單胞^#性蛋白麟一種觀的毒力因子，由/o^基因編碼。該酶的合^5離體密 度感皿統(tǒng)(quorum sensing)的調(diào)控。群體密度感g(shù)^細(xì)菌之間相互交流以感知外界環(huán)m
而協(xié)調(diào)特定基因教的一種誠(chéng)。驗(yàn)，已纟Si:M^多的調(diào)節(jié)子倉(cāng)辦調(diào)控群體密度感頓統(tǒng)，
進(jìn)而在^^及緑后水平上調(diào)控著彈性蛋白酶的就。彈性蛋白酶是一種鵬卜蛋白酶，艦n型
分泌系統(tǒng)分泌至iM^卜。目前bm^現(xiàn)n型分泌系統(tǒng)由12-16個(gè)組^a^。
對(duì)彈性蛋白水解能力相關(guān)基因的研究可以進(jìn)一步完善群體密度感目 彈性蛋白酶的調(diào)控 網(wǎng)絡(luò)，揭示彈性蛋白酶的分泌調(diào)節(jié)過(guò)程。研究新基因的功能，探索銅綠假單胞菌的致病機(jī)制，為 藥物設(shè)計(jì)皿新的耙位點(diǎn)，為預(yù)防和抑制銅綠假單胞菌的 理論依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的JiJ^與菌株水解彈性蛋白能力相關(guān)的新基因，研究雜彈性蛋白
水解能力中的作用，以此為耙位點(diǎn)，設(shè)i憤的抗鵬物，預(yù)防和治療銅綠假單胞菌弓胞的感染。
本發(fā)明鄉(xiāng)的銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相錢(qián)因iM5W么是如序列^^列1麻T(mén)O ,列。
戰(zhàn)的銅綠假單胞菌7jC解彈性蛋白倉(cāng)巨力相幾因可以用于以該基因?yàn)樾驴嶞c(diǎn)設(shè)計(jì)并 制 制菌體水解彈性蛋白能力的藥物，以斷琪毒力i^C病性，增3S^素的藥效。
本發(fā)明基因尸^o"的獲得方法利用Mu轉(zhuǎn)jsta^bH:，構(gòu)建轉(zhuǎn)座子插入突^:庫(kù)，
性蛋白水解能力附氐的突變子，提取突^E株的基因組DNA，用i^"I酶切基因組DNA，酶切片 段與pUC18載體連接，艦電轉(zhuǎn)化將雜J^t/^fcA鄉(xiāng)桿菌DH5(x感受態(tài)細(xì)胞，涂在賴轉(zhuǎn) 霉素和卡那霉素) ^的LB平^i:， ^ilPCR和酶切鑒定，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)自定轉(zhuǎn)tt;子中 Mu所插入片段的核苷,列，經(jīng)NCBI中Blast ttXt確定Mu所插入的基因位置。本發(fā)明的有^m:
基因Mu轉(zhuǎn)座子插入失活的突變^7K解彈性蛋白能力斷氐，說(shuō)明雌因與銅綠假單胞 菌彈性蛋白酶的合成調(diào)賊分泌aii有關(guān)，而此前該基因是一個(gè)功能完絲知的新基因，本魏 首7:fc^現(xiàn)其與彈性蛋白水解能力相關(guān)。新基因功能的發(fā)W"揭示彈性蛋白酶的合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、分 泌過(guò)程、^tt藥物設(shè)計(jì)的耙位點(diǎn)，預(yù)防和治療銅綠假單胞菌的自皿指導(dǎo)意義。
圖1是菌^7iC解彈性蛋白能力示意1、野頓PA68作為陽(yáng)',照 2、尸，"::MuPA68突變株。 圖2 Mu克Pt^酶切^電泳M: DL15000 3、克I^T質(zhì)粒4、克軒質(zhì)f細(xì)^7"I酶切。
圖3. Mu轉(zhuǎn)座子PCR ,電泳圖訴PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的Mu轉(zhuǎn)座子)；
1、 DL2000 2、 Mu克軒PCR，。
表l.野^M菌株與^^株中/oy5、 /必/、 v^ 基因^^ii7K平的測(cè)定結(jié)果。
魏例i:艦Mu轉(zhuǎn)j^m^m行效子辦的粒
1. 從于37。Cl6 20h的ffl羊LB固體平fei^兆取一個(gè)單皿，轉(zhuǎn)到含有5mLLB液體培養(yǎng) 基的體中，37°C, 200ipm，過(guò)M蕩i歸14 18h。
2. 次日按l : 100轉(zhuǎn)接到含有100mLLB液體Jt^基的三角瓶中，37°C， 200rpm，振蕩*§#^勺 3-5h，使用752就鵬計(jì)測(cè)定細(xì)菌ig^^540nm處的吸光度，在ODs4o:^0.5 0.6時(shí)，停止歸。
3. 在無(wú)菌斜牛下將第2員養(yǎng)的菌,移到一^^菌的就冷的50mL離心管中，在冰上皿
lQmin,傲^t;糊至(rc。
4. 于4。C， 6000ipm，離心10min，麟菌體。
5. 倒出@#^，用^^IR的預(yù)冷的300mM虎塘重懸菌體，4°C， 6000rpm，離心10min。
6. 重復(fù)(5)，依 細(xì)1/2^R、 1/5^^預(yù)冷的300mM蔗糖溶^m懸、洗滌菌體。
7. 最后將細(xì)胞溶于lmL 300 mM蔗糖溶液中，按1(%17管^^ 1.5mL的無(wú)麟心管中，冰 鄉(xiāng)絲用。
8. 取l^iL Mu轉(zhuǎn)座復(fù)糊，力口APJ 100nL制備好的PA68感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，吸取混^tf)口入至!fl^冷的0.2cm電轉(zhuǎn)化杯中，用Bio-Rad電穿孔仗^S^J52.6kv，進(jìn)行電擊，i戰(zhàn)下電擊 所用的,和時(shí)間。
9. 在電擊后的轉(zhuǎn)化體系中加入1l5fe 37。C溫浴的900^L SOC ±歸基中，37°C， 200 rpm，復(fù)蘇lh。
10. MM蘇后的轉(zhuǎn)化體系涂^&含50^ig/mL卡那霉素的LB平肚。37。Ci歸16—18 h，陰 tM照不加Mu轉(zhuǎn)座復(fù)^tl。如果在陰',照平feJ:無(wú)mi:長(zhǎng)出，,性LB平fei:長(zhǎng)出的轉(zhuǎn) 化彌瑰一步離。
11. 取2m1轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)菌液做模板，以人工Mu轉(zhuǎn)座子上的特異序列Mul (5，-GCAACTGTCCATACTCTGA-3，)和Mu2 (5， - CGCTGGGnTATCGTCGA-3，)做引物，用 PCR方i增Mu轉(zhuǎn)座子片段。同時(shí)分別以銅綠假單胞ra株皿粒pHTH2做陰14^陽(yáng)性 對(duì)照。擴(kuò)增##為，先在94。CM性15min，然后，94。C^^性lmin， 55。C退火lmin， 72°C 延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)，雜72。C延伸10min。
12. PCRT^O.8%瓊月識(shí)繊中電泳檢測(cè)，EB她后紫外;l:TT觀察結(jié)果并留照片，具有700bp 卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化子即為Mu轉(zhuǎn)j^5變轉(zhuǎn)化子。
鄉(xiāng)例2:水解彈性蛋白能力改變的效子的離 1.在無(wú)菌i歸皿內(nèi)鋪上一薄層LB培養(yǎng)基，待其凝固后再鋪上一薄層彈性蛋白選#^#基(配 加口下每升i^&^基含彈性蛋白4g， ^W糖1 g,酵娜1 g, K2HP041 g， KH2PO40.5 g， MgSO 4.7H2O0.1g，瓊月謝20g, pH7.0)。從Mu轉(zhuǎn)座子突數(shù)庫(kù)中活化^f菌株，用滅菌的雅 挑取麟點(diǎn)種至膽歸基表面，37'Ci歸24>48h。細(xì)菌由于7jC解彈性蛋白的能力不同，在^#基上 形駄小不一的透明水解圈，以野頓菌株P(guān)A68為對(duì)照，j^W'隨白7jC解能力^^靴的菌株 (圖l)。
^6fe例3:銅^fg單胞菌水解彈性蛋白能力相^S因的克隆 第j、野4M和缺陷^^因組DNA的提取 1. ^Jf^劃線，的LB固體平^J^兆OT生^^缺陷株單,，接種到5mL Urolh液體:t^ 基中，37°C， 200rpm,過(guò)夜i歸；2. 次日按l : lOO的比例轉(zhuǎn)接到lOmLL-brolh液體歸基中，37°C， 200rpm，歸14-16h;
3. 將菌^fl移至一llmL離心管中，4°C， 12000rpm^離心lmin。棄去上清，麟菌體；
4. 在離心管中加入1 .lmL ,緩沖液(20 mM Tris'HCl pH8.0， 10 mM EDTA， 10 mM NaCl， 20% 賺)SffJ:浮菌體，再加入50pLRNase (10mg/ml)， 37。C水浴lh;
5. 力口入1.1 mL的2% SDS，充分振蕩至溶液澄清，再加IImL蛋白酶K (20 mg/ml)， 37'C水浴 過(guò)夜，其間經(jīng)徵番動(dòng)一T^心管，使蛋白酶K能充分zK解蛋白；
6. 力口入2.21^#^^的1 3卿苯酚/氯你混合液，劇烈振蕩，12000 rpm,離心20min;
7. 吸KJbMJ^Cffi轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，Sftffl酚/氯Ml提3次，操作步驟同6，至蛋白抽 提干凈為止；
8. 吸^±清，加入2fm^R(約4ml)^7jC乙醇，用|^#離細(xì)出沉淀，置^^^ff的llmL 離心管中，70%乙 ^次，^M少帶出、液體，真空千燥；
9. 細(xì)干后的DNA中加入1.5 mlTES溶液(500mMTris'HCl， pH8.0， 5mMEDTA， 50mMNaCl) 離DNA，之后加入15nlRNase (10mg/ml)， 37。C水浴lh;
10. 力口入1.511111118柳苯酚/氯娜提蛋白，12000 rpm，離心15min， ^U:清；重飾提一次， 肚清；力口入1.51111氯仿翻提—次，社清；
11. 加入2{§#^5&^乙醇(約4ml), -20°CS^S0.5h， 4'C， 12000rpm，離心10min;
12. 棄去上清，沉淀用lmL70。/。乙,滌2次，真空千鵬重溶"BS4的TE中。0.8%的瓊月離 繊電泳^l^測(cè)DNA的質(zhì)駄濃度。
第二步、質(zhì)粒的小量提取，參照《MolecularCloning》(Sambrook"o/., 1989 )的方法并加 以鵬。
1. 挑取轉(zhuǎn)化子單a^種于5mLLB液鵬養(yǎng)基中，37°C， 180rpm,過(guò)頓蕩i歸；
2. 取1-1.51^菌^^移至一1.51111離心管中，12000ipm， lmin，離心,菌體；
3. 棄去上清，菌體盡雖干，置于冰上，加入IOOmL預(yù)冷的溶液I (參見(jiàn)《MolecularCloning》)， 重懸繊冰浴5mins
4. 力口入200mL溶液II (1%SDS， 0.2mol/LNaOH)，輕輕的混合均勻至溶 的清^&粘稠，冰
6浴5min，注鎌液II^m現(xiàn)配；
5. 力口入150pL溶細(xì)I，輕輕的混勻，冰浴5min;
6. 4°C， 12000rpm，離心10min，吸祉清轉(zhuǎn)移至另一體中；
7. 新管中加入8pLRnase (10mg/mL)，艘37。C水浴中45min;
8. 加入^^P、(約400mL)的Tris飽和苯酚/氯仿/異戊HM合液(25 : 24 : 1 )抽提，4'C， 12000rpm，離心10min，吸^LL清轉(zhuǎn)移至另一新管中；
9. 新管中力口入2f^R (約lmL)預(yù)冷的557k乙醇，混合均勻，-20°C，艘20min;
10. 4。C， 12000rpm,離心10min，棄去上清；
11. 用lmL 70%乙1|^滌沉淀一次，真空千燥，沉淀溶^f^M的(10-50mL) TE (pH=8.0)貌菌水中。
12. 0.8%的瓊月|^ 電泳檢測(cè)提取的質(zhì)粒的量，以DL15000為DNAi)^量標(biāo)準(zhǔn)。第三步、載體pUC18質(zhì)粒的酶切及彌酸化鵬
用限制性內(nèi)切酶/^I酶切鵬pUC18質(zhì)粒，酶切的方法參見(jiàn)TaKaRa公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。此酶切，可以直接用電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，若酶切完全，貝iJ終ihES，采用加熱鵬(6(TC 15min)使限制性內(nèi)切酶失活。
酶切鵬體系的鵬
(1) 用^f^R的Tris柳苯酚/氯仿/異戊醇鵬一次，4°C， 12000rpm，離心10min,轉(zhuǎn)移上清至另1離心管中；
(2) 加入l/10體積的3MNaAC(pH4.8)， 2倍^^1^冷的^7K乙醇，、凝B均勻后，于一20。C中
(3) 4。C， 12000 rpm離心10 min， DNA沉娜70X乙^fe滌兩次，真空千燥。沉淀溶預(yù)量的TE (10 mM Tris.HCl， 1 mM EDT入pH8.0)緩沖^S菌水中。
為防止載體自身連接SiS，斷K^化時(shí)的背景，提高3i^效率，用小腸堿性磷酸單酯酶(CIAP)除去線形化的pUC18 W5，^^il酸。具#^法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。第四步、連接、轉(zhuǎn)化及 1.連接鵬體系(總糊為2。Ml):
基因組DNA和質(zhì)粒pUC18的,(15pl體系)
DNA lpL ddH20 10pL pUC18 lpL
混勻，45。CzK浴5射中后，fflil冰浴，再力卩T4連接酶L5ML， 10xbuffer 1.5mL， 1冬16。C水浴過(guò)夜。
2連接,的艦
(1) TE補(bǔ)超200pL。
(2) 加入2倍糊的557K乙柳1/10 #^、的3mol/LNaAc(pH4.8)， -20。C，20min沉淀DNA。
(3) 4。C 12000ipm離心10min，棄上清。
(4) 力口入lmL70o/o的冷乙麟DNA沉淀兩次，真空千燥。
(5) 沉淀溶于5(aLddH20中。14pl ddH20， lpl酶切處Sjg的基因組DNA， lnl酶切鵬后的 載體pUC18片段，混和均勻，45"C水^^溫5min。
(6) 取出后立即置于冰上，力nA2[jI10xT4DNALigase Buffer, 2nlT4,DNALigase，混勻，16。C 鵬16>24h;
3.娜桿菌感菱態(tài)細(xì)胞的制備
(1) 挑脫ffl羊劃線線的;y^桿菌單離接種于5mLLB液體i^^基中，37°C， 180rpm，過(guò) 夜振蕩歸；
(2) 按1 : 100的比例轉(zhuǎn)接至200mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 180rpm，振蕩培養(yǎng)至 0060^0.5-0.6，約3-5h;
(3) 將菌^f移至無(wú)菌的250mL離心管中，4°C， 6000rpm,離心10min， if^^菌體；
(4) 棄去上清，加入^R (200mL)的無(wú)菌去離子水(預(yù)冷)，重懸沉淀，4'C， 6000tpm， 離心10min;
(5) 棄去上清，力口入l/2術(shù)只(100mL)的無(wú)菌去離子水(預(yù)冷)，重復(fù)步驟(4)鵬作；(6) 加入l/2鵬(lOOmL)的無(wú)菌腦甘油(預(yù)冷)，鼓步驟(4),作；
(7) 力口入1/100 ^f只的無(wú)菌10%,油(預(yù)冷)，重懸沉淀，^Ml.5ml無(wú)麟心管中，95nL7 管，.70。C保存。
4. 規(guī)桿菌DH5a的電轉(zhuǎn)化施
(1) 5nLDNA雜，與95pL規(guī)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴5-10min。
(2) 混^t/^移至預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)化杯中(陰'IW照不加混合物，只加感受態(tài)細(xì)胞)，在 Bio-Rad電轉(zhuǎn)化處體2,50kv，進(jìn)行電擊。
(3) 從電轉(zhuǎn)化杯中吸出電轉(zhuǎn)化體系，并用lmL37r預(yù)熱的SOC液體i^^基(20g/L胰蛋白胨， 5g/L酵娜，0.5g/LNaC120mM麟糖，lOmM氯化鎂)糖后，37°C， 150轉(zhuǎn)/餅 歸lh。
(4) 菌液^(^布^" 20mmol/L MgS04 50ng/mL卡那霉素和IOO嗎/mL氨^W霉素的LB固 體歸基上，37。C倒數(shù)夜歸。
5. 克軒的飾鑒定
(1) M31夜培養(yǎng)的Mfi:平^hM取轉(zhuǎn)化子，小量提^M粒，用限制性內(nèi)切酶^p"I酶切
(2) 以DL15000為DNA標(biāo)準(zhǔn)，在0.8%瓊月離 中電泳檢測(cè)鑒定，衫跑同時(shí)具有pUC18 載體帶和外源目的基因帶的克軒(圖2)。
(3) 同時(shí)以從轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒為纟鎌，用Mu轉(zhuǎn)座子DNA片段的Mu轉(zhuǎn)座子檢測(cè)引物 Mu-kamPl和Mu-kamP2進(jìn)行PCR (具^(guò)^法同實(shí)施例1中所述)。電泳檢測(cè)PCR，， 以DL2000為DNA標(biāo)準(zhǔn)，以質(zhì)粒pHTH2為lBt照，若能擴(kuò)增出700bp的特異性帶，則 說(shuō)明轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒中含有AXMu轉(zhuǎn)座子DNA片段，克隆成功(圖3)。
(4) 對(duì)鵬克隆的轉(zhuǎn)化子質(zhì)織行測(cè)序。
6. 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的DNA觀!l序 以Mu轉(zhuǎn)座子兩端的反向序列為依據(jù)設(shè)計(jì)的AM42P1作為引物進(jìn)行測(cè)序。^Eh海英俊公司
進(jìn)行DNA測(cè)序。
7. 基因定位測(cè)序結(jié)果在銅綠假單胞菌的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(h p//www.pseudomonas.com)或GenBank (htto://wwwjicbi.n]nLnflLgov/)中BLAST進(jìn)行序列t瀏找到Mu所插AS因在銅綠假單胞菌基因 組中的錢(qián)。 、
其中^t^化子Mu轉(zhuǎn)鵬突變的基因是E4M22。 ^!ffi例4:相^S因啟動(dòng)子,盼測(cè)定
1. 啟動(dòng)子-/^2融合質(zhì)粒的構(gòu)建
應(yīng)用預(yù)測(cè)軟件，尋找/必/、 v^及三個(gè)基因上游可能的啟動(dòng)子序列。使用軟件由 http:〃www.fruitflv.org/sea 10015/0101110161:1111111網(wǎng)^1#^ 1999 NNPP version 2.2 (March 1999) of the promoterpredictor。以PA68基因組DNA為模板，將ltW究的三個(gè)基因各自上游的一SJ^列進(jìn)行擴(kuò) 增，所有的序列均應(yīng)包娜測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)和調(diào)控基因編碼區(qū)的頭部，且反芽物內(nèi)部不含￡toRI 位點(diǎn)和5omffl位點(diǎn)。正向引働tl五coRI位點(diǎn)，反向引働HtoHI位點(diǎn)，便于將來(lái)與報(bào)告基因的正 向融合。擴(kuò)增并^ii fcoRI和5鵬HI酶切的DNA片段與^3l同樣mSI切的pBluescript-SK連接構(gòu) 建^中間質(zhì)粒pSKPLI， pSKPB, pSKPV(具,作同^li例3 )。^31測(cè)^^析的中間質(zhì)禾4ffl五coRI 和及卵ffl酶切得到外源外段與同樣雙酶切的？01^191300連接構(gòu)建完成啟動(dòng)子-/^2融合質(zhì)粒 pDN19PLI， pDN19PB， pDN19PV (具鵬作同^St例3)。
2. 將構(gòu)辦的融合質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)4^^感受態(tài)細(xì)胞PA68及E45022突變株中(具鵬作同^M例1)。 分別挑取PA68， ^5022突變船有融合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子的,單麟，接種矜50ug/ml四環(huán)素 的液體LB中過(guò)夜，。次日轉(zhuǎn)接到20ml LB液體i歸基中，調(diào) 始菌液OAoo為0.02， "。C 200ipm通氣震蕩歸18h，參考纖er的方法測(cè)定^判L蹄酶活性(畫(huà)er， 1972)，比較每對(duì)PA68 和iM50"突變株中融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的酶活差異。結(jié)果見(jiàn)表l。 A糊離酶活性的測(cè)定施如下
(1) ^W菌液于冰水混糊中冰浴20min;
(2) 取lml菌液，以i歸基為參比，測(cè)定600nm吸，；
(3) 取100^1菌液，加入900^1 Z Buffer;
(4) 加入氯仿10Ml， 0.1%SDS15^1，震蕩10s;(5) 28。C水浴5min;
(6) ^31M的菌液中加入0.2ml ONPG， 28'C7iC浴中搖動(dòng)^H^開(kāi)始，精確計(jì)時(shí)到El^輕現(xiàn) 黃色；
(7) 待轉(zhuǎn)黃后，力口入0.5mllmol/LNa2CO3使鵬中止；
(8) 12000rpm離心2min，祉清，以ZBuffer為參比，測(cè)定420nm的吸爐。 注)Z Buffer的配制，每贈(zèng)
16.1gNa2HP04H20， 5.5gNaH2P04H20， 0.75gKCl，
0.246gMgSO47H2O， 2.7ml巰基乙醇，調(diào)節(jié)pH至7.0
ONPG的配制
翻稱量O腦，用ABuffer溶解，配制成4mg/ml濃度
ABuffer的配制
0.1MNa2HPO4， 0.1MNaH2PO4
表l野^M菌株與突變株中/asB、 te/、叫si 基因轉(zhuǎn)^7jC平的測(cè)定
PA68/promoter-/^5Q22 mutant/promoter-
418±35178±13
582&t2131151±72
Pfag-lacZ1182±57137±12
/os/、 v^si 、 /0^啟動(dòng)子-/0￡^融合質(zhì)粒，^菌株、iM5W2突變株中測(cè)定 的酶雜果，結(jié)果為三次糊測(cè)定酶活的平均值it示瞎，單勧纖er Units
11序列表
<110>南開(kāi)大學(xué)
〈20H^fg單胞菌7Klf彈,白倉(cāng)幼相^因iM5022及其，
<160>1
<210>1
<211>3357
<212>DNA
<213,綠假單胞菌(尸犯Mato/wonasflerugfwosw,PA) <400>1
atgcctgcccttcgctccctgatcgctattcttttcctcggcctctgccttgccagtccg60
ccgctcctcgcccagtccgagccgccctcggccgaggccgtccagcaaagcctcgacaag120
ctggccgagcgcaagctcgccgaagccgaccagaaggtcgccaaggccagcctcgaacag180
accctcaagttcctcgccgcgcgcgacgaagcgctgcagagcctggaggacctgaaaaag240
cgcctgagcgacgcgccccggcagatcgaggaaaaccagcgcgaactggagcgcctgaag300
aagaccaaagaacgtccggtcagcgaacgctacagcggcgagagcgcggcccgcctggaa360
atgctgctcaacgaccgcaccacccagcaggccgagtggcagaaagccctgggcgaggcc420
aacagcctgtcgatcaccgccg縛acccgtccggaacgagccc鄉(xiāng)ccggcatcagcagc480
atgcaggcacggatcctggaaatcggctcgctgctcaaggccggcaaggaaagcggcaag540
acgatcaacgccgaccgtcgcggcgagctgctcgccgagcaggccgcattgaccgtgcag600
agccagctgttgcgccaggagctggccggcaacaacctgctgcaggacctcggcaagagc660
cagcacgatctgctcaccgagaagatctcgcgcctggaaa鄉(xiāng)aaaccctcgacctgcag720
gcgctgatcagcgagaagcgccgcgagcagtcggaaaagaccgtcgccgagctgtccaag780
gaaggcgcccagggggccggcaccgacagcctgctgagccaggagaacgccaagaacctg840
cgtctctccgactacctgctgcgcgccaccgaccgcctcaacgtgctcacccggcgcaac900
ctcgagaccaagcagcaactggacaacctgacccagtccaaccaggccctcgaggaacag960
atcaacgtcctgcgcggcagcctgctgctgtcgcgcatcctctacaagcagaaacaggcg1020
ctgcccaagatcaaggccgaccagagcctggccgacgagatcgccgacctgcgcctcggc1080
cagttcgaactgaaccaggaacgcgacaagctggcgaccccgcagcaatacctggacgac1140
ctgctcgcccagcagcccagcgagcaggtcacgccggaactgcgcaaggatctcgacacc1200
ctgttggcaacccgttccgagttgctcgaacggctcaaccacgaactcaacgcgctgctc1260
aacgaagcgatcaccttgcagttgaaccagaaacagttgctttccaccagcgagagcctg1320
cgcaccaccctcgacgagcagatgttctggattcccagcaaccagccgctcgacctgtcc1380
tggttcaagatgaccccgaccctgctgaagaaccagctcaccgagatcccctggggctcc1440
ggggtgcgtgaactgggcgaaggcctggtcgatcggccgctgctgttcctgccgctgttc1500
ctgctgatcgccgcgctgctgtggaaacgccgctacctgtacgacaagctggcggagctg1560
aacgacgacatcggccacttcaagcgcgacagccagttgcataccccgctggcgatcctg1620
atcaccatcctcctcgccctgcccggcaccctgaccttcgccgtcgccgggctggccctg腳
ctgctggacgcccgcggccagaacgccaccctcggcagcgccctgctggaaatggcccag1740
gtctggctgctgttctacaccgcccatcgcatcctcaccccgggcggcatcgccgagcgg■
catttccactggagccgcgaacaggtcggcttcctcgaccggcacctggtccgcctcggc腳
gttgtggtcctggcgctggtcggcgtggtgacggtggccgagcaccagccggcgagtctg1920
gccgacgacgtgatcggcatcgcxgtggtcctgctcggctacgcggccatggcctggctg1980
ctcagccgcctgctgttcagcagccccggcgacgaacgtccgtcgctgatcaagatgatc2040
gtcggcatcctcttcaccgcgctgccgctggtgctcttcgtcgcggtctgcttcggctac2100
tactacacctcgctgaagctcaccgaccgtctcatcgataccctttacctgctgctgctc2160
tggttcgtcatcgaagccgccttcgtccgcggcctgggcgtggcggcccggcgcctggcc2220
tacgcccgggccctggcgaaacggcagaacgcggcgaaggaaggcgtcgacggcgagacc2280
aacgtcgaggagccgaccctcggcatcgagcagatcaaccagcaatcgctgcggctgatc2340cgcctggctc tgctgatcgg cttcatcgtc agcgtgatct cctacctcga caacgtcacc gcggccacca gcgtgccgat cagcctgcgc gtcaccgtgg ccctggcgcg caacctgccc ctgaccctgg cccagggcag cgcctacgcc ggcatcggca tcgtcagcgc cctgtccacc ctggtggcgg cgctctcggt aggcctcggt gtctccggcc tgatcatcct cttcgagcgt ggcaacctgt ccggcacggt cagccggatc gaccgcaagg agatcatcgt cccgaaccag tcgctgagcg ataccgtgac ccgggtcacc ctgccgctgg cgcgcaagct gatgatgcag gacccggagc cgctgctgta cttcctgacc cgcttccacg tccgcgaact gggcgaccgc atcgccacca gcttccgcga acacaagatc gtcaagaacc tccagggcca gcaggtccag gtcggcaatc cgcccgcgct caagggccag
tgcctgtactgggtctgggccgacctgatc2400
ctgtaccagtacaccgccggcaccggcgaa2鄰0
gacttcctcgcggcgctggccatcgcggtg2520
ggcctgctggaagtcctggtactgcagcgc2580
accaccaccctgctttcctacgccatcagc2640
ctcggggtcagctgggacaagctgcaatgg2700
ttcggcctgcaggcgatcttctccaacttc2760
ccggtacgaatcggcgacgtggtgaccatc2820
cgcatccgcgccaccaccatcaccgatttc2880
accttcatcaccgggcaactggtgaactgg2940
atcaagatcggcctggcctacgagaccgac3000
gcggtcaaggaaaacccgcgggtactgcgc3060
atcagcgccagtaccttcgactacgagctg3120
aacccctctaccgacgagatcctgacgaag3180
gacatggctttcaaccaggtcgatgtgttc3240
ctgttcgtcggcgagccgcagcacagcggc3300
gacggtcccgccgaaccgacccgctga3357
1權(quán)利要求
1、一種銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相關(guān)基因PA5022，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
2、 權(quán)利要求1皿的銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相皿因^^2的應(yīng)用，用于以] 因?yàn)樾滤嶱E點(diǎn)設(shè)計(jì)并制，制菌體彈性蛋白酶產(chǎn)生的藥物，以斷氐其毒力皿病性，增強(qiáng)抗生素 的藥效。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了銅綠假單胞菌水解彈性蛋白能力相關(guān)基因PA5022及其應(yīng)用。屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域。此基因大小為3357bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示。目前國(guó)際上對(duì)該基因的功能尚沒(méi)有確切報(bào)道。銅綠假單菌的彈性蛋白酶是一種鋅金屬蛋白酶，能夠水解彈性蛋白，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PA5022基因的失活導(dǎo)致銅綠假單胞菌水解彈性蛋白的能力降低。銅綠假單菌的彈性蛋白酶是該菌的重要的毒力因子及致病因素。對(duì)該基因的發(fā)現(xiàn)及研究有助于研究銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的合成與調(diào)控機(jī)制，揭示銅綠假單胞菌的致病機(jī)理，為預(yù)防和治療該菌引起的感染提供理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/57GK101643741SQ20091007037
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者喬明強(qiáng), 劉力偉, 張秀明, 徐海津, 銳 牟, 白艷玲, 米曉媛, 靳永新 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)