專利名稱：一種可水解3-羥基丁腈的微生物菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地說，涉及一種可水解3-羥基丁腈的微生物菌株。
背景技術(shù)：
3-羥基丁酸，俗稱羥基丁酸，含有兩種光學(xué)活性對映體，分別是(R)-3_羥 基丁酸和(S)-3-羥基丁酸，是重要的制藥原料及藥理學(xué)試劑；其中，(S)-(+)-3-羥基 丁酸是高血脂治療藥物(R)-4-羥基-3-羥基丁酸[(R)-GABOB]，腦新陳代謝的促進劑 (SPOxiracetam(奧拉西坦)，艾滋病藥物，安定劑以及最新一代抗菌藥物的關(guān)鍵中間體； 而(R)-3-羥基丁酸不僅具有營養(yǎng)功能，還能治療如神經(jīng)紊亂疾病，神經(jīng)退化性疾病，供氧 不足，心絞痛，心肌梗塞和糖代謝紊亂等疾病。3-羥基丁酸可以通過分子間的酯化反應(yīng)生成聚3-羥基丁酸酯(PHB)，由于PHB具 有生物降解性、生物相容性、光學(xué)活性、壓電性、抗紫外性等優(yōu)良性質(zhì)，故PHB不僅僅用來制 備生物完全降解塑料，在電子、光學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等其它高科技領(lǐng)域也有很廣的用途。有關(guān)3-羥基丁酸的化學(xué)合成方法的報道很多，主要包括以下幾種方法⑴丁 內(nèi)酯的水解法；⑵利用Reformatsky反應(yīng)法；(3)乙酰乙酸乙酯還原法；⑷由丁烯酸水合 制備法；(5)以乙醛和乙酸為原料、萘鋰為催化劑制備；(6)環(huán)氧丙烷水解法；(7)乙醛經(jīng)羥 醛縮和生成3-羥基丁醛氧化法(山東科學(xué)，2001，14(1) :43-49)。雖然有多種3-羥基丁酸 的化學(xué)合成路線，但是化學(xué)合成工藝復(fù)雜，反應(yīng)條件比較苛刻，對設(shè)備要求高，而且金屬催 化劑價格昂貴，易造成污染，對環(huán)保不利；而且得到的產(chǎn)物為外消旋體，很難獲得具有光學(xué) 活性的3-羥基丁酸單體。而生物法由于方法簡單、條件溫和、反應(yīng)較快，日益獲得廣泛的關(guān)注，現(xiàn)有使用的 生產(chǎn)3-羥基丁酸的生物法主要包括Ottaway TH(Biochem J，1962，84 11 12)利用微生物合成聚 D_(-) _3_ 羥基 丁酸，然后降解該聚合物得到D-(-)-3-羥基丁酸單體，如利用芽苞桿菌屬中的Bacillus megaterium和Bacillus cereu在含有適當能源的適宜介質(zhì)中生長產(chǎn)生聚_3_羥基丁酸顆 粒，將生成的聚3-羥基丁酸再通過酶催化或酸條件下水解生成自由酸。但是此方法工藝復(fù) 雜，生產(chǎn)投入大，分離純化困難，使D- (-) -3-羥基丁酸的成本較高。陳國強等(CN1217001C，CN1357629C)利用基因工程手段將合成聚(R)_3_羥基 丁酸(PHB)的前體基因phbA、phbB和ptb、buk克隆到質(zhì)粒載體中構(gòu)建出重組質(zhì)粒，再將 其轉(zhuǎn)到大腸桿菌中構(gòu)建DNA重組菌株，發(fā)酵培養(yǎng)含這四個基因片段的重組大腸桿菌獲取 (R)-3-羥基丁酸。但是重組的大腸桿菌在生產(chǎn)過程中質(zhì)粒容易丟失，所以將基因工程菌用 于大規(guī)模生產(chǎn)還處于進一步探索之中。而利用細胞或酶催化乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備光學(xué)活性的3-羥基丁酸酯 后，將其產(chǎn)物水解也是獲得光學(xué)活性的3-羥基丁酸的一種方法(化學(xué)反應(yīng)工程與工藝， 2007,23 (2) 173-177 ； J. Fennen. Bioeng. ，1993,76 33-37 ;J. Biosci. Bioeng. ，2001， 91(4) :368-372)。但是該方法中的底物乙酰乙酸乙酯難溶于水，在有機相中反應(yīng)細胞或酶
4容易失活，限制了產(chǎn)物的時空產(chǎn)率，而且在還原過程中需要等化學(xué)計量的輔酶?，F(xiàn)有的這些生產(chǎn)3-羥基丁酸的生物方法，普遍存在產(chǎn)量低、成本高、價格昂貴等缺點，影響了在工業(yè)上的研究，開發(fā)和應(yīng)用推廣。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 一種微生物菌株Arthrobacter nitrogua jacol icus，該菌 株經(jīng)培養(yǎng)后，獲得的反應(yīng)液能用于生物催化生產(chǎn)3-羥基丁酸。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicuso本發(fā)明還有一個目的在于，提供菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的一種斜
面培養(yǎng)基。本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種用于Arthrobacter nitroguajacolicus發(fā)酵
的培養(yǎng)基。本發(fā)明還有一個目的在于,提供菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus 的 16S rDNA序列如 SEQ ID NO 1所示。根據(jù)本發(fā)明，菌株Arthrobacter nitroguajacolicus 的保藏號為 CGMCC No. 2405本發(fā)明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的斜面培養(yǎng)基的配方如下 碳源0. 2 2. Owt % ；氮源0. 2 2. Owt % ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ；瓊脂粉1. O 3. Owt% ；pH 6. 4 7. 5。本發(fā)明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下 碳源0. 5 3. Owt % ；氮源0. 2 3. Owt % ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ；半胱氨酸鹽酸鹽或半胱氨酸0.01 0. Iwt % ；有機腈0.01 0. lv/v% ；pH 6. 4 7. 5。本發(fā)明提供的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的應(yīng)用為用于生產(chǎn)腈水解 酶或用于生物催化生產(chǎn)3-羥基丁酸。根據(jù)本發(fā)明，催化生產(chǎn)3-羥基丁酸包括以下步驟A、)(寸胃_ Arthrobacter nitroguajacolicus WifRW ；B、對步驟A中獲得的發(fā)酵液進行預(yù)處理，獲得細胞濃縮液；C、利用步驟B中獲得的細胞濃縮液水解3-羥基丁腈，得到3-羥基丁酸。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，對發(fā)酵液進行的預(yù)處理包括固液分離步驟，其中 固液分離的方法為中空纖維微濾膜、中空纖維超濾膜、陶瓷膜、卷式微濾膜、卷式超濾膜、平 板Utro-flo膜系統(tǒng)、碟片離心分離或管式離心分離。本發(fā)明的菌株Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發(fā)酵產(chǎn)物能 夠水解3-羥基丁腈生成3-羥基丁酸，因而具有工業(yè)化生產(chǎn)3-羥基丁酸的潛力。使用上述 方法制備3-羥基丁酸，具有原料便宜易得，水解副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，因此，具 有很高的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。
圖1為水解產(chǎn)物的紅外光譜檢測結(jié)果。圖2為水解產(chǎn)物的紫外可見(200-500nm)吸收光譜檢測結(jié)果。圖3為水解產(chǎn)物的屮NMR檢測結(jié)果。圖4A為水解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析圖譜，圖4B為質(zhì)譜圖的分析數(shù)據(jù)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。W^tt Arthrobacter nitroguajacolicus, BT 2008 ^ 3月17日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為 CGMCCNo. 2405。以下實施例中，采用高效液相色譜法測定水解產(chǎn)物3-羥基丁酸的含量，具體過程 如下檢測條件色譜柱為150mmX4. 6mm,不銹鋼柱，內(nèi)裝Kromasil 0DS C18、5u的填 充物；流動相為磷酸二氫鈉緩沖液乙腈=95 5(V/V)；流速為0. 5ml/min ；檢測波長為 210nm ；柱溫為30°C ；進樣量為20 u L。檢測方法稱取3-羥基丁酸標準品0. lg，置于50mL容量瓶中，用流動相溶解，搖 勻。稱取約含3-羥基丁酸0. lg的樣品，置于50mL容量瓶中，用流動相溶解，搖勻。在上述色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標準品溶液，待相鄰兩針標準品 溶液峰面積的響應(yīng)值變化小于1.0%時，按照標樣、樣品、樣品、標樣的順序進行測定。將測 得的兩針樣品以及前后兩針標樣的峰面積進行平均。試樣的質(zhì)量分數(shù)按以下公式計算
v mx X A2義=—~rx p m2 x A^其中，A,為標準品溶液中3-羥基丁酸峰面積的平均值；A2為樣品溶液中3-羥基丁酸峰面積的平均值；mi為稱取3-羥基丁酸標準品的質(zhì)量，g ；m2為稱取試樣的質(zhì)量，g ；P為標準品中3-羥基丁酸標準品的質(zhì)量分數(shù)，％。以下實施例中，采用使用HPLC (島津公司，Shim-pack VP-0DS)分析測定產(chǎn)物光學(xué) 純度，具體過程如下流動相為ImM CuS04,流速為0. 8mL/min,檢測波長為254nm，柱溫為20°C ;S和R構(gòu) 型的3-羥基丁酸含量利用手性柱(Chiralcel OA,日本Sumichral公司)測定，以確定產(chǎn)物 的對映體過量值((ee，％ ) = (CS-CE) / (CS+CE) X 100%，其中，Cs和CK分別表示S和R構(gòu)型 對映體的濃度)。實施例1、斜面培養(yǎng)基的配制分別按照表1所示的配方配制斜面培養(yǎng)基，獲得斜面培養(yǎng)基1-5。表1、斜面培養(yǎng)基配方)
實施例2、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制分別按照表2所示的配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基1-5。
表2、發(fā)酵培養(yǎng)基配方(wt % ) 實施例3、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發(fā)酵培養(yǎng)Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 ^^JftftM^JIM 1 制的斜面培養(yǎng)基1-5上，于28°C培養(yǎng)3 4天，獲得培養(yǎng)斜面1-5。然后，從培養(yǎng)斜面1-5 上挑取 Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 相應(yīng)接種到實施例2中配制的發(fā)酵培養(yǎng)基1-5中，于28°C，220rpm培養(yǎng)4天，獲得發(fā)酵液1-5。實施例4、使用 Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的細胞懸浮液 水解3-羥基丁腈將發(fā)酵液1-5分別進行固液分離(離心分離)，去離子水洗滌細胞。然后，用去離 子水懸浮收集的細胞，獲得細胞懸浮液1-5。分別向細胞懸浮液1-5中加入3-羥基丁腈至終濃度為(W/V)，然后于28°C反 應(yīng)24h，獲得反應(yīng)液1-5。反應(yīng)結(jié)束后，分別將反應(yīng)液1-5離心，收集離心上清。然后，取部分離心上清，送華東理工大學(xué)分析中心進行以下檢測紅外光譜檢測、 紫外可見(200-500nm)吸收光譜檢測、1HNMR檢測和低分辨率EI-MS測定，以確定水解產(chǎn)物。檢測獲得的譜圖分別如圖1-4所示。上述譜圖與標準的3-羥基丁酸的相應(yīng)譜圖 相符，因此，可確定水解產(chǎn)物為3-羥基丁酸。同時，取部分離心上清，進行液相色譜分析，以確定反應(yīng)液1-5中3-羥基丁酸的含 量，并計算其轉(zhuǎn)化率，同時測定光學(xué)純度，結(jié)果如表3所示。表3、反應(yīng)液檢測結(jié)果 表 3 的結(jié)果顯示，Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 能用于水解
3-羥基丁腈，獲得3-羥基丁酸，且其轉(zhuǎn)化率較高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。同時，根據(jù)表3的數(shù)據(jù)，以斜面培養(yǎng)基2和發(fā)酵培養(yǎng)基2培養(yǎng)的細胞活性最高，其 轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物3-羥基丁酸的光學(xué)純度都優(yōu)于其他幾組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞。斜面培養(yǎng)基2 和發(fā)酵培養(yǎng)基2為最優(yōu)培養(yǎng)基。實施例 5、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的 16S rDNA序歹lj測 定測序取Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 細胞送中科院北京微生物 研究所檢測，并測定其16s rDNA，其16s rDNA序列如SEQ ID NO 1所示。實施例6、Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發(fā)酵產(chǎn)物的預(yù)處
理方法以實施例3的培養(yǎng)條件以及實施例4確定的最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405的發(fā)酵液，然后取相同量的發(fā)酵液分別以中空纖維微濾膜、中空纖維超濾膜、陶瓷膜、卷式微濾膜、卷式超濾膜、平板Utro-flo膜系統(tǒng)、碟片離心 分離以及管式離心分離的處理方法進行固液分離，得到相應(yīng)的細胞懸浮液6-13。細胞懸浮液6-13以實施例5所述方法進行3-羥基丁腈的水解反應(yīng)和數(shù)據(jù)測定， 結(jié)果如表4所示。表4、反應(yīng)液檢測結(jié)果 表4的數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵液經(jīng)上述固液分離的方法處理后，細胞的活性破壞較少，能 達到良好的分離效果。綜上所述，本發(fā)明的菌株Arthrobacternitroguajacolicus CGMCC No. 2405 的發(fā) 酵產(chǎn)物能夠水解3-羥基丁腈生成3-羥基丁酸，因而具有工業(yè)化生產(chǎn)3-羥基丁酸的潛力。 使用上述方法制備3-羥基丁酸，具有原料便宜易得，水解副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點， 因此，具有很高的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。序列表<110>上海市農(nóng)藥研究所<120> 一種可水解3-羥基丁腈的微生物菌株<130>P5091016<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1395<212>DNA<213>Arthrobacter nitroguajacolicus CGMCC No. 2405<400>1ccttcgacgg ctccccccac aagggttagg ccaccggctt cgggtgttac caactttcgt 60
gacttgacgggcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcgt tgctgatctg120cgattactagcgactccgac ttcatggggt cgagttgcag accccaatcc gaactgagac180cggctttttgggattagctc cacctcacag tatcgcaacc ctttgtaccg gccattgtag240catgcgtgaagcccaagaca taaggggcat gatgatttga cgtcgtcccc accttcctcc300gagttgaccccggcagtctc ctatgagtcc ccgccataac gcgctggcaa catagaacga360gggttgcgctcgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat420gcaccacctgtaaaccgacc gcaagcgggg cacctgtttc caggtctttc cggttcatgt480caagccttggtaaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg540cgggcccccgtcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcggggcac600ttaatgcgttagctacggcg cggaaaacgt ggaatgtccc ccacacctag tgcccaacgt660ttacggcatggactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccatgcttt cgctcctcag720cgtcagttacagcccagaga cctgccttcg ccatcggtgt tcctcctgat atctgcgcat780ttcaccgctacaccaggaat tccagtctcc cctactgcac tctagtctgc ccgtacccac840tgcagaaccggagttgagcc ccggtctttc acagcagacg cgacaaaccg cctacgagct900ctttacgcccaataattccg gataacgctt gcgccctacg tattaccgcg gctgctggca960cgtagttagccggcgcttct tctgcaggta ccgtcacttt cgcttcttcc ctactgaaag1020 aggtttacaacccgaaggcc gtcatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gcttgcgccc1080attgtgcaatattccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag1140tgtggccggtcaccctctca ggccggctac ccgtcgtcgc cttggtaggc cattacccca1200ccaacaagctgataggccgc gagtccattc aagctttcca ccaccatgac1260atgcgccagatggtcgtatc cggtattaga cccagtttcc caggcttatc ccagagtcaa1320gggcaggttactcacgtgtt actcacccgt tcgccactaa tcccccagca agctgggatc1380atcgttcgacttgca139權(quán)利要求
一種微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus，其特征在于該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于該菌株的保藏號為CGMCCNo. 2405。
3.如權(quán)利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的斜面培養(yǎng)基，其 特征在于，所述斜面培養(yǎng)基的配方如下碳源0. 2 2. 0wt% ； 氮源0. 2 2. 0wt% ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ； 瓊脂粉1.0 3. 0wt% pH 6. 4 7. 5。
4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源為葡萄糖。
5.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述氮源為酵母膏。
6.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述金屬離子為Na+，K+和Mg2+。
7.如權(quán)利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的發(fā)酵培養(yǎng)基，其 特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下碳源0. 5 3. 0wt% ； 氮源0. 2 3. 0fft% ；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0. 01 0. 5wt% ； 半胱氨酸鹽酸鹽或半胱氨酸0. 01 0. lwt% ； 有機腈:0. 01 0. lv/v% ； pH 6. 4 7. 5。
8.如權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述碳源為葡萄糖。
9.如權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述氮源為蛋白胨和/或酵母膏。
10.如權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述金屬離子為K+和Mg2+。
11.如權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述有機腈為苯甲腈。
12.如權(quán)利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的應(yīng)用，其特征 在于用于生產(chǎn)腈水解酶。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腈水解酶為胞內(nèi)酶。
14.如權(quán)利要求1或2所述的菌株Arthrobacternitroguajacolicus的應(yīng)用，其特征 在于用于生物催化生產(chǎn)3-羥基丁酸。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物催化生產(chǎn)3-羥基丁酸包括以下 步驟A、對菌株Arthrobacter nitroguajacolicus 進行發(fā)酵；B、對步驟A中獲得的發(fā)酵液進行預(yù)處理，獲得細胞懸浮液；C、利用步驟B中獲得的細胞懸浮液水解3-羥基丁腈，得到3-羥基丁酸。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于所述預(yù)處理為將細胞發(fā)酵液經(jīng)固液分離， 去離子水洗滌細胞后，用去離子水懸浮收集的細胞，獲得細胞懸浮液。
17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于所述固液分離的方法為中空纖維微濾膜、 中空纖維超濾膜、陶瓷膜、卷式微濾膜、卷式超濾膜、平板Utro-flo膜系統(tǒng)、碟片離心分離2或管式離心分離。
全文摘要
本發(fā)明的目的提供了一種微生物菌株Arthrobacter nitroguajacolicus及其斜面、發(fā)酵培養(yǎng)基及菌株的應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明提供的斜面培養(yǎng)基配方為碳源0.2～2.0wt％；氮源0.2～2.0wt％；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0.01～0.5wt％；瓊脂粉1.0～3.0wt％；pH6.4～7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(wt)碳源0.5～3.0％；氮源0.2～3.0％；微量金屬離子以金屬鹽的量計為0.01～0.5％；半胱氨酸鹽酸鹽或半胱氨酸0.01～0.1％；有機腈0.01～0.1％；pH6.4～7.5。本發(fā)明提供的菌株可用于生產(chǎn)腈水解酶，利用該菌株生產(chǎn)的腈水解酶可催化3-羥基丁腈生產(chǎn)3-羥基丁酸。使用上述方法制備3-羥基丁酸，具有原料便宜易得，水解副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，因此，具有很高的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。
文檔編號C12R1/06GK101875907SQ20091005013
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者唐璐敏, 張仙, 朱健, 李還寶, 楊巍, 薛建萍, 郝婷婷 申請人:上海市農(nóng)藥研究所;薛建萍