專利名稱：一株高產原果膠酶的菌株及一種發(fā)酵提取果膠的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術領域，具體涉及一株高產原果膠酶的菌株及采用該菌株發(fā)酵提取果膠的方法。
背景技術：
果膠以原果膠、可溶性果膠、果膠酸等形式廣泛分布于植物的果實、根莖及葉中。作為一種重要的食品添加劑，果膠在市場上非常缺乏，目前
國際市場價格在17,000美元/噸左右。桔皮是桔子深加工等的副產物，是工業(yè)生產果膠的主要原料之一，其中含有約30% (占桔皮干重)的果膠。目前，從桔皮中提取果膠的方法主要有酸解法、微波法、離子交換樹脂法、微生物法等幾類。
酸解法為工業(yè)提取果膠最傳統(tǒng)的方法。其原理是采用稀酸將果皮細胞中的非水溶性原果膠水解為水溶性果膠。該法具有快速、簡單、成本較低等優(yōu)點，果膠產率能達到26%以上，但提取過程中果膠分子會發(fā)生局部水解，降低了果膠相對分子質量，從而影響果膠收率和質量；果膠提取液黏度大導致過濾困難；生產過程中產生的廢渣難以處理；同時因為酸的大量應用，對設備的腐蝕也較大。
微波法是利用高功率的電磁波穿透被提取介質內部維管束和細胞系統(tǒng)，由于吸收微波能，細胞內部溫度迅速上升，細胞受到的內部壓力超過細胞壁承受能力導致細胞破裂，從而細胞內有效成分自由流出，通過在較低的溫度條件下萃取介質、溶解，進一步過濾并、分離，即可獲得提取物。微波法提取法不僅具有簡單、快速等優(yōu)勢，而且產量很高，幾乎能夠完全提取出果皮中的果膠。但能耗較大，也因為反應條件劇烈，造成后期固液 難分離。
離子交換樹脂法的工藝流程為將處理過的柑橘皮脫水后粉碎，與離 子交換樹脂和水制成的濃漿液在攪拌下加熱過濾，分離出不溶性的離子交 換劑和廢渣，得到含有果膠的濾液。用該法提取桔皮中的果膠，產率能夠 達到22% 23%，果膠的質量也較好，但同樣采用了較高濃度的酸，對設 備的腐蝕也較大。
微生物法的原理是利用微生物生長過程中分泌的原果膠酶將植物組 織中原果膠分解為可溶的果膠，進而可以將發(fā)酵液過濾、濃縮并用沉淀劑 將發(fā)酵液中的果膠沉淀提取出來。微生物法首先由日本人sakai等提出， 其用一株產原果膠酶菌株7h'c/^戶ra" 應用到桔皮果膠提取 中，果膠產率能達到13.3%(與桔皮干重之比)。此后，JC Contreras Esquivd 等人利用從j^^^7/m fem^c/2// ifo 4308培養(yǎng)基原果膠酶溶液提取桔皮果 膠，產率達到17.7% (與桔皮干重之比)。采用微生物發(fā)酵法萃取的果膠分 子量大、果膠的膠凝度高、質量穩(wěn)定、提取液中果皮不破碎(易于固液分離)， 無需進行熱處理或酸處理，具有低消耗、低污染、產品質量穩(wěn)定等一系列 優(yōu)點。但就目前的工藝來看，該法還存在產率不高的不足。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株高產原果膠酶的黑曲霉菌株J^^g///^ CD-Ol。
本發(fā)明涉及的黑曲霉菌株已于2009年3月4日提交保藏。保藏單位 名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址中國、武漢、武漢大學；保 藏編號為CCTCCNO: M 209036，分類命名為黑曲霉CD-Ol， Aspergillus niger CD隱Ol。本發(fā)明的另一目的在于針對現(xiàn)有果膠提取技術存在的不足，提供一種生產成本低、產品質量好、產出高且副產品經濟價值高的微生物發(fā)酵提取果膠的方法。
本發(fā)明的微生物發(fā)酵提取果膠的方法包括以下步驟
1) 斜面培養(yǎng)將黑曲霉孢子接種至斜面培養(yǎng)基上，34-36'C下培養(yǎng)3-5天，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋至1.0-2.5xl(^個/mL，
冷藏于4t:備用；
2) 發(fā)酵取當季無霉變的干桔皮按水料質量比為10-20:1投入到蒸餾水中，靜置25國35min，將pH值調至4.5-5.5，高壓滅菌15-25min，冷卻后按質量比加入0.1-0.2%的尿素，按質量比接種5-15%的黑曲霉孢子懸液，恒溫搖床中培養(yǎng)24-48h，溫度為34-36。C，轉速為150-210r/min;
3) 果膠提取將培養(yǎng)液過濾或離心，將分離得到的發(fā)酵溶液采用2.4倍體積的95%乙醇進行沉淀提取，沉淀分離后用70%的乙醇洗滌兩次，冷凍干燥即得產品。
所述斜面培養(yǎng)最佳條件為34-36'C下培養(yǎng)4天，接種用孢子懸液優(yōu)選濃度為1.0-2.5 xl()6個/mL。
所述發(fā)酵步驟中最佳pH值為4.5-5.5，尿素的優(yōu)選添加量為0.1-0.2%,黑曲霉孢子接種在無菌條件下進行，最佳接種量為5-15%。
所述發(fā)酵步驟中最佳培養(yǎng)條件為恒溫搖床中培養(yǎng)24-28h，溫度為34-36。C，轉速為150-210r/min。
所述濾液中存在的大量高活性果膠酶，久置會分解其中的果膠分子，影響果膠質量，因此在離心或過濾得到果膠溶液后，應立即加入乙醇進行沉淀。
與現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢
1)成本較低整個發(fā)酵提取過程條件溫和，對設備要求不高且耗能低；此外桔皮原料不需破碎，發(fā)酵溶液固液分離更容易，因此與其他方法相比成本要低很多；
2) 產率較高本發(fā)明的果膠提取產率高達24.5% (與桔皮干重之比)，與現(xiàn)有的微生物提取果膠方法相比，產率大大提高，與傳統(tǒng)果膠提取方法產率相當；
3) 產品質量好果膠產品分子量大，膠凝度高，質量穩(wěn)定，各項指標均符合果膠標準QB 2484-2000;
4) 副產品經濟價值高發(fā)酵液中除了果膠外還存在大量的原果膠酶和果膠酶，均有很高的經濟價值，這是其他果膠提取方法所不具備的。
具體實施例方式
以下實施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進一步限定，本發(fā)明可以按發(fā)明內容所述的任一方式實施。
實施例1:
將黑曲霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上于35'C生長4天后，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋到1.75xl(^個/mL，冷藏于4t:備用。
取當季無霉變的干桔皮6.67 g投入到裝有100 mL蒸餾水的250mL三角瓶中，靜置30min，將pH值準確調至5.0，高壓滅菌25 min;冷卻后在無菌條件下加入尿素0.14 g，再加入黑曲霉孢子懸液10mL，孢子濃度為1.75xl06+/mL;將接種后的搖瓶在恒溫搖床中培養(yǎng)培養(yǎng)36h，設置溫度為35°C，轉速為180r/min;將培養(yǎng)液過濾或離心(取lmL用于產量測定)，取濾液用2.4倍體積的95。/。的乙醇對果膠進行沉淀、過濾，用20mL、 70%的乙醇將果膠沉淀洗滌兩次，將最后將得到的果膠沉淀冷凍干燥。采用硫酸咔唑法測定果膠含量，測得果膠產率為24.5% (與桔皮干重之比)。實施例2:
將黑曲霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上于35'C生長4天后，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋到1.75xl()S個/mL，冷藏于4。C備用。
取當季無霉變的干桔皮6.67 g投入到裝有100 mL蒸餾水的250mL三角瓶中，靜置35min，將pH值準確調至5.5,高壓滅菌20min;冷卻后在無菌條件下加入尿素0.15g，再加入黑曲霉孢子懸液10mL，孢子濃度為L75xl(^個/mL;將接種后的搖瓶在恒溫搖床中培養(yǎng)培養(yǎng)32h，設置溫度為36°C，轉速為150r/min;將培養(yǎng)液過濾或離心(取lmL用于產量測定)，取濾液用2.4倍體積的95%的乙醇對果膠進行沉淀、過濾，用20mL、 70%的乙醇將果膠沉淀洗滌兩次，將最后將得到的果膠沉淀冷凍干燥。采用硫酸咔唑法測定果膠含量，測得果膠產率為22.8% (與桔皮干重之比)。
實施例3:
將黑曲霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上于35-C生長4天后，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀釋到1.75xl(^個/mL，冷藏于4。C備用。
取當季無霉變的干桔皮6.67 g投入到裝有100 mL蒸餾水的250mL三角瓶中，靜置25min，將pH值準確調至4.5，高壓滅菌15min;冷卻后在無菌條件下加入尿素0.14g，再加入黑曲霉孢子懸液10mL，孢子濃度為1.7xl()S個/mL;將接種后的搖瓶在恒溫搖床中培養(yǎng)培養(yǎng)40h，設置溫度為34°C，轉速為200r/min;將培養(yǎng)液過濾或離心(取lmL用于產量測定)，取濾液用2.4倍體積的95%的乙醇對果膠進行沉淀、過濾，用20mL、 70%的乙醇將果膠沉淀洗滌兩次，將最后將得到的果膠沉淀冷凍干燥。采用硫酸咔唑法測定果膠含量，測得果膠產率為23.1% (與桔皮干重之比)。
權利要求
1、一株高產原果膠酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger CD-01，其保藏編號為CCTCC NOM 209036。
2、 一種采用權利要求l所述黑曲霉菌株發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在 于包括以下步驟1) 斜面培養(yǎng)將黑曲霉菌株^^^^7/MW/g^CD-01孢子接種至斜面培養(yǎng) 基上，34-36匸下培養(yǎng)3-5天，用無菌水洗下黑曲霉孢子，制成孢子懸液并稀 釋至1.0-2.5xl(^個/mL，冷藏于4"C備用；2) 發(fā)酵取干桔皮按水料質量比為10-20:1投入到蒸餾水中，靜置 25-35min，將pH值調至4.5-5.5，高壓滅菌15-25min，冷卻后按質量比加入 0.1-0.2%的尿素，按質量比接種5-15%的黑曲霉孢子懸液，恒溫搖床中培養(yǎng) 24-48h，溫度為34-36。C，轉速為150-210r/min;3) 果膠提取將培養(yǎng)液過濾或離心，將分離得到的發(fā)酵溶液采用2.4倍 體積的95%乙醇進行沉淀提取，沉淀分離后用70%的乙醇洗滌兩次，冷凍干 燥即得產品。
3、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 斜面培養(yǎng)條件為34-36匸培養(yǎng)3-5天。
4、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 接種用孢子懸液濃度為1.0-2.5xl(^個/mL。
5、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 干桔皮不用破碎，直接加入。
6、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 發(fā)酵步驟中將pH值調至4.5-5.5。
7、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 尿素的添加量為0.1-0.2%。
8、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于 發(fā)酵步驟中黑曲霉孢子接種在無菌條件下進行，接種量為5-15%。
9、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在于:發(fā)酵步驟中培養(yǎng)條件為恒溫搖床中培養(yǎng)24-48h，溫度為34-36°C，轉速為 150-210r/min。
10、 根據權利要求2所述的一種微生物發(fā)酵提取果膠的方法，其特征在 于在離心或過濾得到的果膠溶液后立即加入乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株高產原果膠酶的黑曲霉菌株及采用該菌株發(fā)酵提取果膠的方法。所述黑曲霉Aspergillus niger CD-01從湖南常德一傾倒腐爛柑桔的土壤中篩選到，保藏編號為CCTCC NOM 209036。本發(fā)明發(fā)酵提取果膠的方法包括斜面培養(yǎng)、發(fā)酵、果膠提取等步驟，所得產品分子量大、膠凝度高、質量穩(wěn)定，各項指標符合果膠標準，在生產成本方面優(yōu)于其他果膠提取方法，且在果膠產率方面與以往微生物發(fā)酵提取法相比有較大提高。
文檔編號C12N1/14GK101665769SQ200910043038
公開日2010年3月10日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權日2009年4月3日
發(fā)明者夏金蘭, 浩 孟, 張成桂, 張瑞永, 王潤民, 聶珍媛, 邱冠周 申請人:中南大學