專利名稱：一種芒果炭疽病菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性菌株的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種病菌抗藥性的檢測方法，具體涉及一種芒果炭疽病對苯并咪唑類 殺菌劑抗藥性菌株的檢測方法，屬于病菌抗藥性檢測方法領域。
背景技術：
苯并咪唑類(benzimidazoles)殺菌劑是20世紀60年代后期開發(fā)的一類重要藥 劑，可以防治大多數子囊菌、半知菌和擔子菌引起的植物病害。此類化合物主要包括多菌 靈(carbendazim)、苯來特(benomyl)、噻菌靈(thiabendazole)、麥穗寧(fuberidazole)、 甲基托布津(thiophanate-methyl)等，此類藥劑施用后，在植物體內會產生共同的衍生物 多菌靈或它的乙基同系物乙基多菌靈，是與病菌相互作用的最后產物。此類藥劑具有良好 的內吸性能，因此被廣泛應用于一些重要農作物主要病害的防治，其作用霸標是病原菌的 β -微管蛋白，干擾細胞核的分裂，這類藥劑作用位點單一，選擇性較強，病原菌容易對其產 生抗藥性，目前，抗藥性已成為制約這類殺菌劑被繼續(xù)使用的最主要限制因素。芒果炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)是芒果最嚴重的病害之 一，該病害在國內外芒果產區(qū)普遍發(fā)生。目前，對芒果炭疽病的防治以化學防治為主，多菌 靈等苯并咪唑類殺菌劑對該病害具有較好的防治效果。但苯并咪唑類殺菌劑是一種單一作 用位點的內吸性殺菌劑，容易產生抗藥性，某些頻繁使用苯并咪唑類殺菌劑的芒果產區(qū)已 出現了抗藥性現象，抗藥性菌株的抗性水平較高，達到多菌靈失效的程度，導致了該病害的 大爆發(fā)和流行。因此，為了能有效地控制該病害的發(fā)生與流行，有必要對田間病菌的抗藥性 情況進行及時、有效的監(jiān)測，為抗藥性治理提供理論依據及有效信息，最終達到控制該病害 的目的。目前常用的抗藥性檢測方法有生物測定法、生化測定法和運用核酸技術的檢測方 法，由于生物測定法和生化測定法需要時間較長，在短時間內很難提供病菌抗藥性發(fā)生情 況，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，越來越多地利用分子檢測方法，以便實現簡便、高效 的快速檢測。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種芒果炭疽病菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性菌株的檢測 方法，制備一對特異性引物，以待測的芒果炭疽病菌的基因組DNA為模板進行擴增，獲得 PCR擴增產物后進行酶切，通過對酶切產物的電泳、凝膠成像可以快速準確的鑒定出抗性菌 株和敏感菌株.為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種芒果炭疽病菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性菌株的檢測方法(1)芒果炭疽病病原菌基因組DNA的提取(a)取病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5 7天，取培養(yǎng)液過 濾獲得菌絲體，菌絲體冷凍干燥備用；
(b)取15 25mg冷凍干燥菌絲體用液氮研磨，轉入1. 5mL離心管中，加入350 450 μ L60 70°C水浴的SDS提取緩沖液，充分混勻并于60 70°C水浴20 40min，間隔 搖勻三次；(C) 13000r/min 離心 lOmin，取 250 350 μ L 上清液，加入 250 350 μ L 的酚、氯 仿和異戊醇的混合溶液，酚氯仿異戊醇為20 28 22 26 1 3，輕搖30 40 個來回；(d) 13000r/min離心lOmin，移上清液到新離心管，加180 250 μ L氯仿和異戊醇 的混合溶液，氯仿和異戊醇的配比為20 25 1 3，輕搖30 40個來回；(e) 13000r/min離心5min，移上清液到新離心管，加1 3倍體積的無水乙醇和濃 度為2mol/L的妝(1，使DNA充分沉淀；(f) 13000r/min離心lOmin，待沉淀充分干燥后，用70%乙醇洗滌沉淀兩次；(g)沉淀充分干燥后加入40 60 μ LTE緩沖液，60 70°C溫浴1 1. 5h，使沉淀 完全溶解，-20°C保存病原菌基因組DNA備用；(2) PCR擴增特異引物及反應條件利用正向引物序列PFl (5，-GCATGATGGCCACCTTCTC-3，)和反向引物序列 PRl (5，-GAGCGAAGCCGACCATGAAG-3，)對病原菌基因組DNA進行PCR擴增，擴增條件PCR反 應體系 50 μ L :25 μ L Premix Taq，1 μ L (IOOng) DNA模板，正向引物 4 μ L，濃度為 100 μ mol/ L，反向引物 4 μ L，濃度為 100ymol/L, 16 μ L ddH20 ；反應循環(huán)-MV 5min ；94°C lmin，55 63°C 30s, 72°C 2min，30個循環(huán)；然后72°C 5min，最后4°C保存PCR擴增產物；(3)酶切PCR擴增產物取PCR擴增產物進行酶切反應，反應體系20 μ L =ACC II限 制性內切酶ι μ L，濃度為12u/y L，2y L 10 X MBuffer，DNA擴增產物1 μ g，擴增產物的DNA 濃度采用核酸分析儀測定或與λ DNA進行瓊脂糖電泳比對測定，最后加超純水至20 μ L，按 反應體系加樣至PCR管中置于37°C水浴45 60min，獲得的酶切產物4°C保存?zhèn)溆茫?4)酶切產物分析取10 μ L酶切產物，點入含核酸燃料的1. 2%瓊脂糖凝膠中， 在5V/cm條件下電泳20 30min后，把瓊脂糖凝膠轉移到自動凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，以 Marker DL2000比對；如果電泳條帶只有一條且為329bp，那么該病原菌鑒定為敏感菌株， 該菌株對苯并咪唑類殺菌劑敏感，如果電泳條帶有兩條且一條為107bp，另一條為222bp， 那么該病1原菌鑒定為抗性菌株，該菌株對苯并咪唑類殺菌劑已產生抗性。本發(fā)明的有益效果是能夠實現簡單、高效地快速檢測出菌株的抗藥性，能對田間 病菌的抗藥性情況進行及時、有效的監(jiān)測，為抗藥性治理提供理論依據及有效信息，最終達 到控制該病害的目的，其檢測準確率為100%。
圖1酶切鑒定結果圖。圖中泳道M:Marker DL2000 ；泳道1、2、3、4、7、8 敏感菌株電泳條帶；泳道5、6
抗性菌株電泳條帶。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實例1一種芒果炭疽病菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性菌株的檢測方法，它包括如下步 驟(1)芒果炭疽病病原菌基因組DNA的提取(a)取病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6天，取培養(yǎng)液過濾獲 得菌絲體，菌絲體冷凍干燥備用；(b)取20mg冷凍干燥菌絲體用液氮研磨，轉入1.5mL離心管中，加入400μ 65 水浴的SDS提取緩沖液，SDS提取緩沖液的配制200mmol/L Tris-HCl，250mmol/L NaCl, 25mmol/LEDTA,5% SDS，充分混勻并于65°C水浴30min，間隔搖勻三次；(c) 13000r/min離心lOmin，取300 μ L上清液，加入300 μ L的酚、氯仿和異戊醇的 混合溶液，酚氯仿異戊醇為25 24 1，輕搖30 40個來回；(d) 13000r/min離心lOmin，移上清液到新離心管，加200 μ L氯仿和異戊醇的混合 溶液，氯仿和異戊醇的配比為24 1，輕搖30 40個來回；(e) 13000r/min離心5min，移上清液到新離心管，加2倍體積的無水乙醇和終濃度 為2mol/L的NaCl，使DNA充分沉淀；(f) 13000r/min離心lOmin，待沉淀充分干燥后，用70%乙醇洗滌沉淀兩次；(g)沉淀充分干燥后加入50 μ LTE緩沖液，65°C溫浴lh，使沉淀完全溶解，-20°C保 存病原菌基因組DNA備用；(2) PCR擴增特異引物及反應條件利用正向引物序列PFl (5，-GCATGATGGCCACCTTCTC-3，)和反向引物序列 PRl (5，-GAGCGAAGCCGACCATGAAG-3，)對病原菌基因組DNA進行PCR擴增，擴增條件PCR 反應體系 50 μ L :25 μ L Premix Taq, 1 μ L(IOOng)DNA Templates，ιΕ 向弓| 物 4 μ L,濃度 為 ΙΟΟμπιοΙ/L，反向引物 4yL，濃度為 100 μ mol/L，16 μ L ddH20 ；反應循環(huán)94 °C 5min ； 94°C lmin, 55 63°C 30s, 72°C 2min, 30 個循環(huán)；然后 72°C 5min,最后 4°C保存 PCR 擴增產 物；(3)酶切PCR擴增產物取PCR擴增產物進行酶切反應，反應體系20 μ L =ACC II限 制性內切酶ι μ L，濃度為12u/y L，2y L 10 X MBuffer，DNA擴增產物1 μ g，擴增產物的DNA 濃度采用核酸分析儀測定或與λ DNA進行瓊脂糖電泳比對測定，最后加超純水至20 μ L，按 反應體系加樣至PCR管中置于37°C水浴45 60min，獲得的酶切產物4°C保存?zhèn)溆茫?4)酶切產物分析取10 μ L酶切產物，點入含核酸燃料的1. 2%瓊脂糖凝膠中， 在5V/cm條件下電泳20 30min后，把瓊脂糖凝膠轉移到自動凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，以 Marker DL2000比對；如果電泳條帶只有一條且為329bp，那么該病原菌鑒定為敏感菌株， 該菌株對苯并咪唑類殺菌劑敏感，如果電泳條帶有兩條且一條為107bp，另一條為222bp， 那么該病1原菌鑒定為抗性菌株，該菌株對苯并咪唑類殺菌劑已產生抗性，如圖1。實例2采集位于廣東湛江多次使用多菌靈、甲基托布津的芒果果園64個炭疽病病原 菌菌株，按照本發(fā)明的方法進行試驗，有25個菌株的電泳條帶有2條且分別為107bp和 222bp，另外39個菌株的電泳條帶有1條為329bp，抗性菌株的百分率為39%，同時通過傳統(tǒng)的生物學測定方法進行驗證，測定結果與本試驗一致。實例3采集位于海南三亞多次使用多菌靈、甲基托布津、施寶克、大生的芒果果園23個 炭疽病病原菌菌株，按照本發(fā)明的方法進行試驗，有2個菌株的電泳條帶有2條且分別為 107bp和222bp，另外21個菌株的電泳條帶有1條為329bp，抗性菌株的百分率為9%，同時 通過傳統(tǒng)的生物學測定方法進行驗證，測定結果與本試驗一致。實例 4采集位于廣東廣州的芒果果園12個炭疽病病原菌菌株，按照本發(fā)明的方法進行 試驗，12個菌株的電泳條帶有1條為329bp，抗性菌株的百分率為0，同時通過傳統(tǒng)的生物學 測定方法進行驗證，測定結果與本試驗一致。
權利要求
一種芒果炭疽病菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性菌株的檢測方法，其特征在于(1)芒果炭疽病病原菌基因組DNA的提取(a)取病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5～7天，取培養(yǎng)液過濾獲得菌絲體，菌絲體冷凍干燥備用；(b)取15～25mg冷凍干燥菌絲體用液氮研磨，轉入1.5mL離心管中，加入350～450μL60～70℃水浴的SDS提取緩沖液，充分混勻并于60～70℃水浴20～40min，間隔搖勻三次；(c)13000r/min離心10min，取250～350μL上清液，加入250～350μL的酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，酚∶氯仿∶異戊醇為20～28∶22～26∶1～3，輕搖30～40個來回；(d)13000r/min離心10min，移上清液到新離心管，加180～250μL氯仿和異戊醇的混合溶液，氯仿和異戊醇的配比為20～25∶1～3，輕搖30～40個來回；(e)13000r/min離心5min，移上清液到新離心管，加1～3倍體積的無水乙醇和濃度為2mol/L的NaCl，使DNA充分沉淀；(f)13000r/min離心10min，待沉淀充分干燥后，用70％乙醇洗滌沉淀兩次；(g)沉淀充分干燥后加入40～60μLTE緩沖液，60～70℃溫浴1～1.5h，使沉淀完全溶解， 20℃保存病原菌基因組DNA備用；(2)PCR擴增特異引物及反應條件利用正向引物序列PF1(5’ GCATGATGGCCACCTTCTC 3’)和反向引物序列PR1(5’ GAGCGAAGCCGACCATGAAG 3’)對病原菌基因組DNA進行PCR擴增，擴增條件PCR反應體系50μL25μL Premix Taq，1μL(100ng)DNA模板，正向引物4μL，濃度為100μmol/L，反向引物4μL，濃度為100μmol/L，16μL ddH2O；反應循環(huán)94℃5min；94℃1min，55～63℃30s，72℃2min，30個循環(huán)；然后72℃5min，最后4℃保存PCR擴增產物；(3)酶切PCR擴增產物取PCR擴增產物進行酶切反應，反應體系20μLACC II限制性內切酶1μL，濃度為12u/μL，2μL 10×MBuffer，DNA擴增產物1μg，擴增產物的DNA濃度采用核酸分析儀測定或與λDNA進行瓊脂糖電泳比對測定，最后加超純水至20μL，按反應體系加樣至PCR管中置于37℃水浴45～60min，獲得的酶切產物4℃保存?zhèn)溆茫?4)酶切產物分析取10μL酶切產物，點入含核酸燃料的1.2％瓊脂糖凝膠中，在5V/cm條件下電泳20～30min后，把瓊脂糖凝膠轉移到自動凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，以Marker DL2000比對，鑒定抗藥性菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芒果炭疽病菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性菌株的檢測方法，該方法包括以下4個步驟(1)芒果炭疽病病原菌基因組DNA的提??；(2)PCR擴增特異引物及反應條件；(3)酶切PCR擴增產物；(4)酶切產物分析；該檢測方法對炭疽病病原菌抗性菌株的檢出率為100％；本發(fā)明根據病原菌抗性菌株的特異酶切位點選擇一對特異引物進行DNA片段(含特異酶切位點)擴增，利用限制性內切酶對擴增DNA片段進行酶切，將酶切產物進行電泳、凝膠成像可以準確判斷病原菌是抗性菌株還是敏感菌株，經過多次試驗表明，這種方法是穩(wěn)定可靠的。
文檔編號C12R1/645GK101921824SQ200910041059
公開日2010年12月22日 申請日期2009年7月13日 優(yōu)先權日2009年7月13日
發(fā)明者何衍彪, 姚全勝, 常金梅, 王松標, 詹儒林, 趙艷龍, 雷新濤, 黃俊生 申請人:中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所