專利名稱：用于檢測(cè)甲型流感病毒及甲型h1n1流感病毒的核酸納米金生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核 酸快速檢測(cè)方法及檢測(cè)產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡(jiǎn)稱流感，是由甲型、乙型、丙型三種流感病毒引起的急性呼吸道傳染 病。其中，甲型流感病毒的宿主最廣、危害最大，人、禽、畜都是甲型流感病毒的宿主。根據(jù) 其表面結(jié)構(gòu)(血凝素H和神經(jīng)氨酸酶N)及其基因特性的不同，甲型流感病毒又可分成許 多亞型，至今甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個(gè)亞型(H1-H16)，神經(jīng)氨酸酶有9個(gè)亞型 (N1-N9)。2009年從墨西哥爆發(fā)并蔓延到全球多個(gè)國(guó)家的人感染甲型Hmi流感疫情，是由 于一種新變異的甲型Hmi流感病毒引發(fā)的，被世界衛(wèi)生組織稱為“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi) 生事件”，已達(dá)到了最高的6級(jí)警告標(biāo)準(zhǔn)。今年流行的甲型Hmi流感是甲型流感病毒中的一個(gè)亞型，已經(jīng)蔓延到世界許多 國(guó)家，不足一個(gè)月，全球確診的甲型Hmi流感病例已突破萬(wàn)例，我國(guó)也出現(xiàn)了多例輸入性 流感病例。給人類生命安全造成了一定危害，包括我國(guó)政府在內(nèi)的世界各國(guó)都采取了積極 有效的防控措施，以防止疾病的迅速蔓延。面對(duì)突然爆發(fā)的流行性疾病，開展對(duì)疾病預(yù)防、 診斷、致病機(jī)理以及治療研究是相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注和研究的重點(diǎn)。甲型流感病毒是RNA病毒，傳統(tǒng)的基因檢測(cè)技術(shù)有Northern雜交、Southern雜 交、Western blotting、PCR等，這些檢測(cè)方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且特異性差。在過去的十 幾年中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)發(fā)展成為一種重要的基因檢測(cè)技術(shù)，具有高靈敏度和特異 性，但是需要昂貴的儀器及專業(yè)人員的操作。近年來(lái)興起的DNA納米技術(shù)是以DNA堿基嚴(yán) 格互補(bǔ)配對(duì)的特性為原理，主要應(yīng)用于分子的組裝，產(chǎn)生有功能的組裝聚集物。DNA納米技 術(shù)包括基因芯片之外，還有一種是將DNA結(jié)合到納米顆粒上構(gòu)成納米顆?；蛱结?，通過 與靶DNA之間的互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)納米顆粒的組裝，這已成為一種新型的DNA檢測(cè)系統(tǒng)。Mirkin等 運(yùn)用金納米顆?；蛱结樑c合成靶雜交，形成透射電鏡下明顯的聚集體，可判斷合成靶存
(Chad A. Mirkin, R. L. L. , Robert C. Mucic&JgimesJ· Storhoff Nature 1996,382, 607-609)。Wang等制備金納米顆粒乙型肝炎病毒(HBV) DNA基因探針，在玻片上目視化檢測(cè) HBV DNA 的多聚酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物(Wang YF, Pang Dff, Zhang ZL, et al. Visual gene diagnosis of HBV and HCVbased on nanoparticle ρ robe amp lification and silver staining enhancement. J MedVirol，2003，70 :2052211)。習(xí)東等應(yīng)用 Fe304 (核)/Au (殼)納米顆粒 HBV DNA基因探針，通過尼龍膜上斑點(diǎn)雜交或液相中雜交研究其在檢測(cè)HBV DNA中的應(yīng)用 (Dong Xia, X. L. , Qin Ninga, Qianghua Lud, Kailun Yao, Zuli Liud Journalof Nanjing Medical University 2007，21，207-212)。但上述檢測(cè)技術(shù)都存在各自的缺點(diǎn)，如Mirkin的 技術(shù)需要復(fù)雜昂貴的透射電鏡，Wang需要昂貴的進(jìn)口玻片，且需要長(zhǎng)時(shí)間的預(yù)雜交、雜交洗滌過程，習(xí)東的檢測(cè)時(shí)需要長(zhǎng)時(shí)間的復(fù)雜的預(yù)雜交、雜交、洗膜銀染過程，沒有技術(shù)優(yōu)點(diǎn)耗 時(shí)費(fèi)力，且都處于試驗(yàn)研究階段，沒有產(chǎn)品化。所以仍然需要尋找快速、靈敏、低成本、操作 簡(jiǎn)易的核酸檢測(cè)工具。為配合這一研究，研究了能迅速準(zhǔn)確檢測(cè)甲型流感病毒及甲型Hmi 流感病毒的核酸納米金生物傳感器的檢測(cè)方法及開發(fā)了其試劑盒，對(duì)于早期大規(guī)模篩查及 有效地控制疾病的迅速傳播具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品存 在的問題和不足，提供一種用于快速檢測(cè)甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒(2009年流行 的新變種)的核酸納米金生物傳感器。本發(fā)明所述的一種用于檢測(cè)甲型流感病毒的核酸納米金生物傳感器，包括從左到 右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納 米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷 酸探針包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸 探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一 端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；固 定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述的一種用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒的核酸納米金生物傳感器，包括 從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上 涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯(lián)形成的，該 寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡 核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸 水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸 序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器的進(jìn)一步特征，所述質(zhì)控線與檢測(cè)線相 距3-10mm ；所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰部分彼 此重疊l-5mm ；所述膠體金的粒徑為8-lOOnm。本發(fā)明的另一目的是提供含有本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器的用于檢測(cè) 甲型流感病毒的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明所述的用于檢測(cè)甲型流感病毒的試劑盒，還包括RT-不對(duì)稱PCR反應(yīng) 試劑，包含10倍RT-PCR緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA酶抑制劑、上游引物、下游引物；其 中，上游引物含有如SEQ ID N0. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID N0.5所示的 核苷酸序列；所述酶混合液是由Taq酶5U/ μ 1和逆轉(zhuǎn)錄酶5U/ μ 1以體積比1 1混合組 成。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器的用于檢測(cè)甲型Hmi 流感病毒的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明所述的用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒的試劑盒，還包括RT_不對(duì)稱PCR反應(yīng)試劑，包含10倍RT-PCR緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA酶抑制劑、上游引物、下游引 物；其中，上游引物含有如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10 所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Taq酶5υ/μ1和逆轉(zhuǎn)錄酶5υ/μ1以體積比1 1 混合組成。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述上游引物與下游引物之間的濃度比 為 10 1-100 1。本發(fā)明的另一目的是提供一種甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的檢測(cè)方法。本發(fā)明所述的一種甲型流感病毒的檢測(cè)方法，包括以下步驟1)病毒RNA的提取a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400ul病毒樣本加入0. 5ml Trizol，反復(fù)震 蕩，抽吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0. Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37°C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；c)在上清液中加入0. Iml的異丙醇，20-37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心
15分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0. 5ml的75%乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使 沉淀干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20 μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR擴(kuò)增采用50 μ 1的逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系10倍RT-PCR緩沖液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制劑1 μ 1，鎂離子5mM, Taq酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶5U，上游引物0.4μΜ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如 SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；反應(yīng)程序50 V 30分鐘，94°C 2分鐘，1個(gè)循環(huán)；94 V 30秒，58 V 20秒，72 °C 30秒， 35個(gè)循環(huán)；72 °C 7分鐘；3)采用核酸納米金生物傳感器對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及結(jié)果分析所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃 纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸 探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID N0. 2所示的核 苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo) 記并與鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡 核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 3所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸 探針形成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；將步驟2所得的PCR產(chǎn)物分別滴加入所述的甲型流感病毒核酸納米金生物傳感器 及甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的情況進(jìn)行結(jié)果分 析檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陽(yáng)性；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，而檢測(cè)線未出 現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陰性。本發(fā)明所述的一種甲型Hmi流感病毒的檢測(cè)方法，包括以下步驟1)病毒RNA的提取
a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400ul病毒樣本加入0. 5ml Trizol，反復(fù)震 蕩，抽吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0. Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37°C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；c)在上清液中加入0. Iml的異丙醇，20_37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心
15分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0. 5ml的75 %乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使 沉淀干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20 μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR擴(kuò)增采用50 μ 1的逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系10倍RT-PCR緩沖液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制劑1 μ 1，鎂離子5mM，Taq酶 5U,反轉(zhuǎn)錄酶5U，上游引物0.4μΜ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如 SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列；反應(yīng)程序50 V 30分鐘，94°C 2分鐘，1個(gè)循環(huán)；94 V 30秒，58 V 20秒，72 °C 30秒， 35個(gè)循環(huán)；72 °C 7分鐘；3)采用核酸納米金生物傳感器對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及結(jié)果分析所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃 纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸 探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 7所示的核 苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo) 記并與鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡 核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸 探針形成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；將步驟2所得的PCR產(chǎn)物分別滴加入所述的甲型流感病毒核酸納米金生物傳感器 及甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的情況進(jìn)行結(jié)果分 析檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陽(yáng)性；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，而檢測(cè)線未出 現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陰性。本發(fā)明將表面合成化學(xué)、生物化學(xué)及物理化學(xué)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，解決目視化基因檢 測(cè)技術(shù)設(shè)計(jì)與制造中的關(guān)鍵技術(shù)，具體構(gòu)思如下膠體金是一種帶負(fù)電的膠體溶液，能與巰基共價(jià)結(jié)合形成Au-S鍵，通過寡核苷酸 修飾巰基與膠體金偶聯(lián)從而形成金標(biāo)DNA探針；鏈霉親合素(SA)是與親合素(A)有類似生 物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)，是由Sti^ptomyces avidin菌在培養(yǎng)過程中分泌的一種蛋白質(zhì)產(chǎn) 物。SA是一種四聚體蛋白，其每個(gè)單體通過親水鍵和范德華力與一個(gè)生物素結(jié)合后兩者形 成穩(wěn)定且難斷裂的鍵，因此利用生物素與鏈霉親和素間的親和力，用一個(gè)用生物素標(biāo)記的 探針與鏈霉親和素偶聯(lián)，固定于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線；將硝酸纖維素膜、金 標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙固定于膠板上，組裝成納米金生物傳感器。本發(fā)明的技術(shù)原理是核酸納米金生物傳感器以?shī)A心DNA雜交為基礎(chǔ)，其基本原 理為設(shè)計(jì)3條DNA探針，DNA探針1和DNA探針2分別與所測(cè)樣品中模板DNA特異性互補(bǔ)，DNA探針3與DNA探針2特異性互補(bǔ)(圖1)。DNA探針1和DNA探針3分別固定在硝 酸纖維素膜的檢測(cè)線(Test line)和質(zhì)控線(Control line)上，DNA探針2與膠體金相連， 涂布在金標(biāo)墊上。當(dāng)在樣品墊上滴加樣品(含模板DNA)時(shí)，由于毛細(xì)作用，模板DNA隨樣 品液一起向前運(yùn)動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)金標(biāo)墊時(shí)，模板DNA與金標(biāo)墊上的DNA探針2特異性雜交。雜交 的DNA繼續(xù)向前移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)區(qū)域時(shí)模板DNA與DNA探針1再次特異性雜交而固定在 檢測(cè)線上。由于膠體金的光學(xué)性質(zhì)，在檢測(cè)線上聚集的膠體金顆粒顯現(xiàn)出紅色的條帶，過剩 的膠體金-DNA探針2由于毛細(xì)作用繼續(xù)向前移動(dòng)，與質(zhì)控線上的DNA探針3雜交，而在質(zhì) 控線上出現(xiàn)紅色的線。如果樣品中沒有模板DNA時(shí)，檢測(cè)區(qū)域不出現(xiàn)紅線，而質(zhì)控線上出現(xiàn) 紅線。因此，質(zhì)控線出現(xiàn)紅色線說明試紙條可用，而檢測(cè)線出現(xiàn)與否是樣品陰性和陽(yáng)性的標(biāo) 準(zhǔn)。整個(gè)檢測(cè)過程只需要10分鐘左右。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器制備簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速，病 毒RNA只需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和不對(duì)稱PCR擴(kuò)增后，即可獲得大量的目標(biāo)DNA，將上述PCR產(chǎn)物 滴于納米金生物傳感器的加樣孔中，約10分鐘后即可通過觀察檢測(cè)線及質(zhì)控線來(lái)判斷結(jié) 果，不需要專業(yè)的技術(shù)人員及昂貴的儀器設(shè)備。本發(fā)明可用于檢測(cè)甲型人流感、豬流感、禽 流感等流感病毒RNA，同時(shí)可以特異地檢測(cè)甲型Hmi (2009流行)流感病毒RNA，進(jìn)行雙重 分析使檢測(cè)結(jié)果更加可靠。
圖1顯示上游引物、下游引物、探針1、探針2和探針3之間的關(guān)系。圖2顯示用于檢測(cè)甲型流感病毒的納米金生物傳感器檢測(cè)樣品DNA的結(jié)果；圖2A 自左至右依次為A/ws/33 (HlNl)、A/hongkong/8/68 (H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、甲型 Hmi 樣品，圖2B為B型流感病毒樣品；圖3顯示用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒的納米金生物傳感器檢測(cè)樣品DNA的結(jié)果； 圖 3A 自左至右依次為A/ws/33 (HlNl) ,A/hongkong/8/68 (H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、B 型流 感病毒樣品；圖3B為B型流感病毒樣品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一針對(duì)甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的特異性引物及探針的設(shè)計(jì)在NCBI http//www, ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/Database/request, cgi中 查找出所有甲型流感病毒的MP基因片段序列，通過多重比對(duì)找出甲型流感病毒的保守區(qū) 段。采用Express Primer在其保守片段上設(shè)計(jì)引物和探針。通過對(duì)甲型Hmi (2009流行)的HA基因片段序列，采用Express Primer設(shè)計(jì)引 物和探針。將所設(shè)計(jì)的引物與探針與所有病毒序列進(jìn)行比對(duì)，找出變異性最強(qiáng)的引物和探 針。上述甲型HlNl (2009年流行)的全長(zhǎng)HA基因序列來(lái)源于NCBI (> gi | 2278 09829 IgbIFJ966082. 1|InfluenzaAvirus(A/California/04/2009(HlNl))segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds)設(shè)計(jì)結(jié)果為甲型流感病毒的特異性探針和引物
探針1:5，-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-生物素 _3探針2 :5，-SH-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3，探針3:5，-生物素-TAGACGMTTTGTCCARAATGCCCT-3上游引物GACCRATCCTGTCACCTCTGAC下游引物AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA甲型Hmi流感病毒的特異性探針和引物探針1:5，-TTGCGAATGCATATCTCGGT-生物素-3，探針2 :5，-SH-TGCAATCGTGGACTGGTGTA-3，探針3:5，-生物素-TACACCAGTCCACGATTGCA-3，上游弓丨物AATAACATTCGAAGCAACTGGAA下游引物TGCAATCGTGGACTGGTGTA
’ SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 ’ SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 5
SEQ ID NO. 6 SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 10引物、探針及模板DNA三者之間的關(guān)系為探針1位于上下游引物之間與所測(cè)樣品 中模板DNA特異性互補(bǔ)，探針2可與下游引物相同也可位于上下游引物之間，探針3與探針 2特異性互補(bǔ)(圖1)。實(shí)施例二本發(fā)明所述的用于檢測(cè)甲型流感病毒的核酸納米金生物傳感器的制備1.納米金(膠體金)的制備在500ML的圓底燒瓶中加入100ml 0. 01%的HAuCL4溶液，邊攪拌邊加熱至沸騰； 向上述溶液中加入2ml 枸櫞酸鈉，溶液20s內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色，60s后變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸 lOmin，停止加熱繼續(xù)攪拌15min ；膠體金溶液4°C避光保存，納米金通過520nm最大吸光度
值鑒定。2.金標(biāo)寡核苷酸探針的制備用100 μ 1去離子水溶解10D DNA-探針2，加入到5 倍體積濃縮的膠體金溶液中，4°C 24小時(shí)；10%的牛血清白蛋白封閉30分鐘后，加入NaCl 和1 %的SDS，分別至終濃度0. IM和0. 01 %，4°C過夜，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，棄上清， 沉淀用100μ 1含20mM Na3PO4, 5% BSA, 0. 25% TweenJP 10%蔗糖重新懸浮，制成懸浮液。3.金標(biāo)墊的制備將本發(fā)明制備的金標(biāo)寡核苷酸探針涂于玻璃纖維上，37°C干燥2個(gè)小時(shí)，制成金 標(biāo)墊，備用。4.生物素標(biāo)記探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)及偶聯(lián)物的固定鏈霉親和素可以與生物素通過親水鍵和范德華力相結(jié)合并形成穩(wěn)定且難斷裂的 鍵，因此本發(fā)明采用生物素標(biāo)記的DNA探針與鏈霉親和素混合反應(yīng)，采用劃膜噴金儀涂于 硝酸纖維素膜上。例如，用10 μ 1去離子水溶解10D生物素標(biāo)記的DNA-探針1，加入5 μ 1 (2mg/ml) 鏈和親霉素，室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，采用劃膜噴金儀涂于硝酸纖維素膜檢測(cè)線上，37°C干燥 兩個(gè)小時(shí)。DNA-探針3采用同樣方法固定于質(zhì)控線上。5.樣品墊的處理玻璃纖維浸泡0.25% TritonX-100,0. 05M Tris_HCL、0. 15M氯化鈉中 4個(gè)小時(shí)后，
37 °C烘干備用。6.核酸納米金生物傳感器的組裝
將固定有寡核苷酸探針的硝酸纖維素膜、吸水紙、涂有納米微粒標(biāo)記寡核苷酸探 針的玻璃纖維、樣品墊依次固定于膠板上，相鄰部分彼此重疊2mm，經(jīng)切割成寬4mm后即得 到本發(fā)明所述的核酸納米金生物傳感器。實(shí)施例三本發(fā)明所述的用于檢測(cè)甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核酸納米 金生物傳感器的試劑盒的制備及檢測(cè)方法甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳感器的試劑盒包括如下成 分RT-不對(duì)稱PCR反應(yīng)試劑，甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物傳 感器；其中所述的RT-不對(duì)稱PCR反應(yīng)試劑包括10倍RT-PCR緩沖液150 μ 1、dNTP溶 液150 μ 1、鎂離子150 μ 1、酶混合液60 μ 1、RNA酶抑制劑30 μ 1、甲型上游引物30 μ 1、甲 型下游引物30μ 1、甲型Hmi上游引物30μ 1、甲型Hmi下游引物30μ 1 ；其中，用于檢測(cè) 甲型流感病毒的上游引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒的上游引物含有如SEQ ID NO. 9所 示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列；所述上游引物與下游 引物之間的濃度比為20 1 ；
0087]
0088]
0089]
0090]
0091]
0092]
0093]
0094]
0095]
0096]
0097]
0098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
0104]
0105]
0106]
0107]
0108] 0109]
所述酶混合液是由Taq酶5U/ μ 1和逆轉(zhuǎn)錄酶5U/ μ 1以體積比1 1混合組成。 檢測(cè)甲型流感病毒RT不對(duì)稱PCR反應(yīng)液的配制
試劑
IOX緩沖液 dNTP混合液 MgC12(25mM) RNA酶抑制劑 酶混合液
甲型上游引物(20 μ Μ) 甲型下游引物(IuM) RNA提取液 DEPC 水 總體積
檢測(cè)甲型Hmi流感病 試劑
IOX緩沖液 dNTP混合液 MgC12(25mM) RNA酶抑制劑 酶混合液
甲型HlNl上游引物(20 μ Μ) 甲型HlNl下游引物(ΙμΜ) RNA提取液
使用量μ 1 5 5 10 1 2 1 1
4 21
50 μ 1
RT不對(duì)稱PCR反應(yīng)液的配制 使用量μ 1
DEPC 水21總體積50 μ 1確立如下的反應(yīng)條件50°C30分鐘，94°C2分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C 30秒，58°C 20秒， 720C 30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘。反應(yīng)結(jié)束后將上述檢測(cè)甲型流感病毒的PCR產(chǎn)物和檢測(cè)甲型Hmi流感病毒的PCR 產(chǎn)物分別滴于甲型流感病毒核酸納米金生物傳感器及甲型Hmi流感病毒核酸納米金生物 傳感器的加樣孔中，約 ο分鐘即可進(jìn)行結(jié)果判斷。實(shí)施例四本發(fā)明所述的檢測(cè)甲型流感病毒的方法的實(shí)驗(yàn)1、毒株及其來(lái)源A/ws/33 (HlNl), A/hongkong/8/68 (H3N2)由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提 供；A/P2/8/34(HlNl)，B型為臨床分離毒株由廣州呼吸疾病研究所提供；甲型Hmi由美國(guó) 疾病控制及預(yù)防中心(⑶C)提供。以上毒株信息可通過http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ genomes/FLU/Database/select, cgi ？ go = 1 查找。
0117]2、病毒RNA提取
0118]a)200-400ul樣本加入0. 5ml Trizol (咽拭子來(lái)源或病毒培養(yǎng)液)，反復(fù)震蕩，抽 吸以利于細(xì)胞裂解，室溫下孵化5分鐘。
0119]b)加入0. Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，室溫下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心 5分鐘，取上清液，轉(zhuǎn)移至另一 1.5ml EP管。
0120]c)加入0. Iml的異丙醇，室溫下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心15分鐘，去掉
上清液，將管倒置在吸水紙上，稍微風(fēng)干。
0121]d)加入0. 5ml的75%乙醇(DEPC處理的水配制)洗滌RNA，4°C 7500rpm下離心5 分鐘，倒置于吸水紙上，除去上清液后室溫下靜置5分鐘。
0122]e)用DEPC (焦碳酸二乙酯)水20ul溶解RNA。
0123]f)測(cè)定 RNA 濃度及 A260/A280。
0124]3、逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR擴(kuò)增
0125]1)取出試劑盒(見實(shí)施例三)，于4°C解凍，各試劑于用前1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心 分鐘待用。
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
2)按下列組份配制RT-不對(duì)稱PCR反應(yīng)液(反應(yīng)液配制應(yīng)在冰上進(jìn)行) 檢測(cè)甲型流感病毒RT不對(duì)稱PCR反應(yīng)液的配制 試劑使用量μ 1
5 5 10 1 2 1 1 4 21
IOX緩沖液 dNTP混合液 MgC12(25mM) RNA酶抑制劑 酶混合液 上游引物(20 μ Μ) 下游引物(IuM) RNA提取液 DEPC 水
120138]總體積
0139]檢測(cè)甲型Hmi流感病毒RT:
0140]試劑
0141]IOX緩沖液
0142]dNTP混合液
0143]MgC12(25mM)
0144]RNA酶抑制劑
0145]酶混合液
0146]甲型Hmi上游引物(20 μ M)
0147]甲型HlNl下游引物(1 μ Μ)
0148]RNA提取液
0149]DEPC 水
0150]總體積
50 μ 1
RT不對(duì)稱PCR反應(yīng)液的配制 使用量μ 1
5 5 10
21
50 μ 1 3) RT-不對(duì)稱PCR反應(yīng)程序的設(shè)置設(shè)置PCR反應(yīng)程序如下50°C 30分鐘，94°C 2分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C 30秒，58°C 20 秒，72 0C 30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘。4.檢測(cè)及結(jié)果判定將上述PCR產(chǎn)物滴于納米金生物傳感器的樣品墊上，約10分鐘通過觀察T線和C 線的出現(xiàn)情況即可判斷結(jié)果。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)1)C線(質(zhì)控線)出現(xiàn)紅色的線證明納米金生物傳感器有效。2)T線(檢測(cè)線)出現(xiàn)紅色的線與否，是陽(yáng)性陰性判別的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陽(yáng)性；2)C線出現(xiàn)紅色的線，同時(shí)T線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明被檢樣品為陰性；3)C線沒有出現(xiàn)紅色的線，說明納米生物傳感器失效。A/ws/33 (HlNl)，A/hongkong/8/68(H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、甲型 Hmi 流感 病毒，經(jīng)甲型核酸納米金生物傳感器檢測(cè)T線、C線均出現(xiàn)紅色的線(圖2A) ；B型流 感病毒只有C線出現(xiàn)紅色的線而T線沒有出現(xiàn)紅色的線(圖2B)。A/ws/33 (HlNl)，A/ hongkong/8/68 (H3N2)、A/P2/8/34 (HlNl)、B型流感病毒，經(jīng)甲型Hmi核酸納米金生物傳感 器檢測(cè)只有C線出現(xiàn)紅色的線而T線沒有出現(xiàn)紅色的線(圖3A)；甲型Hmi流感病毒經(jīng)甲 型Hmi核酸納米金生物傳感器檢測(cè)T線、C線均出現(xiàn)紅色的線(圖3B)。試驗(yàn)結(jié)果均符合 預(yù)期期望。序列表(SEQUENCELISTING)<110>中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院<120>用于檢測(cè)甲型流感病毒及甲型Hmi流感病毒的核酸納米金生物傳感器<130><160>10<170>PatentIn version 3.4 13
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
tgcagtcctc gctcactggg cacg
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
agggcattyt ggacaaakcg tcta
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
tagacgmttt gtccaraatg ccct
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
gaccratcct gtcacctctg ac
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
agggcattyt ggacaaakcg tcta
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
ttgcgaatgc atatctcggt
<210>7
<211>20
<212>DNA
24
24
24
22
24
20
14
<213>人工合成<400>7tgcaatcgtg gactggtgta20<210>8
<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>8tacaccagtc cacgattgca20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>9gaagcaactg gaa23<210>10<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>10tgcaatcgtg gactggtgta20
權(quán)利要求
一種用于檢測(cè)甲型流感病毒的核酸納米金生物傳感器，其特征在于包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一種用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒的核酸納米金生物傳感器，其特征在于包括從左 到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠 體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與 鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸 探針包含如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形 成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 6所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸納米金生物傳感器，其特征在于所述質(zhì)控線與檢 測(cè)線相距3-10mm ；所述固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙的相鄰 部分彼此重疊l_5mm ；所述膠體金的粒徑為8-lOOnm。
4.含有如權(quán)利要求1所述的核酸納米金生物傳感器的用于檢測(cè)甲型流感病毒的試劑品.ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括RT-不對(duì)稱PCR反應(yīng)試劑，包 含10倍RT-PCR緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA酶抑制劑、上游引物、下游引物；其中，上游 引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸 序列；所述酶混合液是由Taq酶5U/μ 1和逆轉(zhuǎn)錄酶5U/μ 1以體積比1 1混合組成。
6.含有如權(quán)利要求2所述的核酸納米金生物傳感器的用于檢測(cè)甲型Hmi流感病毒的 試齊U盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括RT-不對(duì)稱PCR反應(yīng)試劑，包 含10倍RT-PCR緩沖液、鎂離子、酶混合液、RNA酶抑制劑、上游引物、下游引物；其中，上游 引物含有如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸 序列；所述酶混合液是由Taq酶5U/ μ 1和逆轉(zhuǎn)錄酶5U/ μ 1以體積比1 1混合組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或7所述的試劑盒，其特征在于所述上游引物與下游引物之間的 濃度比為10 1-100 1。
9.一種甲型流感病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟1)病毒RNA的提取a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400ul病毒樣本加入0.5mlTrizol，反復(fù)震蕩，抽 吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0.Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37 °C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；C)在上清液中加入0. Iml的異丙醇，20-37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心15 分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0.5ml的75 %乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使沉淀 干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR擴(kuò)增采用50 μ 1的逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系10倍RT-PCR緩沖液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制劑1 μ 1，鎂離子5mM, Taq酶5U， 反轉(zhuǎn)錄酶5U,上游引物0. 4 μ Μ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；反應(yīng)程序50°C 30分鐘，94°C 2分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C 30秒，58°C 20秒，72°C 30秒，35 個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘；3)采用核酸納米金生物傳感器對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及結(jié)果分析所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、 硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠 體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與 鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸 探針包含如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形 成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0. 1所示的核苷酸序列；將步驟2所得的PCR產(chǎn)物分別滴加入所述的甲型流感病毒核酸納米金生物傳感器及 甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的情況進(jìn)行結(jié)果分析 檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陽(yáng)性；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，而檢測(cè)線未出現(xiàn)紅 色，表明被檢樣品為陰性。
10. 一種甲型Hmi流感病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟1)病毒RNA的提取a)從已滅活的病毒培養(yǎng)液中取200-400ul病毒樣本加入0.5mlTrizol，反復(fù)震蕩，抽 吸以利于病毒裂解，20-37°C下孵化5分鐘；b)在病毒裂解液中加入0.Iml的氯仿并震蕩至乳糜化，20-37 °C下孵化10分鐘， 40C 12000rpm下離心15分鐘，取上清液；c)在上清液中加入0.Iml的異丙醇，20-37°C下孵化10分鐘，4°C 12000rpm下離心15 分鐘，去掉上清液，使沉淀干燥；d)加入0.5ml的75 %乙醇洗滌沉淀，4°C 7500rpm下離心5分鐘，除盡上清液，使沉淀 干燥，該沉淀為病毒樣本的RNA ；e)用焦碳酸二乙酯水20μ 1溶解RNA沉淀，RNA溶液于_80°C下保存；2)逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR擴(kuò)增采用50 μ 1的逆轉(zhuǎn)錄及不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系10倍RT-PCR緩沖液5 μ 1，dNTP溶液5 μ 1，RNA酶抑制劑1 μ 1，鎂離子5mM, Taq酶5U，反轉(zhuǎn)錄酶5U,上游引物0. 4 μ Μ,下游引物0. 02 μ Μ,病毒RNA4 μ 1 ；其中，上游引物含有如SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列，下游引物含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列；反應(yīng)程序50°C 30分鐘，94°C 2分鐘，1個(gè)循環(huán)；94°C 30秒，58°C 20秒，72°C 30秒，35 個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘；3)采用核酸納米金生物傳感器對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及結(jié)果分析 所述的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、 硝酸纖維素膜和吸水紙；所述玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是由巰基修飾并與膠 體金偶聯(lián)形成的，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；所述硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針是用生物素標(biāo)記并與 鏈霉親和素偶聯(lián)形成的；固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸 探針包含如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形 成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ IDN0.6所示的核苷酸序列；將步驟2所得的PCR產(chǎn)物分別滴加入所述的甲型流感病毒核酸納米金生物傳感器及 甲型Hmi核酸納米金生物傳感器的加樣孔中，觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線的情況進(jìn)行結(jié)果分析 檢測(cè)線和質(zhì)控線同 時(shí)出現(xiàn)紅色，表明被檢樣品為陽(yáng)性；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色，而檢測(cè)線未出現(xiàn)紅 色，表明被檢樣品為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)甲型流感病毒及甲型H1N1流感病毒的核酸納米金生物傳感器，包括從左到右依次固定于膠板上的樣品墊、玻璃纖維、硝酸纖維素膜和吸水紙；玻璃纖維上涂有納米金標(biāo)記寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO.2或7所示的核苷酸序列；硝酸纖維素膜上固定有兩種寡核苷酸探針，固定于靠近吸水紙一端的寡核苷酸探針形成質(zhì)控線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO.3或8所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纖維一端的寡核苷酸探針形成檢測(cè)線，該寡核苷酸探針包含如SEQ ID NO.1或6所示的核苷酸序列。本發(fā)明的核酸納米金生物傳感器，制備簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速，不需要專業(yè)的技術(shù)人員及昂貴的儀器設(shè)備。
文檔編號(hào)C12M1/34GK101942387SQ20091004097
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日
發(fā)明者劉國(guó)東, 曾令文, 頓博影 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院