專利名稱：：軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及團(tuán)菌種檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種不僅能檢測臨床和環(huán)境水標(biāo)本中的軍團(tuán)菌，而且可以對軍團(tuán)菌進(jìn)行分型為嗜肺軍團(tuán)菌與非嗜肺軍團(tuán)菌的軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒及其檢測方法。技術(shù)背景s目前，軍團(tuán)菌檢測試劑盒主要分為兩大類。一是利用抗原抗體反應(yīng)檢測軍團(tuán)菌特異抗體或抗原，此類試劑盒包括軍團(tuán)菌ELISA法試劑盒以及軍團(tuán)菌膠體金試劑盒，因為軍團(tuán)菌相關(guān)抗原或抗體在軍團(tuán)菌感染病人體內(nèi)出現(xiàn)較晚，一般需要一周及以上的時間才能檢測到，同時只能檢測嗜肺軍團(tuán)菌，而且具有一定的交叉反應(yīng)，所以該類型的試劑盒具有一定的局限性。第二類是利用分子生物學(xué)方法檢測軍團(tuán)菌，如熒光定量PCR檢測嗜肺軍團(tuán)菌試劑盒，該試劑盒僅可用以檢測嗜肺軍團(tuán)菌，對非嗜肺軍團(tuán)菌不能檢測。雖然臨床上80%以上的軍團(tuán)菌感染都是由嗜肺軍團(tuán)菌引起，水環(huán)境也廣泛存在嗜肺軍團(tuán)菌，但是非嗜肺軍團(tuán)菌也具有較為廣泛的存在性和一定的感染力。因此一種既能檢測軍團(tuán)菌屬又能鑒別出屬于嗜肺軍團(tuán)菌與非嗜肺軍團(tuán)菌種的檢測試劑盒是很有必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對以上所述軍團(tuán)菌檢測試劑盒存在的不足，提供一種不僅能檢測臨床和環(huán)境水標(biāo)本中的軍團(tuán)菌，而且可以對軍團(tuán)菌進(jìn)行分型為嗜肺軍團(tuán)菌與非嗜肺軍團(tuán)菌的軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒的檢測方法本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的；軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒，包括細(xì)菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中；所述的PCR反應(yīng)液包括第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液，第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液分別置于容器中。其中第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下-TaqDNA聚合酶4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每種TrisHCl(pH8.3)MgCl2引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC〉引物2(CCAACAGCTAGTTGACATCG)所述的第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下TaqDNA聚合酶4xdNTP(dATP，dCTP,dGTP，anddTTP)每種TrisHCl(p戰(zhàn).3)KC1MgCl2引物i(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)引物3(ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC)0.150.25阿oyL。所述的DNA提取液含有的組分及組分濃度如下Cheiex100resin5%，TrisHCL[pHO〗1O薩oi/L，EDTANa2O.lmmoi/L，NaN3(疊氮鈉)0.1%，蛋白酶KiO(^ig/ml?？焖僖c測軍團(tuán)菌種試劑盒的撿測方法，其檢測步驟如下應(yīng)用DNA提取液提取檢測樣品中的細(xì)菌基因組DNA;以細(xì)菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴(kuò)增1520個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴(kuò)增3540循環(huán)，將所得的最終PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后，加入到PCR純化柱內(nèi)，離心后加入第二0.040.06U4d，200300jimol/L,812mmoi/L，4060mmoi/L，l,52.0mmol/L，O.150.25,ol/L，0.150.25拜ol/L。0,040.06U4il,20030(Himoi/L，812mmol/L，4060mmol/L，〗..52.0mmol/L;O.150.25,ol/L,，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中消化0.52.0小時后，將酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發(fā)明不僅可運用于臨床標(biāo)本如痰液、支氣管灌洗液中軍團(tuán)菌種的檢測，也可以運用于水標(biāo)本中軍團(tuán)菌檢測，具有快速，簡便，易于使用的優(yōu)點。同時本試劑盒還可以鑒別軍團(tuán)菌種，即通過本試劑盒的檢測，可以獲知臨床標(biāo)本與水環(huán)境標(biāo)本中軍團(tuán)菌的類型，即是嗜肺軍團(tuán)菌、或非嗜肺軍團(tuán)菌、或二者兼有?？偟膩碚f,PCR反應(yīng)液檢測軍團(tuán)菌屬具有良好的敏感性和特異性，敏感性達(dá)到102103cfo/ml，特異性在95%以上；酶切反應(yīng)液可對檢測出的軍團(tuán)菌屬分型到種，分型準(zhǔn)確率達(dá)99%。圖i為本發(fā)明軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒的實施流程示意圖；圖2a為PCR陽性結(jié)果條帶圖PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳檢測中出現(xiàn)226bp條帶說明，樣品中檢測出軍團(tuán)菌；圖2b為PCR陰性結(jié)果條帶圖PCR反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳檢測未出現(xiàn)226bp條帶，說明樣品中未檢測出軍團(tuán)菌，報告為未檢測出軍團(tuán)菌；圖2c為酶切陰性結(jié)果條帶圖酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶與對照條帶比較，若只有226bp條帶，則說明樣品中僅有非嗜肺軍團(tuán)菌[非菲氏(L,feeleii)及昆氏軍團(tuán)菌(L.quinlivanii);圖2d為酶切陽性結(jié)果1條帶圖酶切后出現(xiàn)180bp條帶，說明檢測出嗜肺軍團(tuán)菌；圖2e為酶切陽性結(jié)果2條帶圖酶切后出現(xiàn)153bp條帶，說明檢測出菲氏(X,feeleii)及昆氏(Lquinli、適ii)軍團(tuán)菌；圖2f為其他結(jié)果l條帶圖酶切后出現(xiàn)180bp，153bp條帶，說明樣品中含有嗜肺軍團(tuán)菌和菲氏(L.feeleii)和(或)昆氏(L,quinlivanii)軍團(tuán)菌。圖2g為其他結(jié)果2條帶圖酶切后出現(xiàn)153bp及i80bp，和226bp條帶，說明樣品中檢出嗜肺軍團(tuán)菌。菲氏或昆氏軍團(tuán)菌及其他非嗜肺軍團(tuán)菌；圖2h為其他結(jié)果3條帶圖酶切結(jié)果出現(xiàn)226bp與180bp，則樣品中檢測出非嗜肺軍團(tuán)菌與嗜肺軍團(tuán)菌，且其中非嗜肺軍團(tuán)菌不為菲氏或昆氏軍團(tuán)菌；圖2i為其他結(jié)果4條帶圖酶切結(jié)果出現(xiàn)226bp與153bp條帶，則樣品中撿測出非嗜肺軍團(tuán)菌，其中非嗜肺軍團(tuán)菌包含菲氏與昆氏軍團(tuán)菌及其他非嗜肺軍團(tuán)菌。具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明；軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒，包括細(xì)菌基因組DNA提取液，第一PCR反應(yīng)液、第二PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中。其中，DNA提取液用于提取細(xì)菌基因組DNA;第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液是用來通過兩歩PCR反應(yīng)擴(kuò)增軍團(tuán)菌屬特異的基因片段。PCR產(chǎn)物純化液與純化柱一起純化PCR產(chǎn)物。酶切反應(yīng)液用于消化PCR產(chǎn)物，然后將產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳。第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>優(yōu)化的第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>所述的第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表。。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所述的PCR產(chǎn)物純化液包括如下表三種DNA純化液，三種PCR產(chǎn)物純化液分別置于容器中，如下表；PCR產(chǎn)物純化液的組成第一PCR純化液碧云天生物技術(shù)研究所的PCR純化試劑盒DNA結(jié)合液第二PCR純化液碧云天生物技術(shù)研究所PCR純化試劑盒洗滌液第三PCR純化液碧云天生物技術(shù)研究所PCR純化試劑盒洗脫液所述的DNA提取液含有的組分及組分濃度如下表:DNA提取液組成成分濃度Chdex廳resin5%TrisHCl[pH8.3iOmmoi/LEDTANa2(乙二胺四乙酸二鈉)O'lmmo!/L暴Jl嫁瞓!《0.1%蛋白酶K廳jxg/ml快速檢測軍團(tuán)菌種試劑盒的檢測方法，其檢測步驟如下應(yīng)用DNA提取液提取檢測樣品中的細(xì)菌基因組DNA;以細(xì)菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴(kuò)增1520個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴(kuò)增3540循環(huán)，將所得的最終PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后，加入到PCR純化柱內(nèi)，離心后加入第二PCR純化液，再次離心后，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中消化0.52。0小時后，將酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測?？焖贆z測軍團(tuán)菌種試劑盒的檢測方法的優(yōu)選步驟是快速檢測軍團(tuán)菌種試劑盒的檢測方法的優(yōu)選步驟是如圖1所示，應(yīng)用DNA提取液提取經(jīng)過預(yù)處理的待檢樣品中的細(xì)菌基因組DNA;以細(xì)菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴(kuò)增15個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴(kuò)增35循環(huán)，將所得的最終PCR產(chǎn)物，取取5ui最終PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳電泳，根據(jù)圖2a和2b檢測出軍團(tuán)菌；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后-加入到PCR純化柱內(nèi)后依次經(jīng)離心、洗滌、洗脫，離心后加入第二PCR純化液，再次離心后，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液在37°C下消化1小時后，在酶切產(chǎn)物中取取8P1作瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)圖2a2i所示對軍團(tuán)菌進(jìn)行分子分型。權(quán)利要求1、軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒，包括細(xì)菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中；所述的PCR反應(yīng)液包括第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液，第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液分別置于容器中；其中第一PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下TaqDNA聚合酶0.04～0.06U/μl，4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每種200～300μmol/L，Tris～HCl(pH8.3)8～12mmol/L，KCl40～60mmol/L，MgCl21.5～2.0mmol/L，引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)0.15～0.25μmol/L，引物2(CCAACAGCTAGTTGACATCG)0.15～0.25μmol/L；所述的第二PCR反應(yīng)液含有的組分及組分濃度如下TaqDNA聚合酶0.04～0.06U/μl，4xdNTP(dATP，dCTP，dGTP，anddTTP)每種200～300μmol/L，Tris～HCl(pH8.3)8～12mmol/L，KCl40～60mmol/L，MgCl21.5～2.0mmol/L，引物1(AGGGTTGATAGGTTAAGAGC)0.15～0.25μmol/L，引物3(ATTCCACTACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACC)0.15～0.25μmol/L。2、如權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于所述的DNA提取液含有的組分及組分濃度如下Chdex100fesin5%,TrisHCL[pHg.310mmol/L，EDTANa20,l纖oi/L，NaN30.1%，蛋白酶K100pg/mi。3、如權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于其檢測步驟如下應(yīng)用DNA提取液提取檢測樣品中的細(xì)菌基因組DNA;以細(xì)菌基因組DNA為模板，應(yīng)用第一PCR反應(yīng)液擴(kuò)增1520個循環(huán)后，以前一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，用第二PCR反應(yīng)液擴(kuò)增3540循環(huán)，將所得的最終PGR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳；將第一PCR純化液與最終PCR產(chǎn)物混合后，加入到PCR純化柱內(nèi)，離心后加入第二PCR純化液，再次離心后，加入第三PCR純化液后離心，得到PCR純化產(chǎn)物；將PCR純化產(chǎn)物加入到酶切反應(yīng)液中消化0,52.0小時后，將酶切產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測。全文摘要本發(fā)明公開了一種軍團(tuán)菌種快速檢測試劑盒，包括細(xì)菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物純化液，酶切反應(yīng)液等組成，以上液體分別置于容器中；所述的PCR反應(yīng)液包括第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液，第一PCR反應(yīng)液和第二PCR反應(yīng)液分別置于容器中。本發(fā)明另外公開了該試劑盒的檢測方法。本發(fā)明不僅可運用于臨床標(biāo)本如痰液、支氣管灌洗液中軍團(tuán)菌種的檢測，也可以運用于水標(biāo)本中軍團(tuán)菌檢測，具有快速，簡便，易于使用的優(yōu)點。文檔編號C12Q1/68GK101597647SQ20091004095公開日2009年12月9日申請日期2009年7月9日優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日發(fā)明者張遠(yuǎn)志,朱慶義,李連青,胡朝暉,詹曉勇申請人:廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司