專(zhuān)利名稱(chēng)：菊花滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)或鑒別菊花滑刃線蟲(chóng)的方法以及一種可檢測(cè)菊花滑刃線蟲(chóng)的診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
菊花滑刃線蟲(chóng)(Aphelenchoides ritzemabosi)是花卉重要的植物寄生線蟲(chóng)病害 之一，其寄主廣泛，能在觀賞植物、蔬菜類(lèi)、小果類(lèi)和雜草等200多種植物上寄生。該線蟲(chóng)主 要危害葉片，同時(shí)也能侵染花芽和花。該線蟲(chóng)除危害菊花外，還危害翠菊、金光菊、大麗菊、 百日草等多種菊科植物，以及茄科植物或罌粟科植物，或煙草、草莓、珠蘭、百合、蒲包花、飛 燕草、夾竹桃等作物或花卉。被害株葉片枯死，開(kāi)花不好或不能開(kāi)花，重則整株變黑，最終導(dǎo) 致植株枯死。菊花滑刃線蟲(chóng)分布廣泛，在日本、美國(guó)菊花葉線蟲(chóng)病被認(rèn)為是菊花的災(zāi)難性病 害。全世界有75個(gè)國(guó)家在菊花上發(fā)現(xiàn)這種病害，損失率達(dá)12.3%，因而被我國(guó)列為對(duì)內(nèi)對(duì) 外重要的檢疫線蟲(chóng)。菊花滑刃線蟲(chóng)主要是種苗帶病傳播，一旦侵入植株就難以用藥劑防治，只能及時(shí) 拔除，集中燒毀，因此防治的主要措施是通過(guò)檢疫進(jìn)行隔絕。然而，目前的檢測(cè)手段主要是 用直接浸泡法或貝曼漏斗法分離線蟲(chóng)，然后鏡檢，根據(jù)菊花滑刃線蟲(chóng)的形態(tài)特征進(jìn)行判斷。 這種方法存在一定的弊端，主要表現(xiàn)在一、菊花滑刃線蟲(chóng)屬于滑刃線蟲(chóng)屬，滑刃線蟲(chóng)種類(lèi) 繁多，通常鑒定的樣品中會(huì)有多種形態(tài)相似的線蟲(chóng)，這就要求鑒定者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)；二、 線蟲(chóng)個(gè)體間存在差異，這需要有足夠的鑒定樣本；三、形態(tài)學(xué)鑒定只適用于成蟲(chóng)，而對(duì)于幼 蟲(chóng)不適用。因此，研究出對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法實(shí)為必要。
發(fā)明內(nèi)容
為克服上述缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出菊花滑刃 線蟲(chóng)的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供菊花滑刃線蟲(chóng)診斷用試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的菊花滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)方法包括(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測(cè)線蟲(chóng)，提取DNA ；(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2的引物， 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)檢測(cè)步驟(b)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷菊花滑刃線蟲(chóng)的存在。優(yōu)選地，步驟(c)中所述的檢測(cè)的方法為電泳檢測(cè)，更優(yōu)選為瓊脂糖凝膠電泳。通 過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可方便、快捷地檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有特異性擴(kuò)增的片段，以及該 片段的大小。本發(fā)明的方法利用分子生物學(xué)原理，使用發(fā)明人設(shè)計(jì)的如序列表中所列的一對(duì)特 異性引物，來(lái)擴(kuò)增菊花滑刃線蟲(chóng)的基因組DNA。如果待檢測(cè)的線蟲(chóng)確為菊花滑刃線蟲(chóng)，則通 過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)后可獲得擴(kuò)增的特異性片段，當(dāng)電泳檢測(cè)時(shí)，會(huì)顯示出特異性條 帶；如果待檢測(cè)的線蟲(chóng)非菊花滑刃線蟲(chóng)，則通過(guò)PCR后不能獲得擴(kuò)增的特異性片段，當(dāng)電泳檢測(cè)時(shí)，就不會(huì)顯示出特異性條帶。因此，可通過(guò)電泳檢測(cè)結(jié)果中是否出現(xiàn)特異性條帶來(lái)判 斷出待檢測(cè)線蟲(chóng)是否為菊花滑刃線蟲(chóng)。為更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，針對(duì)不同數(shù)量的線蟲(chóng)，其DNA提取方法可分為(1)當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在大量線蟲(chóng)時(shí)，采用Minipr印DNA提取法分 離出DNA。(2)當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在單條線蟲(chóng)時(shí)，步驟(a)中所述的提取包括 以下步驟(i)將單條線蟲(chóng)加入含有WLB溶液的管中；(ii)于-70°C放置 30-60min ；95°C放置 15_20min ；55_65°C放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C處理30min-2h ；95°C處理15_20min，以獲得作為單條 線蟲(chóng)DNA模板的產(chǎn)物。優(yōu)選地，上述植物材料是菊科植物材料、茄科植物材料或罌粟科植物材料。所述菊 科植物選自翠菊、金光菊、大麗菊和百日草的種苗或植株。在另一實(shí)施方式中，所述植物材料是煙草、草莓、珠蘭、百合、蒲包花、飛燕草或夾 竹桃的種苗或植株。另一方面，為了更方便地使用本發(fā)明的方法，本發(fā)明還提供一種用于診斷菊花滑 刃線蟲(chóng)的試劑盒，其包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的引物對(duì)。本發(fā)明的方法適用于土樣、種苗和植株樣品中菊花滑刃線蟲(chóng)的快速檢測(cè)和鑒定， 與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)結(jié)果可靠通過(guò)對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)的3個(gè)不同地理種群和水稻干尖線蟲(chóng) (A. besseyi)、福建滑刃線蟲(chóng)(A. fujianensis)、擬滑刃線蟲(chóng)(Paraphelenchidea sp.)、真 滑刃線蟲(chóng)(Apelenchus sp.)、阿蘇里傘滑刃線蟲(chóng)(Bursaphelenchus athuri)和松材線蟲(chóng) (B. xylophilus)的測(cè)試驗(yàn)證表明，本發(fā)明的方法檢測(cè)的結(jié)果具有極高的可靠性。(2)操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)線蟲(chóng)樣本進(jìn)行簡(jiǎn)單處理、PCR擴(kuò)增和常規(guī) 的瓊脂糖凝膠電泳后即可判定結(jié)果，一般整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在4小時(shí)內(nèi)完成。(3)檢測(cè)靈敏度高利用本發(fā)明的引物對(duì)可擴(kuò)增出單條菊花滑刃線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)或成 蟲(chóng)的特異性片段，因此本發(fā)明的方法靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，可滿足農(nóng)作物種植前和植物檢疫 過(guò)程中對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)快速可靠的檢測(cè)和鑒定需要。
圖1顯示的是利用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)不同滑刃線蟲(chóng)的基因組DNA的PCR擴(kuò)增的
結(jié)果；圖2顯示的是利用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)的單條線蟲(chóng)基因組DNA的PCR 擴(kuò)增的結(jié)果；圖3顯示的是利用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)3個(gè)不同菊花滑刃線蟲(chóng)地理種群的單條線 蟲(chóng)基因組DNA的PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供的菊花滑刃線蟲(chóng)基因組DNA擴(kuò)增引物序列如下所示5， -TCGATGAAGAACGCAGTGAATT-3，；5， -CTCCACACGCCGACCGA-3，上述引物可在菊花滑刃線蟲(chóng)基因組DNA上特異性地?cái)U(kuò)增出208bp的產(chǎn)物。1.準(zhǔn)確件試驗(yàn)-菊花滑刃線蟲(chóng)的特異件擴(kuò)增
試驗(yàn)步驟采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酚氯仿法(Minipr印DNA提取法)，分別提 取菊花滑刃線蟲(chóng)、水稻干尖線蟲(chóng)、福建滑刃線蟲(chóng)、滑刃線蟲(chóng)種1、滑刃線蟲(chóng)種2、擬滑刃線蟲(chóng)、 真滑刃線蟲(chóng)、阿蘇里傘滑刃線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)的基因組DNA。提取方法如下(1)將線蟲(chóng)收 集到1. 5mL離心管中，用與離心管配套的錐形研磨棒研磨成粉末，加入700 μ 1提取緩沖液 (50mM Tris-HCl, ρΗ7· 5 ；50mM NaCl ；5mM EDTA, ρΗ8· 0 ；0. 5% SDS)禾口 7 μ 1 的 20mg/ml 蛋 白酶K，輕輕混勻；(2) 50°C水浴2-5h ； (3)加入等體積的Tris飽和酚，輕輕混勻，12000rpm, 4°C下離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一滅菌的1.5ml離心管中；(4)加入等體積的氯仿/異 戊醇(24 1)，輕輕混勻，12000rpm，4°C下離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一滅菌的1. 5ml離 心管中；(5)加入1/10體積的3M/L醋酸鈉(pH5. 2)和2. 5體積經(jīng)預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕混 勻，放入-20°C冰箱中放置2h以上，過(guò)夜效果更好；(6) 12000rpm，4°C下離心IOmin以沉淀 DNA ； (7)沉淀物用75%的乙醇洗滌2次，待乙醇揮發(fā)完全后，將沉淀的DNA溶解于20 μ 1 TEdOmMTris-HCL ρΗ8. 0，ImMEDTA)中；(7)任選地，取1 μ 1在1. 0%的瓊脂糖凝膠上粗略 檢測(cè)所提DNA的量和純度。然后，按如下PCR反應(yīng)體系和條件，使用本發(fā)明的引物對(duì)對(duì)線蟲(chóng) 樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系25μ L，包括5ng 線蟲(chóng) DNA，引物各 0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs，lXPCR 緩 沖液(包括2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94 °C 3min ；32 個(gè)循環(huán)的 94 °C 40s, 57 °C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。將5 μ L PCR產(chǎn)物用1. O % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色 后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖1所示，其中各泳道分別為M :DNA標(biāo)記DL 2000 (Takara Biotech,大連，中國(guó))(其條帶大小由上至下分別對(duì)應(yīng)為2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp 和 IOObp) ；1 菊花滑刃線蟲(chóng)(Aphelenchoides ritzemabosi) ；2 水稻干尖線蟲(chóng) (Aphelenchoidesbesseyi) ；3:福建滑刃線蟲(chóng)(A. fujianensis) ；4 滑刃線蟲(chóng)種群 1 (Α. sp.l) ；5 滑刃線蟲(chóng)種群 2 (A. sp. 2) ；6:擬滑刃線蟲(chóng)(Paraphelenchidea sp. ) ；7 真滑刃 線蟲(chóng)(Apelenchus sp.) ；8 阿蘇里傘滑刃線蟲(chóng)(Bursaphelenchus athuri) ；9 松材線蟲(chóng) (B. xylophilus)。從圖中可看出，只在菊花滑刃線蟲(chóng)上擴(kuò)增出大小為208bp的特異性條帶 (對(duì)應(yīng)于第1泳道)。因此，可看出本發(fā)明的方法使用的引物對(duì)具有高度的特異性，從而保證了檢測(cè)結(jié) 果的高準(zhǔn)確性。2.靈敏Itt驗(yàn)-X寸單 ？花滑刃線蟲(chóng)的擴(kuò)Jf實(shí)驗(yàn)步驟在解剖鏡下分離出的單條成蟲(chóng)或幼蟲(chóng)，將其加入含有8 μ LffLB溶液 (2. 5mmol/L 二硫蘇糖醇，1. 125%吐溫 20,0. 25g/L 明膠，125mmol/L 氯化鉀，3. 75mmol/L 氯 化鎂，25mmol/L Tris-Cl (pH 8.3))的 PCR 管中，然后-70°C放置 30min ;95°C放置 15min ；65°C放置2min ；再加入20mg/mL的蛋白酶K 1 μ L，65°C處理30min ；95°C處理15min后，作為單條線蟲(chóng)DNA模板直接用于PCR擴(kuò)增。PCT反應(yīng)體系和條件如下PCR反應(yīng)體系25μ L，包括2μ L單條線蟲(chóng)裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR緩沖液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94 °C 3min ；32 個(gè)循環(huán)的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16°C 保存；將5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 0 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色 后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖2所示，其中泳道M :DNA標(biāo)記DL 2000 (TakaraBiotech，大連， 中國(guó))；泳道1-11為單條菊花滑刃線蟲(chóng)裂解DNA擴(kuò)增；泳道12 清水對(duì)照。從圖中可看出， 實(shí)驗(yàn)泳道都擴(kuò)增出特異性條帶，經(jīng)分析為208bp的產(chǎn)物，而對(duì)照組則沒(méi)有特異性條帶。因此，本發(fā)明的方法靈敏度非常高，即使單條菊花滑刃幼蟲(chóng)亦能準(zhǔn)確檢測(cè)出，大大 方便了實(shí)際應(yīng)用。3.龍十牛_-_諸碰秘__雜觸隱曾實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)采集于昆明、廣州和美國(guó)的菊花上的菊花滑刃線蟲(chóng)的3個(gè)種群?jiǎn)螚l 線蟲(chóng)，按上述靈敏度實(shí)驗(yàn)中的方法裂解DNA，以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件如下PCR反應(yīng)體系25μ L，包括2μ L單條線蟲(chóng)裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR緩沖液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94 °C 3min ；35 個(gè)循環(huán)的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。將5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 0 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色 后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖3所示，其中泳道M :DNA標(biāo)記DL2000 (TakaraBiotech，大連， 中國(guó))；泳道1 昆明菊花滑刃線蟲(chóng)裂解DNA擴(kuò)增；泳道2 廣州菊花滑刃線蟲(chóng)裂解DNA擴(kuò)增； 泳道3 美國(guó)菊花滑刃線蟲(chóng)裂解DNA擴(kuò)增；泳道4 清水對(duì)照。從圖中可看出，實(shí)驗(yàn)泳道均顯 示出特異性條帶，經(jīng)分析對(duì)應(yīng)大小為208bp，而對(duì)照組則未顯示。因此，本發(fā)明的方法具有很高的可靠性，對(duì)于不同地區(qū)的菊花滑刃線蟲(chóng)均能非常 靈敏地檢測(cè)出。因而，本發(fā)明的方法適用范圍廣，不受局部地區(qū)的限制。另一方面，為更加方便地實(shí)施本發(fā)明的方法，本發(fā)明還提供一種用于診斷菊花滑 刃線蟲(chóng)病的試劑盒，其包含如序列表中SEQ ID NO 1和SEQID NO 2所提供的引物對(duì)、PCR 反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、dNTP和DNA提取液。利用本發(fā)明提供的方法或試劑盒檢測(cè)或鑒定菊花滑刃線蟲(chóng)，具有很高的可靠性和 靈敏度，且操作方便，不依賴(lài)操作人員的經(jīng)驗(yàn)，準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，可滿足農(nóng)作物種植前和 植物檢疫過(guò)程中對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)快速可靠的檢測(cè)和鑒定需要。雖然本發(fā)明只對(duì)菊科植物中的菊花上的菊花滑刃線蟲(chóng)作出介紹，但本領(lǐng)域的技術(shù) 人員在了解本發(fā)明的內(nèi)容后，將很容易地意識(shí)到，本發(fā)明的方法和試劑盒仍能夠適用于其 他任何疑似感染菊花滑刃線蟲(chóng)的植物材料(例如，其他菊科植物以及其他花卉等)的檢測(cè) 和診斷。序列表
<110> 崔汝強(qiáng)<120>菊花滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)方法及診斷試劑盒<160>2
<210>1
<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgatgaaga acgcagtgaa tt<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2ctccacacgc cgaccga
權(quán)利要求
一種檢測(cè)菊花滑刃線蟲(chóng)的方法，其包括(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測(cè)線蟲(chóng)，提取DNA；(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的引物對(duì)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)檢測(cè)步驟(b)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷菊花滑刃線蟲(chóng)的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在大量線 蟲(chóng)時(shí)，采用酚氯仿提取法提取DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述可疑植物材料或土樣只存在單條線 蟲(chóng)時(shí)，步驟(a)中所述的提取包括以下步驟(1)將單條線蟲(chóng)加入含有WLB溶液的管中；(2)于_70°C放置 30-60min ；95°C放置 15_20min ；55_65°C放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C處理30min-2h；95°C處理15_20min，以獲得作為單條線蟲(chóng) DNA模板的產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料為菊科植物材料、茄科植物材 料或罌粟科植物材料。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料為煙草、草莓、珠蘭、百合、蒲 包花、飛燕草或夾竹桃的種苗或植株。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(c)中所述檢測(cè)步驟(b)中獲得的 擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為電泳檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述菊科植物為翠菊、金光菊、大麗菊或百 日草。
8.一種用于診斷菊花滑刃線蟲(chóng)病的試劑盒，其包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引 物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種菊花滑刃線蟲(chóng)的檢測(cè)方法，該方法使用序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2作為引物對(duì)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過(guò)電泳分析可得知是否得到特異性片段，從而檢測(cè)或鑒定出是否為菊花滑刃線蟲(chóng)。另外，本發(fā)明還提供了診斷菊花滑刃線蟲(chóng)的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物對(duì)。本發(fā)明的方法和試劑盒具有很高的可靠性和靈敏度，且操作方便，不依賴(lài)操作人員的經(jīng)驗(yàn)，準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，可滿足農(nóng)作物種植前和植物檢疫過(guò)程中對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)快速可靠的檢測(cè)和鑒定需要。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101812502SQ200910037299
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者馮黎霞, 劉中勇, 吳海榮, 孫曉棠, 崔汝強(qiáng), 胡佳, 胡學(xué)難, 趙立榮, 鐘國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:崔汝強(qiáng)