專利名稱：水稻干尖線蟲的檢測(cè)方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)或鑒定水稻干尖線蟲的方法以及一種檢測(cè)或鑒定水稻干尖 線蟲的試劑盒。
背景技術(shù)：
水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi Christie)，又稱貝西滑刃線蟲，寄 主最主要是水稻，可引起水稻干尖或白尖病，全國(guó)各水稻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，一般可造成減產(chǎn) 10% -20%，嚴(yán)重者可達(dá)30%以上。其還會(huì)引起草莓的夏矮病，受害草莓葉片皺縮畸形、植 株矮化、開花減少，產(chǎn)量大大降低。同時(shí)，該線蟲也是玉米、甘薯、大豆、蔬菜、蘭花、菊花、大 麗花等作物或花卉的重要病害，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低。水稻干尖線蟲主要是種子帶病傳播，一旦侵入植株就難以用藥劑防治，只能及時(shí) 拔除，集中燒毀，因此防治的主要措施是通過檢疫進(jìn)行隔絕。中國(guó)專利申請(qǐng)98111429. 6公開了一種采用二硫氰基甲烷或其鹽類化合物，通過 浸種、拌種或種子包衣技術(shù)來防治水稻干尖線蟲病、惡苗病、胡麻斑病、苗稻瘟病、大、小麥、 青稞和玉米等作物條紋病、堅(jiān)黑穗病、腥黑穗病、網(wǎng)斑病、紋枯病的方法。中國(guó)專利申請(qǐng)200710158025. 4公開了具毒殺植物寄生線蟲作用的真菌的培 養(yǎng)方法及其代謝物制備方法和應(yīng)用，該申請(qǐng)所公開的木霉菌菌株Snef85為哈茨木霉 Trichoderma harzianum，其代謝產(chǎn)物對(duì)植物寄生線蟲，特別是對(duì)南方根結(jié)線蟲、水稻干尖 線蟲和大豆胞囊線蟲具有毒力高，殺線蟲效果明顯的突出特點(diǎn)。中國(guó)專利申請(qǐng)200810010465. X則公開了具毒殺植物線蟲作用的鏈霉菌的培養(yǎng)方 法及其代謝物制備方法和應(yīng)用，該申請(qǐng)所公開的鏈霉菌菌株Snea253為委內(nèi)瑞拉鏈霉菌 Streptomyces venezuelae,其代謝產(chǎn)物對(duì)植物寄生線蟲，特別是對(duì)大豆胞囊線蟲、根結(jié)線 蟲和水稻干尖線蟲具有很高毒力。防治水稻干尖線蟲的基礎(chǔ)是首先對(duì)水稻干尖線蟲進(jìn)行檢測(cè)。然而，到目前為止，針 對(duì)水稻干尖線蟲的檢測(cè)方法仍是傳統(tǒng)的方法，其檢測(cè)手段主要是用直接浸泡法或貝曼漏斗 法分離線蟲，然后鏡檢，根據(jù)水稻干尖線蟲的形態(tài)特征進(jìn)行判斷。這種方法存在一定的弊 端，主要表現(xiàn)在一、水稻干尖線蟲屬于滑刃線蟲屬，滑刃線蟲種類繁多，通常鑒定的樣品中 會(huì)有多種形態(tài)相似的線蟲，這就要求鑒定者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)；二、線蟲個(gè)體間存在差異，這 需要有足夠的鑒定樣本；三、形態(tài)學(xué)鑒定只適用于成蟲，而對(duì)于幼蟲不適用。因此，研究出對(duì)水稻干尖線蟲快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法實(shí)為必要。
發(fā)明內(nèi)容
為克服上述缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出水稻干尖 線蟲的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供水稻干尖線蟲病診斷用試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的水稻干尖線蟲的檢測(cè)方法包括(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測(cè)線蟲，提取DNA ；
(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2的引物， 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)檢測(cè)步驟(b)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷水稻干尖線蟲的存在。優(yōu)選地，步驟(C)中所述的檢測(cè)的方法為電泳檢測(cè)，更優(yōu)選為瓊脂糖凝膠電泳。通 過瓊脂糖凝膠電泳可方便、快捷地檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有特異性擴(kuò)增的片段，以及該 片段的大小。本發(fā)明的方法利用分子生物學(xué)原理，使用發(fā)明人設(shè)計(jì)的如序列表中所列的一對(duì)特異性引物，來擴(kuò)增水稻干尖線蟲的基因組DNA。如果待檢測(cè)的線蟲確為水稻干尖線蟲，則通 過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)后可獲得擴(kuò)增的特異性片段，當(dāng)電泳檢測(cè)時(shí)，會(huì)顯示出特異性條 帶；如果待檢測(cè)的線蟲非水稻干尖線蟲，則通過PCR后不能獲得擴(kuò)增的特異性片段，當(dāng)電泳 檢測(cè)時(shí)，就不會(huì)顯示出特異性條帶。因此，可通過電泳檢測(cè)結(jié)果中是否出現(xiàn)特異性條帶來判 斷出待檢測(cè)線蟲是否為水稻干尖線蟲。為更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，針對(duì)不同數(shù)量的線蟲，其DNA提取方法可分為(1)當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在大量線蟲時(shí)，采用酚氯仿提取法(也稱作 "Miniprep 法”)分離出 DNA0(2)當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在單條線蟲時(shí)，步驟(a)中所述的提取包括 以下步驟(i)將單條線蟲加入含有WLB溶液的管中；(ii)于-70°C放置 30-60min ；95°C放置 15_20min ；55_65°C放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C處理30min-2h ；95°C處理15_20min，以獲得作為單條 線蟲DNA模板的產(chǎn)物。優(yōu)選地，上述植物材料是水稻植株或種子，或是草莓、玉米、甘薯、大豆、蔬菜、蘭 花、菊花或大麗花的植株。另一方面，為了更方便地使用本發(fā)明的方法，本發(fā)明還提供了一種用于診斷水稻 干尖線蟲病的試劑盒，其包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的引物對(duì)。本發(fā)明的方法適用于土樣、種子和植株樣品中水稻干尖線蟲的快速檢測(cè)和鑒定， 與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)結(jié)果可靠通過對(duì)水稻干尖線蟲的3個(gè)不同地理種群和菊花滑刃線蟲 (A. ritzemabosi)、福建滑刃線蟲(A. fujianensis)、擬滑刃線蟲(Paraphelenchidea sp.)、 真滑刃線蟲(Apelenchus sp.)、阿蘇里傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus athuri)和松材線蟲 (B. xylophilus)等線蟲的測(cè)試驗(yàn)證表明，本發(fā)明的方法檢測(cè)的結(jié)果具有極高的可靠性。(2)操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)線蟲樣本進(jìn)行簡(jiǎn)單處理、PCR擴(kuò)增和常規(guī) 的瓊脂糖凝膠電泳后即可判定結(jié)果，一般整個(gè)檢測(cè)過程可在4小時(shí)內(nèi)完成。(3)檢測(cè)靈敏度高利用本發(fā)明的引物對(duì)可擴(kuò)增出單條水稻干尖線蟲的幼蟲或成 蟲的特異性片段，因此本發(fā)明的方法靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，可滿足農(nóng)作物種植前和植物檢疫 過程中對(duì)水稻干尖線蟲快速可靠的檢測(cè)和鑒定需要。
圖1顯示的是利用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)不同滑刃線蟲的基因組DNA的PCR擴(kuò)增的結(jié)果；圖2顯示的是利用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)水稻干尖線蟲的單條線蟲基因組DNA的PCR擴(kuò)增的結(jié)果；圖3顯示的是利用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)3個(gè)不同水稻干尖線蟲地理種群的單條線 蟲基因組DNA的PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)驗(yàn)例來進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明提供的水稻干尖線蟲基因組DNA擴(kuò)增引物序列如下所示5， -TCGATGAAGAACGCAGTGAATT-3，；5， -AGATCAAAAGCCAATCGAATCAT-3，上述引物可在水稻干尖線蟲基因組DNA上特異性地?cái)U(kuò)增出312bp的產(chǎn)物。1. _十牛微-*軒4 觸白■尉牛牛“曾試驗(yàn)步驟采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酚氯仿法(Minipr印DNA提取法)，分別提 取水稻干尖線蟲、菊花滑刃線蟲、福建滑刃線蟲，滑刃線蟲種1(A. sp. 1)，滑刃線蟲種2 (Α. sp. 2)，真滑刃線蟲，擬滑刃線蟲，阿蘇里傘滑刃線蟲和松材線蟲的基因組DNA。提取方法 如下(1)將線蟲收集到1.5mL離心管中，用與離心管配套的錐形研磨棒研磨成粉末，加入 700 μ 1 提取緩沖液(50mM Tris-HCl, ρΗ7· 5 ；50mM NaCl ；5mM EDTA, ρΗ8· 0 ；0. 5% SDS)禾口 7 μ 1的20mg/ml蛋白酶K，輕輕混勻；(2) 50°C水浴2_5h ； (3)加入等體積的Tris飽和酚，輕 輕混勻，12000rpm，4°C下離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一滅菌的1. 5ml離心管中；(4)加入等 體積的氯仿/異戊醇(24 1)，輕輕混勻，12000rpm，4°C下離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一 滅菌的1. 5ml離心管中；(5)加入1/10體積的3M/L醋酸鈉(pH5. 2)和2. 5體積經(jīng)預(yù)冷的 無水乙醇，輕輕混勻，放入_20°C冰箱中放置2h以上，過夜效果更好；(6) 12000rpm，4°C下離 心IOmin以沉淀DNA ； (7)沉淀物用75%的乙醇洗滌2次，待乙醇揮發(fā)完全后，將沉淀的DNA 溶解于 20 μ 1 TEdOmM Tris-HCl ρΗ8· 0，ImM EDTA)中；(7)任選地，取 1 μ 1 在 1. 0% 的瓊 脂糖凝膠上粗略檢測(cè)所提DNA的量和純度。然后，按如下PCR反應(yīng)體系和條件，使用本發(fā)明 的引物對(duì)對(duì)線蟲樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系25μ L，包括5ng 線蟲 DNA，引物各 0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs，lXPCR 緩 沖液(包括2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94 °C 3min ；32 個(gè)循環(huán)的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。將5 μ L PCR產(chǎn)物用1. O % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色 后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖1所示，其中各泳道分別為M:DNA標(biāo)記DL 2000 (Takara Biotech,大連，中國(guó))(其條帶大小由上至下分別對(duì)應(yīng)為2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp 和 IOObp) ；1 水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi) ；2 菊花滑刃線蟲 (A. ritzemabosi) ；3 福建滑刃線蟲(A. fujianensis) ；4 滑刃線蟲種群 1 (A. sp. 1)； 5 滑刃線蟲種群2 (A. sp. 2) ;6 擬滑刃線蟲(Paraphelenchidea sp. ) ;7 真滑刃線 蟲(Apelenchus sp.) ；8:阿蘇里傘滑刃線蟲(Bursaphelenchus athuri) ；9:松材線蟲(B.xylophilus)。從圖中可看出，只在水稻干尖線蟲上擴(kuò)增出特異性條帶(對(duì)應(yīng)于第1泳道)，經(jīng)分析為312bp的產(chǎn)物。因此，可看出本發(fā)明的方法使用的引物對(duì)具有高度的特異性，從而保證了檢測(cè)結(jié) 果的高準(zhǔn)確性。2. 靈敏度實(shí)驗(yàn)－對(duì)單條水稻干尖線蟲的擴(kuò)增
實(shí)驗(yàn)步驟在解剖鏡下分離出的單條成蟲或幼蟲，將其加入含有8 μ LffLB溶液 (2. 5mmol/L 二硫蘇糖醇，1. 125%吐溫 20,0. 25g/L 明膠，125mmol/L 氯化鉀，3. 75mmol/L 氯 化鎂，25mmol/L Tris-Cl (pH 8.3))的 PCR 管中，然后-70°C放置 45min ;95°C放置 15min ； 65°C放置2min ；再加入20mg/mL的蛋白酶K 1 μ L，65°C處理Ih ；95°C處理15min后，作為單 條線蟲DNA模板直接用于PCR擴(kuò)增。PCT反應(yīng)體系和條件如下PCR反應(yīng)體系25μ L，包括2μ L單條線蟲裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR緩沖液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94 °C 3min ；32 個(gè)循環(huán)的 94 °C 40s，57°C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16°C 保存；將5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 0 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色 后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖2所示，其中泳道M :DNA標(biāo)記DL 2000 (TakaraBiotech，大連， 中國(guó))；泳道1-12為單條水稻干尖線蟲裂解DNA擴(kuò)增；泳道13 清水對(duì)照。從圖中可看出， 實(shí)驗(yàn)泳道都擴(kuò)增出特異性條帶，經(jīng)分析為312bp的產(chǎn)物，而對(duì)照組則沒有特異性條帶。因此，本發(fā)明的方法靈敏度非常高，即使單條水稻干尖幼蟲亦能準(zhǔn)確檢測(cè)出，大大 方便了實(shí)際應(yīng)用。3.可靠性實(shí)驗(yàn)_對(duì)水稻干尖線蟲不同種群的單條線蟲的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)采集于福建、浙江和云南的水稻上的水稻干尖線蟲的3個(gè)種群?jiǎn)螚l 線蟲，按上述靈敏度實(shí)驗(yàn)中的方法裂解DNA，以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件如下PCR反應(yīng)體系25μ L，包括2μ L單條線蟲裂解DNA，引物各0. 2μΜ，0. 2μΜ dNTPs, IXPCR緩沖液(含2mM MgCl2)和0. 65U DNA聚合酶。PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 94 °C 3min ；35 個(gè)循環(huán)的 94 °C 40s, 57 °C 40s, 72 °C 40s ； 72 °C 7min 延伸；16 °C 保存。將5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 0 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色 后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如圖3所示，其中泳道M :DNA標(biāo)記DL2000 (TakaraBiotech，大連， 中國(guó))；泳道1-2 福建水稻干尖線蟲裂解DNA擴(kuò)增；泳道3-4 浙江水稻干尖線蟲裂解DNA 擴(kuò)增；泳道5 云南水稻干尖線蟲裂解DNA擴(kuò)增；泳道6 清水對(duì)照。從圖中可看出，實(shí)驗(yàn)泳 道均顯示出特異性條帶，經(jīng)分析對(duì)應(yīng)大小為312bp，而對(duì)照組則未顯示。因此，本發(fā)明的方法具有很高的可靠性，對(duì)于不同地區(qū)的水稻干尖線蟲均能非常 靈敏地檢測(cè)出。因而，本發(fā)明的方法適用范圍廣，不受局部地區(qū)的限制。另一方面，為更加方便地實(shí)施本發(fā)明的方法，本發(fā)明還提供一種用于診斷水稻干 尖線蟲病的試劑盒，其包含如序列表中SEQ ID NO 1和SEQID NO 2所提供的引物對(duì)、PCR 反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、dNTP和DNA提取液。
利用本發(fā)明提供的方法或試劑盒檢測(cè)或鑒定水稻干尖線蟲，具有很高的可靠性和 靈敏度，且操作方便，不依賴操作人員的經(jīng)驗(yàn)，準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，可滿足農(nóng)作物種植前和 植物檢疫過程中對(duì)水稻干尖線蟲快速可靠的檢測(cè)和鑒定需要。雖然本發(fā)明只對(duì)水稻上的水稻干尖線蟲的檢測(cè)作出介紹，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員在 閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，將容易地意識(shí)到，本發(fā)明的方法和試劑盒當(dāng)然也可適用于任何感染 了水稻干尖線蟲的植株或種子(例如，草莓等)的檢測(cè)、鑒別或診斷。序列表<110> 崔汝強(qiáng)<120>水稻干尖線蟲的檢測(cè)方法及診斷試劑盒<160>2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgatgaaga acgcagtgaa tt<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2agatcaaaag ccaatcgaat cat
權(quán)利要求
一種檢測(cè)水稻干尖線蟲的方法，其包括(a)從可疑植物材料或土樣中分離出待檢測(cè)線蟲，提取DNA；(b)以步驟(a)中獲得的DNA為模板，使用SEQ ID NO1和SEQID NO2的引物對(duì)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)檢測(cè)步驟(b)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷水稻干尖線蟲的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述可疑植物材料或土樣中存在大量線 蟲時(shí)，采用酚氯仿提取法提取DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述可疑植物材料或土樣只存在單條線 蟲時(shí)，步驟(a)中所述的提取包括以下步驟(1)將單條線蟲加入含有WLB溶液的管中；(2)于_70°C 放置 30-60min ；95°C 放置 15_20min ；55-65 °C 放置 2min ；(3)再加入蛋白酶K，55-65°C處理30min-2h；95°C處理15_20min，以獲得作為單條線蟲 DNA模板的產(chǎn)物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料為水稻植株或種子。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物材料是草莓、玉米、甘薯、大豆、蔬 菜、蘭花、菊花或大麗花的植株。
6 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述檢測(cè)步驟(b)中獲得的擴(kuò)增 產(chǎn)物的方法為電泳檢測(cè)。
7.一種用于診斷水稻干尖線蟲病的試劑盒，其包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引 物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻干尖線蟲的檢測(cè)方法，該方法使用序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2作為引物對(duì)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過電泳分析可得知是否得到特異性片段，從而檢測(cè)或鑒定出是否為水稻干尖線蟲。本發(fā)明還提供了一種診斷水稻干尖線蟲病的試劑盒，該試劑盒包含上述引物對(duì)。本發(fā)明的方法和試劑盒具有很高的可靠性和靈敏度，且操作方便，不依賴操作人員的經(jīng)驗(yàn)，準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，可滿足農(nóng)作物種植前和植物檢疫過程中對(duì)水稻干尖線蟲快速可靠的檢測(cè)和鑒定需要。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101812501SQ20091003729
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者卓侃, 孫曉棠, 崔汝強(qiáng), 廖金鈴, 王衛(wèi)芳, 胡學(xué)難, 郭權(quán), 鐘國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:崔汝強(qiáng)