一種在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-1的方法

專利名稱：：一種在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種表達(dá)人成骨蛋白-1的方法，尤其涉及一種在花生種子中利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人成骨蛋白-1的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：人成骨蛋白-1(HumanOsteogenicProtein1，hOP_l)也被稱為骨形成發(fā)生蛋白7(BoneMorphogeneticProtein7，BMP-7)對眼發(fā)育、腎功能調(diào)節(jié)和后腦發(fā)育等具有重要作用，在臨床上有廣泛的應(yīng)用。但由于人骨來源有限，而且從骨組織中提取hOP-1程序復(fù)雜，難以得到純品，經(jīng)過繁瑣程序分離純化的hOP-1誘骨活性往往不高，嚴(yán)重限制了臨床應(yīng)用[1，2，3]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，異源表達(dá)成骨蛋白成為可能。目前hOP-1的重組表達(dá)方式主要有兩種(1)在哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)；(2)原核表達(dá)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中hOP-1的表達(dá)水平低，培養(yǎng)條件要求高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。原核表達(dá)系統(tǒng)則不能對所表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行有效的修飾，得到的蛋白往往活性不高或不具活性[4，5]。相對于微生物和動(dòng)物生物反應(yīng)器，植物反應(yīng)器更具有明顯的優(yōu)勢成本低廉，易于大規(guī)模生產(chǎn)，無病原污染，有利于重組蛋白的翻譯后加工及生物活性的維持。但是植物表達(dá)體系蛋白表達(dá)量低，下游加工純化困難[6]。近年來，利用植物特別是利用植物的種子作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源重組蛋白備受關(guān)注，因?yàn)樵诜N子成熟過程中，大約有95%的水分會(huì)主動(dòng)失去，細(xì)胞中的水解酶活性因此大大降低，重組蛋白可以在種子內(nèi)長期、穩(wěn)定地貯存而不會(huì)被降解[7]。研究表明，油體蛋白(oleosin)具有親水和親脂雙重特性，在植物種子中以膜嵌入方式覆蓋在油體表面，油體蛋白在油料作物種子中高水平表達(dá)。油體蛋白分子除中部疏水區(qū)域高度保守外，N端和C端的序列差異都很大。當(dāng)外源小分子量蛋白插入到油體蛋白的N端或C端后，不會(huì)影響到油體蛋白在植物油體上的定位以及其表達(dá)，且形成的重組融合蛋白非常穩(wěn)定。由于油體蛋白定位在油體表面，通過漂浮離心很容易將它與其他細(xì)胞成分包括種子中其他儲(chǔ)藏蛋白分開。在油料作物種子中利用油體蛋白做載體生產(chǎn)藥用及其它有用物質(zhì)，具有獨(dú)特的優(yōu)越性。Xu等克隆了大豆的24kDa油體蛋白的基因和啟動(dòng)子，構(gòu)建了由油體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的"油體蛋白-腸肽酶-水蛭素"植物表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達(dá)了重組蛋白，通過腸肽酶切割，通過聚丙烯酰胺電泳分離得到了水蛭素[8]。Nykiforuk等在擬南芥中利用油體-油體蛋白這一系統(tǒng)生產(chǎn)人胰島素，種子中胰島素累積到相當(dāng)高的水平(0.139&種子總蛋白)。在大腸桿菌中表達(dá)納豆激酶(絲氨酸蛋白酶)時(shí)往往形成不溶性沉淀，導(dǎo)致沒有酶活[9]。Chiang等通過一個(gè)內(nèi)含肽(intein)片斷將納豆激酶連接接到油體蛋白的C端，構(gòu)建重組蛋白，通過溫度誘導(dǎo)內(nèi)含肽，釋放得到可溶性的具有生物活性的納豆激酶[IO]。Chen等用三酰甘油酯、磷脂和油體蛋白合成了人工油體(A0B)，只有天然油體的1/10，通過一系列生理試驗(yàn)證明AOB保留了天然油體的特性而且非常穩(wěn)定[ll]。Peng等利用人工油體優(yōu)化了油體-油體蛋白表達(dá)體系，在大腸桿菌中構(gòu)建了"油體蛋白-Xa-GFP"表達(dá)載體，通過離心，油體蛋白-GFP全部富集到人工油體的表面，通過蛋白酶Xa將GFP從嵌入油體的油體蛋白中分離，再一次離心，收集上清液得到高濃度的GFP[12]?；ㄉ蝗藗冏u(yù)為"植物肉"，主要原因是花生種子的高含油量(45-55%)和高的蛋白含量(25-30%)，另外，花生中的蛋白質(zhì)極易被人體消化吸收，吸收率在90%以上。花生在中國、印度、尼日利亞、美國等都有廣闊的種植面積，因此其作為植物反應(yīng)器有廣發(fā)的基礎(chǔ)，然而在可檢索的現(xiàn)有技術(shù)中，利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-1的方法還未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種在花生種子中利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人成骨蛋白-1的方法，實(shí)現(xiàn)人成骨蛋白以融合的方式與轉(zhuǎn)基因花生油體蛋白一起表達(dá)并高水平積累。本發(fā)明所述在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-1的方法，步驟包括(1)克隆包含特異啟動(dòng)子的大豆全長油體蛋白基因soy-o7eosi/7;(2)人成骨蛋白成熟肽cDNA基因細(xì)p7的獲得；(3)構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-bmp7;(4)植株轉(zhuǎn)化；(5)轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得;(6)WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中人成骨蛋白的表達(dá)；(7)從轉(zhuǎn)基因花生種子中大規(guī)模分離并回收人成骨蛋白；其特征是所述克隆包含特異啟動(dòng)子的大豆全長油體蛋白基因soy-o7eosi/7的方法是以大豆基因組麗A為模板，以primer1:5'CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG3';primer2:5'CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTGTTGCTGTCA3'為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序是94°C5min;再94°C50s，54°C45s，72°C2min，30循環(huán)；72°C7min;所述人成骨蛋白成熟肽cDNA基因Zw7獲得的方法是以人軟骨細(xì)胞的mRNA為模板，以primer35，CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG3';primer4:5，GAAAGCTTGATCCTTACATGTCGCAGCCACAGGC3'為引物進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序是45°Clh;再45。C5min，51°C1min，72°C1min，30循環(huán)；72。C7min;所述植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-bmp7的構(gòu)建方法是通過一個(gè)腸肽酶位點(diǎn)將Zwp7基因連接到^^-WeowV7基因的3'端，再通過7Vco/和歷/^///特異位點(diǎn)一起構(gòu)建入植物表達(dá)載體pCAMBIA1302中，獲得pCAMBIA1302-bmp7植物表達(dá)載體；所述的植株轉(zhuǎn)化是將帶有目的基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-bmp7通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化花生植株；所述花生種子獲得的方法是收獲第二代的轉(zhuǎn)基因花生純合體的花生種子；所述WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中人成骨蛋白的表達(dá)的方法是用人成骨蛋白抗體作為一抗，辣根過氧化物酶作為二抗的免疫印跡雜交檢測；所述從轉(zhuǎn)基因花生種子中大規(guī)模分離并回收人成骨蛋白的方法是指將獲得的花生種子粉碎，液體抽提，離心處理，回收上層油相，得到融合蛋白；融合蛋白經(jīng)酶切后離心即獲得人成骨蛋白。上述植物表達(dá)載體中大豆的油體蛋白基因和啟動(dòng)子、重組蛋白的編碼基因的連接順序?yàn)?大豆油體蛋白啟動(dòng)子+大豆油體蛋白基因+腸肽酶基因+人成骨蛋白基因+終止子"。人成骨蛋白具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，目前直接從骨組織中提取人成骨蛋白程序復(fù)雜且難以得到純品，更何況人骨來源也非常有限；利用微生物生物反應(yīng)器不能對重組人成骨蛋白正確的糖基化修飾，重組蛋白往往沒有活性或者活性很低，利用動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器表達(dá)人成骨蛋白表達(dá)量低、成本高，這就限制了臨床應(yīng)用，本發(fā)明提供的在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白的方法解決了這一難題，實(shí)現(xiàn)了人成骨蛋白以融合的方式與轉(zhuǎn)基因花生油體蛋白一起表達(dá)并高水平積累。本發(fā)明以花生為受體植物，花生種子作為表達(dá)蛋白的載體，采用大豆油體蛋白基因和啟動(dòng)子的克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建，花生的遺傳轉(zhuǎn)化，人成骨蛋白基因的表達(dá)確認(rèn)，重組蛋白的分離純化和回收的方法，成功實(shí)現(xiàn)了利用花生種子作為一種新型的生物反應(yīng)器在轉(zhuǎn)基因花生中高效、安全地表達(dá)人成骨蛋白，進(jìn)而純化回收蛋白。本發(fā)明方法具有以下優(yōu)點(diǎn)-(1)花生含油量高，油體蛋白占花生種子總蛋白的比重在10%以上，人成骨蛋白以融合的方式與轉(zhuǎn)基因花生油體蛋白一起表達(dá)并高水平積累。(2)人成骨蛋白和花生油體蛋白組成的重組蛋白非常的穩(wěn)定，可以在花生種子中長期、穩(wěn)定的儲(chǔ)存，而且方便運(yùn)輸。(3)花生栽培面積廣、產(chǎn)量高、生產(chǎn)容易，而且分離、純化人成骨蛋白的方法簡單、易操作、成本低。在分離人成骨蛋白后花生油的組分和性質(zhì)不變，增加了花生產(chǎn)品的附加值。圖1載體構(gòu)建示意圖。圖2重組蛋白純化示意圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限于此。實(shí)施例l包含啟動(dòng)子的大豆油體蛋白基因的克隆根據(jù)NCBI中大豆油體蛋白的啟動(dòng)子的序列和油體蛋白基因序列(基因登錄號(hào)GMU09118)，設(shè)計(jì)含有餘oT酶切位點(diǎn)(CCATGG)的正向引物序列primerl:5'CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG3';根據(jù)大豆油體蛋白基因的開放閱讀框序列，去掉中止密碼子，設(shè)計(jì)帶有&0>/酶切位點(diǎn)(GAATTC)和腸肽酶識(shí)別位點(diǎn)(TTATCATCATCATC)的反向引物primer2:5'CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTGTTGCTGTCAT3，。提取大豆(中黃13)的基因組DNA，方法如下(1)取100mg的大豆幼嫩葉片，用液氮研磨成粉，或直接用或貯存于-80'C;(2)在65。C水浴中預(yù)熱CTAB提取液(0.2MTris-HC1，pH9.0;0.4MLiCl;25mMEDTA;1%SDS)。(3)估算樣品組織的體積，每個(gè)樣品中加1倍體積預(yù)熱的CTAB提取液，在65°C溫浴10-30min;(4)加l倍體積的苯酚/氯仿/異戊醇(12:12:1)，混勻；(5)13000rpm離心2min;(6)將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中；(7)用氯仿/異戊醇(24:l)重復(fù)4-6步；(8)加O.7倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10min;(9)以最大轉(zhuǎn)速室溫離心15min;(10)倒掉上清，用0.2-0.5mL冷的75%乙醇洗沉淀2-3次；(11)干燥沉淀后，用50uL水或TE溶解DNA，置于-20。C備用。(12)吸取5uL溶解的DNA，加入45uL水，混勻。大豆油體蛋白啟動(dòng)子和基因的PCR擴(kuò)增以(primerl，primer2)為引物，大豆基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到大豆油體蛋白的啟動(dòng)子和全長基因。反應(yīng)程序如下模板DNA1yL，2xpfumix10.0nL，primerl(10um)0.5uL，primer2(10um)0.5uL，ddH208,0uL。在PCR儀(TaKaRaTP650)上設(shè)置94。C5min，隨后94°C50s，54°C45s，72°C2min，共30個(gè)循環(huán)后72。C7min結(jié)束反應(yīng)。取5uLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，挑取陽性克隆測序(見序列表l)。實(shí)施例2人成骨蛋白成熟肽cDNA基因b卿7的獲得根據(jù)NCBI中人成骨蛋白-l基因成熟肽的序列(基因登錄號(hào)NMJX)1719)設(shè)計(jì)含有fcoW/位點(diǎn)的引物primer3:5，CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG3'和帶有幼Vo7i7位點(diǎn)的primer4:5，GAAAGCTTGATCCTTACATGTCGCAGCCACAGGC3,。收集lxl()6個(gè)軟骨細(xì)胞，用Trizol(Takara)提取m腿，根據(jù)One-St印RT-PCR試劑盒(Clonetech)的標(biāo)準(zhǔn)步驟，進(jìn)行如下PCR反應(yīng)45。C溫育1h，(45。C變性5min，51。C退火1min，72。C延伸1min)30個(gè)循環(huán)，72。C延長7分鐘。取5yLPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，挑取陽性克隆測序(見序列表4)。實(shí)施例3植物表達(dá)載體的構(gòu)建植物表達(dá)載體的構(gòu)建過程如圖1所示(1)油體蛋白基因和人成骨蛋白基因(oleo-bmp7)的連接PCR產(chǎn)物酶切，體系如下PCRproduct10.0uL，10xBufferH3.0uL,￡c。y/1.0uL,ddH2016.0uL。37'C保溫4h，瓊脂糖電泳，分別回收油體蛋白和成骨蛋白基因片斷。用T4DNA連接酶將油體蛋白基因和人成骨蛋白基因進(jìn)行連接10xT4DNAligasebuffer1.0iiL，Oleosin4.0ixL，Bmp74.0UL，T4DNAligase1.0liL。16°C連接過夜，取連接產(chǎn)物l.OuLPCR擴(kuò)增，體系如下2xpfumix10.0u1，primerl(10um)0.5ul，priraer4(10um)0.5ul，ddH208.0u1。在PCR儀(TaKaRaTP650)上設(shè)置94。C5min，隨后94°C1min，58°C1min，72°C3min，共30個(gè)循環(huán)后72。C7min結(jié)束反應(yīng)。取5wlPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，切膠回收1.8kb左右的目的帶。(2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建將質(zhì)粒pCAMBIA1302和上述回收的PCR產(chǎn)物同時(shí)用Afco/和歷/^/J/雙酶切，分別回收載體序列和oleo-bmp7序列，用T4DNA連接酶將兩者進(jìn)行連接10xT4DNAligasebuffer1.0u1，oleo-bmp76.0u1，pCAMBIA13022.0y1，T4■ligase1.0u1，16。C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。感受態(tài)細(xì)胞的制備用無菌接種環(huán)挑取-70'C甘油保存的￡co7iDH5a,通過劃線稀釋的方法經(jīng)37'C培養(yǎng)16-20h后在平板中得到DH5a的單菌落;挑一單菌落于5ml的LB液體培養(yǎng)基，180rpm振蕩培養(yǎng)12h;取1mlDH5aLB菌液于100ml的LB液體培養(yǎng)基，180rpni振蕩培養(yǎng)到0D值0.4;冰上放置15分鐘，無菌條件下倒入50mlBeckman離心管中，4。C，3500卬m離心10min，棄上清；沉淀用30ml冰預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液重懸；4°C，3500rpm離心10min，小心倒出上清液；沉淀重懸于2ml冰預(yù)冷的含15%甘油0.1MCaC12溶液；將這些感受態(tài)細(xì)胞按每份100y1分裝。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化將上述10iU的連接液加入lOOul感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰上30min，42。C熱激90s，冰上2分鐘，加入600u1液體LB(NaCl10g/L,Tryptone10g/L,Yeastpowder5g/L)，37°C120rpm振蕩培養(yǎng)1.5h，5000rpm離心1min，將大腸桿菌均勻涂抹到含有50ug/ml的卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上(NaCl10g/L，Tryptone10g/L，Yeastpowder5g/L'Agarpowder15g/L)，37。C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落到4mL液體LB中，37t搖菌8-10h，提取質(zhì)粒DNA(Omega)，分別用(Afco/、歷'"oOT)和(yVfco/、雙酶切驗(yàn)證，對陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證。(3)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化制備農(nóng)桿菌C58C1的感受態(tài)細(xì)胞挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落到5mlLB培養(yǎng)基(含利福平50!xg/ml)搖菌過夜；然后取lml接種到50ml液體LB培養(yǎng)基中(含利福平50ug/ml)，28。C擴(kuò)大培養(yǎng)，220rpm震蕩培養(yǎng)至OD咖-O.5;冰浴10min，4。C4500rpm，離心10min;菌體用10ml預(yù)冷的0.1MCaCl2重懸，4°C4500rpm再次離心10min;沉淀加入1ml20niMCaCl2懸浮液(60%甘油，0.1MCaCl2)，再加入10%的甘油，80u1分裝，液氮速凍保存。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌取上述測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒2"1加入到80"l農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，放到冰上45min，37。C水浴3min，28°C120rpm振蕩培養(yǎng)1.5h，5000rpm離心lmin，將菌體均勻涂抹到固體LB培養(yǎng)基上(含利福平50Pg/ml，卡那霉素50yg/ml)，28。C培養(yǎng)2d。挑取單菌落到4ml液體LB中，28。C搖菌過夜。取1Ul菌液做模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，分別三對引物引物(primerl，primer2)、(primer3、primer4)、(primerl，primer4)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR程序同實(shí)施例1和實(shí)施例2。實(shí)施例4花生的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得(1)花生胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化外質(zhì)體的制備成熟花生種子去外殼，用70%乙醇浸種1min，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞(w/v)處理15-25min,然后用無菌水沖洗4-6遍，滅菌期間不斷搖動(dòng)種子，以保證種子表面滅菌徹底。剝?nèi)シN皮，將胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基(蔗糖30g/1，瓊脂0.7%，MS大量元素，MS微量元素)上，胚軸深入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4d左右取胚軸作為外植體。培養(yǎng)溫度25土rC，光照強(qiáng)度3500lux?；ㄉ咻S外植體的感染新鮮培養(yǎng)的農(nóng)桿菌LBA4404或EHA105，5000g/min離心收集菌體，重懸于液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，農(nóng)桿菌感染的最佳濃度為OD6。。=0.5-0.8。手術(shù)刀切取萌動(dòng)4d的花生胚軸，在培養(yǎng)的農(nóng)桿菌(OD6。。=0.5-0.8)中浸泡感染25-30分鐘，取出外植體在濾紙上吸去多余的菌液，然后接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(MS+蔗糖30g/1，瓊脂O.7%，6-BA10mg/l，NAA0.8mg/1)上，暗處共培養(yǎng)2d。選擇培養(yǎng)基及轉(zhuǎn)化植株再生共培養(yǎng)后，將外植體接到含有500mg/1羧芐青霉素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7d,再接到含有IOmg/1潮霉素和500mg/1羧芐青霉素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)接到含有25mg/1潮霉素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)一步篩選，大約3-4周后出現(xiàn)叢生芽點(diǎn)，以后每2周更換一次新鮮培養(yǎng)基。待叢生芽長到l-2cm時(shí)將其切下，移至分化伸長培養(yǎng)基(MS+蔗糖30g/L，瓊脂O.7%,GA34mg/l，6-BA2mg/1)上，潮霉素濃度的濃度降至IOmg/l，，當(dāng)小苗長至3-5cm時(shí)，將其移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+蔗糖30g/L，瓊脂0.7%，NM2.0mg/1)中，煉苗、轉(zhuǎn)基因植株的移栽。(2)花生子葉的遺傳轉(zhuǎn)化外質(zhì)體的制備成熟花生種子去外殼，先用70%酒精沖洗1min進(jìn)行表面滅菌，再用0.1%升汞(w/v)處理15-25min，然后用無菌水沖洗4-6遍，最后在無菌水中浸泡2h。剝種皮，獲得子葉外植體?；ㄉ尤~外植體的感染新鮮培養(yǎng)的農(nóng)桿菌，5000rpm下離心10min，吸取5ml懸浮液重懸在30ml的1/2MS培養(yǎng)基(含有3%蔗糖，1:6稀釋)中，用于共培養(yǎng)。將細(xì)菌懸浮液鋪在滅菌培養(yǎng)皿上，厚約2-3mra。取花生的新鮮被切子葉外植體，將切邊浸入到細(xì)菌懸浮液中10-20min，取出外植體在濾紙上吸去多余的菌液，立即埋植到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+蔗糖30g/L，瓊脂0.7%，6-BA20uM，2，4-D10uM)中，其中切口深入培養(yǎng)基中。子葉和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)72h后再移至含有頭孢氨霉素(250mg/L)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，同樣要將切口埋于培養(yǎng)基中。種植密度為每個(gè)培養(yǎng)皿5個(gè)外植體，石蠟?zāi)し饪冢诶錈晒鉄粝?，lOOEs—、—2光強(qiáng)，25士rC，16h/8h光照暗周期培養(yǎng)。植株再生和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株的選擇經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的子葉外植體移植在含有250mg/L頭孢氨霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，兩星期后，部分外植體出現(xiàn)叢生芽點(diǎn)，而且芽點(diǎn)繼續(xù)形成。將出現(xiàn)芽點(diǎn)的外植體轉(zhuǎn)移至含250mg/L頭孢氨霉素和IOmg/L潮霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，一周后轉(zhuǎn)接到含有25mg/L潮霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，兩周之后將長有叢生芽部分的外植體切下，轉(zhuǎn)移至含有250mg/L頭孢氨霉素和10mg/L潮霉素的的芽伸長培養(yǎng)基(MS+蔗糖30g/L，瓊脂0.7%，6-BA2ixM)上，進(jìn)行2-3次繼代培養(yǎng)，每個(gè)次培養(yǎng)時(shí)間約為4周。將伸長的芽(3-4cm)切下在不含任何抗生素的生根培養(yǎng)基(1/2MS+蔗糖30g/L，瓊脂0.7%，NAA5ixM)上誘導(dǎo)生根，兩周即可誘導(dǎo)出不定根。經(jīng)煉苗后，將轉(zhuǎn)基因植株的移栽到土壤中。(3)轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得收獲花生種子，種植并收獲第二代種子，提取DNA進(jìn)行PCR檢測和Southern雜交，驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株，獲得轉(zhuǎn)基因花生種子。實(shí)施例5WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中人成骨蛋白的表達(dá)從轉(zhuǎn)基因花生種子中提取重組蛋白.(1)取O.5g干種子于8ml提取緩沖液(蔗糖0.6M，KC110mM，MgCl2lmM，Tris-Cl0.15MpH7.5)中，勻漿。(2)12000rpm離心20min，取油相。-(3)加入提取緩沖液重懸混勻，12000rpm離心20min，收集油相。(4)加入5ml漂浮緩沖液(蔗糖0.4M，KC110mM，MgCl21mM，Tris-Cl0.15MpH7.5)重懸，12000rpm離心20min，收集油相。(5)加入NaHC03冰浴30min，12000rpm離心20min，收集油相。(6)用過量丙酮在0"C抽提3次，去除三酰甘油吹干沉淀的蛋白，然后溶于適量無菌水中。WesternBlot雜交(1)將提取的重組蛋白50"g通過12y。的SDS-PAGE膠電泳分離。(2)電泳結(jié)束后將膠切割成合適的大小，用轉(zhuǎn)膜液平衡3次，每次5分鐘。(3)將硝酸纖維素膜用蒸餾水潤洗，用電轉(zhuǎn)方法將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到膜上。(4)轉(zhuǎn)后將膜放入染色液中50s，在50%的甲醇中脫色至背景清晰，然后用雙蒸水清洗。(5)用O.OlMPBS(NaCl8.0g，KC10.2g，Na2HP04L44g，KH2P040.24g加H20定容至1000ml)洗膜3次，每次15min,然后用3%明膠浸泡洗3h，封閉非特異位點(diǎn)的。(6)將膜取出，用O.01MPBS洗2次，每次IOmin。(7)加入用PBS稀釋1000倍的一抗(Monoclonalanti-humanBMP7antibody),室溫結(jié)合2h，陰性對照用1《的BSA。(8)棄一抗和BSA，用O.OlM的PBS洗膜4次，每次5min。(9)加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(用PBS稀釋2000倍)，室溫輕搖2h。(10)棄二抗，用PBS洗膜4次，每次5min。(11)加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。實(shí)施例6從轉(zhuǎn)基因花生種子中大規(guī)模分離并回收人成骨蛋白人成骨蛋白分離并回收如圖2所示，將轉(zhuǎn)基因花生種子勻漿、壓榨；離心后去掉沉淀(種子纖維等)，回收上層的油相，清洗后、離心再次上層的油相；加入腸肽酶進(jìn)行酶消化反應(yīng)，離心去掉上次的油相回收水相；純化得到人成骨蛋白。參考文獻(xiàn)DesmyterS，GoubauY,BenahmedN，deWeverA，VerdonkR.Theroleofbonemorphogeneticprotein-7(OsteogenicProtein-l)inthetreatmentoftibialfracturenon_unions.AnoverviewoftheuseinBelgium.Acta0rthopBelg.2008Aug;74(4):534-7.ReddiAH.Roleofmorphogeneticproteinsinskeletaltissueengineeringandregeneration.NatBiotechnol.1998Mar;16(3):247-52.[3]MusiatK,ForrmlczykK，ZwoliiiskaD.Osteopontin(0PN)，PDGF-BB(platelet-derivedgrowthfactor)andBMP-7(bonemorphogeneticprotein)asmarkersofatherogenesisinchildrenwithchronickidneydisease(CKD)treatedconservatively--preliminaryresults.PolMerkurLekarski.2008;24Suppl4:25-7.熊紹虎,余磊，譚海燕，黃濤,王朝陽,劉大庸,鐘世鎮(zhèn),重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在大腸桿菌中的表達(dá)及純化.<〈第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)〉〉2002年第22巻第05期(page)，，韓金祥,王世立,梁浩,重組人成骨蛋白-1在大腸桿菌中的高效表達(dá)及復(fù)性.〈<中國藥學(xué)雜志>〉2005年第40巻第13期[6]曲勅，李校堃，于雅琴，利用油體表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源重組蛋白，中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2007，27(8):111115.徐妙云，劉德虎,李剛強(qiáng).簡論植物油體蛋白作為載體生產(chǎn)外源.重組蛋白的研究.高技術(shù)通訊，2004，14(3):106-110.XuMY,LiuDH,LiGQ.Cloningofsoybean24kDaoleosingeneanditstransientexpressionasacarrierforforeignprotein.AgriculturalSciencesinChina,2004,3(5):321-329.NykiforukCL，BootheJG,MurrayEW，etal.TransgenicexpressionandrecoveryofbiologicallyactiverecombinanthumaninsulinfromArabidopsisthalianaseeds.PlantBiotechnolJ.2006Jan;4(1):77-85.ChiangCJ，ChenHC，ChaoYPeta^.EfficientsystemofartificialoilbodiesforfunctionalexpressionandpurificationofrecombinantnattokinaseinEscherichiacoli.JAgricFoodChem.2005Jun15:53(12):4799—80.[11]ChenMC，ChyanCL，LeeTT，etal.Constitutionofstableartificialoilbodieswithtriacylglycerol,phospholipid,andcaleosin.J"AgricFoodChem.2004Jun16:52(12):3982-3987.PengCC，ChenJC,ShyuDJ,etal,AsystemforpurificationofrecombinantproteinsinEscherichiacoliviaartificialoilbodiesconstitutedwiththeiroleosin-fusedpolypeptides.JBiotechnol.2004Jul1;111(1):51-7.序列表〈110〉山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心<120〉一種在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-l的方法<141〉2009-6-6〈160>4<210〉1〈211〉1234<212>腿〈213〉大豆油體蛋白基因及其啟動(dòng)子核苷酸序列<400>1tgtttatctttcttgcttttctgaacaatttatctactatgtaaatatatt3tC犯tgtt60taatttgcacat^attttcattttatttttactttacaa120tatatatgcaaaaaaa111aacggattacaaactaatttcattsaatgct180aatgcagattttgtg犯gtaaaactccaattatgatga犯aata_ccacc33caccacctg240cgaaactgta^tcccaactgtcctt朋t犯aaatgttaaaaagtatattattctcatttgt300ctgtcataatttatgtaccccactttaatttttctgatgtactaaaccgagggca咖tg360aaacctgttcctcatgcaaagcccctactcaccatgtatcatgtacgtgt420caactccacttttgctatataacaacacccccgtcacactctccctctct■ccactaacaattccttcacttgcagcactgttgcatcatcatcttcattgcaaaacccta540aacttcaccttcaaccatgaaccaccacacagtgtccaagtcc3cacei2ic6003acax:a<ccgctacgaagctggcgtcgtcccacccggagcccgtttcgaaccgccgcgtta660tg鄉(xiāng)ccggcgtcaaagcgccctccatttaccattccgagagaggtccaacgacttccca720ggtcctcgccgtcctcgccggcctcccggtcggtggcatcctgctcctcctggcgggatt780gaccctgggcaggaaccctcaccggactggcagttgccacgccgctcttcgtcctcttca840gcccggtgctggttccagccacggtcgcatcggcctggccgtggccgggttcctgacgtc■gggggccttcgggctcscggcgctgtcttcdttctcctggatcctgaactacatccggga960gacccagccagcctcgg卿acctcgccgccgccgcgaagcatcacctcgccgaggcggc1020ggsgtscgtggggc卿卿cg犯gg犯gtggggc卿agacc卿g鄉(xiāng)ttgggcagga1080tattcagagca￡LggC￡LC￡Lggalacaagggaggcagctgcaagggatgcaagggaggcgigc1140tgcaagggatg認(rèn)ggg犯gctgctgcaagggatgc犯aggtggaggc犯gggEltgt肪3.1200g3gaac犯cagtgacagcaac犯ccgc犯cCgC81234〈210>2〈211>678<212>DNA〈213〉去掉終止子的大豆油體蛋白基因〈400>2atgaccacacaagtaccaccacacagtgtccaagtccacacaacaacacaccgctacgaa60gctggcgtcgtcccacccggagcccgtttcgaaccgccgcgttatgaagccggcgtcaaa120gcgccctccatttaccattccg鄉(xiāng)g鄉(xiāng)tccaacgacttcccaggtcctcgccgtcctc180gccggcctcccggtcggtggcatcctgctcctcctggcgggattgaccctgggc鄉(xiāng)aac240cctcaccggactggcagttgccacgccgctcttcgtcctcttcagcccggtgctggttcc300￡LgCC￡lCggtCgC3tCggCCtggccgtggccgggttcctgscgtcgggggccttcgggctc360acggcgctgtcttccttctcctggatcctgMCtac3tccgccagcctcg420gsgaacctcgccgccgccgcg33gc3tcacctcgccgaggcggcggagtacgtggggcag480犯gtggggC3g鄉(xiāng)ttgggcg3gC33ggC3540ggg鄉(xiāng)cagctgc鄉(xiāng)ggatgc卿ggaggcagctgcaagggatgc犯gg600g犯gctgctgc已a(bǔ)gggatgc8犯ggtgg3gg認(rèn)ggg3tgtaa3gag犯caacagtgaca660gcaacaaccgC6L3CCgC3678〈210〉3〈211>556〈212>DNA<213〉啟動(dòng)子〈400〉3tgtttatctttcttgcttttCtg33C犯tttatctactatgta犯tata/ttatcaatgtt60t犯tctattttaatttgcacattttatttttactttac犯120tatat￡Ltgcaaaaaaat11ac肌acg3tgcacggattacaaactaatttcattaaatgct180aatgcagattttgtgaagtaaaactccaattatgatgaaaaataccaccaacaccacctg240cg犯actgtatcccaactgt犯tgtt朋aaagtatattattctcatttgt300ctgtcat已a(bǔ)tttatgtaccccactttaMttttctgatgtactaaaccgagggc已a(bǔ)actg360aaacctgttcctcatgcsLaagcccctactcaccatgtatcatgtacgtgt420caactccacttttgctatat朋C33C3CCCccgtcacactctccctctct480ccactaacaattccttcacttgcagcactgttgcatcatcatcttcattgcaaaacccta540aacttcaccttc犯cc556<210〉4<211〉420<212〉腿〈213〉人成骨蛋白-l基因核苷酸序列<400〉4atgaccggcagcaa已c3gcgC3gcca^3ccgctccaagacgcccaagaaccaggaagcc60ctgcggatggccaacgtggcagsgaacagc8gcagcgacc卿ggc鄉(xiāng)cctgteiag￡i3g120cacgagctgt8tgtC3gCttCCg3g3CCtgggctggcaigg3Ctgg3tC￡ltcgcgcctg幼180ggctacgccgcctactactgtgagggggagtgtgccttccctctgaactcctacatgaac240gccaccaaccacgccatcgtgcagacgctggtccacttcatcaacccggaaacggtgccc300aagccctgctgtgcgcccacgcagctcaatgccatctccgtcctctacttcgatgacagc360tccaacgtcatcctgaagaaatacagagacatggtggtccgggcctgtggctgccactag420權(quán)利要求1.一種在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-1的方法，步驟包括(1)克隆包含特異啟動(dòng)子的大豆全長油體蛋白基因soy-oleosin；(2)人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7的獲得；(3)構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-bmp7；(4)植株轉(zhuǎn)化；(5)轉(zhuǎn)基因花生種子的獲得；(6)WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中人成骨蛋白的表達(dá)；(7)從轉(zhuǎn)基因花生種子中大規(guī)模分離并回收人成骨蛋白；其特征是所述克隆包含特異啟動(dòng)子的大豆全長油體蛋白基因soy-oleosin的方法是以大豆基因組DNA為模板，以primer15’CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG3’；primer25’CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTGTTGCTGTCA3’為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序是94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃2min，30循環(huán)；72℃7min；所述人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7獲得的方法是以人軟骨細(xì)胞的mRNA為模板，以primer35’CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG3’；primer45’GAAAGCTTGATCCTTACATGTCGCAGCCACAGGC3’為引物進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序是45℃1h；再45℃5min，51℃1min，72℃1min，30循環(huán)；72℃7min；所述植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-bmp7的構(gòu)建方法是通過一個(gè)腸肽酶位點(diǎn)將bmp7基因連接到soy-oleosin基因的3’端，再通過NcoI和HindIII特異位點(diǎn)一起構(gòu)建入植物表達(dá)載體pCAMBIA1302中，獲得pCAMBIA1302-bmp7植物表達(dá)載體；所述的植株轉(zhuǎn)化是將帶有目的基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-bmp7通過農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化花生植株；所述花生種子獲得的方法是收獲第二代的轉(zhuǎn)基因花生純合體的花生種子；所述WesternBlot檢測轉(zhuǎn)基因花生種子中人成骨蛋白的表達(dá)的方法是用人成骨蛋白抗體作為一抗，辣根過氧化物酶作為二抗的免疫印跡雜交檢測；所述從轉(zhuǎn)基因花生種子中大規(guī)模分離并回收人成骨蛋白的方法是指將獲得的花生種子粉碎，液體抽提，離心處理，回收上層油相，得到融合蛋白；融合蛋白經(jīng)酶切后離心即獲得人成骨蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-1的方法，其特征是所述植物表達(dá)載體中大豆的油體蛋白基因和啟動(dòng)子、重組蛋白的編碼基因的連接順序?yàn)?大豆油體蛋白啟動(dòng)子+大豆油體蛋白基因+腸肽酶基因+人成骨蛋白基因+終止子"。全文摘要本發(fā)明公開了一種在花生種子中表達(dá)人成骨蛋白-1的方法，是利用基因工程手段將成骨蛋白編碼基因連接到油體蛋白基因的3’端，構(gòu)建由油體蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的“油體蛋白-腸肽酶-人成骨蛋白”植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化花生，重組蛋白伴隨著油體的積累在花生種子中高水平的表達(dá)，通過漂浮離心將重組蛋白分離純化，然后通過外切蛋白酶消化后純化獲得該蛋白。本發(fā)明方法獲得的重組蛋白安全、活性高、非常容易回收和純化，而且可以在花生種子中長期的儲(chǔ)存、運(yùn)輸方便，可以增加農(nóng)產(chǎn)品的附加值。文檔編號(hào)C12N15/82GK101591671SQ200910016959公開日2009年12月2日申請日期2009年6月30日優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日發(fā)明者晗夏,李愛芹,李長生,畢玉平,王興軍,趙傳志申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心