專(zhuān)利名稱(chēng)：：麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及齊墩果酸相關(guān)基因——0-amyrin合成酶基因(^AS2及功能驗(yàn)證。
背景技術(shù)：
：植物次生代謝是指有些生物體利用某些初生代謝產(chǎn)物為"原料",在一系列酶的催化下,形成一些特殊的化學(xué)物質(zhì)的過(guò)程，這些特殊的化學(xué)物質(zhì)即為次生代謝產(chǎn)物，如生物堿、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸、木質(zhì)素等,它們是植物中一大類(lèi)并非生長(zhǎng)所必需的小分子有機(jī)化合物，但對(duì)于植物自身在復(fù)雜環(huán)境中的生存和發(fā)展卻起著不可替代的作用。植物次生代謝產(chǎn)物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。臨床應(yīng)用的藥物,有很多都是取自植物的次生代謝產(chǎn)物。西方的臨床藥物中，大約25%是直接或間接地從植物中提取的次生代謝物。在我國(guó)，藥用植物的應(yīng)用歷史更為悠久。此外，用作食品調(diào)味劑、日用芳香劑、殺蟲(chóng)劑等的植物次生代謝產(chǎn)物也倍受人們的青睞。隨著基因工程技術(shù)的不斷完善，對(duì)植物細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修飾和改造來(lái)積累大量目的產(chǎn)物己成為可能。目前，次生代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化是植物次生代謝工程的研究熱點(diǎn)。應(yīng)用關(guān)鍵酶基因的代謝工程為提高植物組織、細(xì)胞培養(yǎng)及整體植株代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供了技術(shù)平臺(tái)。植物次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，生物合成途徑也千差萬(wàn)別，只有在了解目標(biāo)植物特定次生代謝途徑的基礎(chǔ)上，才能有選擇地進(jìn)行有效的基因操作。因此，植物次生代謝圖譜的研究是植物次生代謝基因工程必要的前提工作。植物次生代謝物種類(lèi)繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)迥異?，F(xiàn)在，已知大約有10000種次生代謝物,包括酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆素、木脂素、生物堿、糖苷、萜類(lèi)、甾類(lèi)、皂苷、多炔類(lèi)、有機(jī)酸等，可分為酚性化合物、萜烯類(lèi)化合物、含氮有機(jī)物三大類(lèi)。萜類(lèi)化合物(terpenoids)是植物次生代謝產(chǎn)物中最大的一個(gè)家族，在自然界中廣泛分布，由異戊二烯(isoprene，C5)單元組成的化合物及其衍生物，按碳原子的數(shù)目可以分為單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、三萜(C30)和多萜等。由于多數(shù)萜類(lèi)化合物分子中具有不同的碳環(huán)數(shù)，因此又可分為鏈萜、單環(huán)萜、雙環(huán)萜和三環(huán)萜等。其中三萜類(lèi)化合物是由六個(gè)異戊二烯單元組成的物質(zhì)。廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，以游游離狀態(tài)或成酯或苷的形式存在。多數(shù)是含氧衍生物，為樹(shù)脂的主要成分之一。例如甘草中的干草苷稱(chēng)為甘草酸，因其味甜又稱(chēng)甘草甜素，在酸性條件下水解得到的苷元稱(chēng)為甘草次酸，可溶于乙醇和氯仿中，是一個(gè)五環(huán)三萜化合物。角鯊烯是存在于鯊魚(yú)的魚(yú)肝油、橄欖油、菜籽油中的一個(gè)鏈狀三萜，它是由一對(duì)三個(gè)異戊二烯單元頭尾連接后的片段互相對(duì)稱(chēng)連接而成，具有降低血脂和軟化血管等作用，被譽(yù)為血管清道夫。中草藥是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，其有效成分絕大多數(shù)都來(lái)源于次生代謝產(chǎn)物，在植物中含量甚微，利用栽培措施大幅度地提高有效成分含量難度很大。通過(guò)次生代謝的基因工程，來(lái)提高中藥材有效成分含量的研究剛剛起步。有效成分相關(guān)基因的克隆及其功能鑒定的有效方法還較少，且耗時(shí)，所獲得的次級(jí)代謝途徑中的相關(guān)基因較少。高寒藏藥麻花艽系龍膽科(Gentianaceae)、龍膽屬(Gentiana)，主要分布于西藏、3青海、甘肅海拔2500-4700米的高寒地區(qū)，多年生草本，全草及根入藥，由于其分布散，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，藥材收集極為困難，因而已成為瀕危物種。主治黃膽性肝炎，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、結(jié)核病潮熱、哮喘、抽搐、休克、過(guò)敏反應(yīng)。富含五環(huán)三萜類(lèi)次生代謝物，amyrin(e-香樹(shù)素)是其中的一類(lèi)重要的三砲類(lèi)化合物。e-amyrin是植物中最常見(jiàn)的三萜類(lèi)化合物之一。它的五碳環(huán)骨架，折疊為椅式構(gòu)象，是由2，3-氧化角鯊烯經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)在e-amyrin合成酶催化下形成的(Kushiroetal.，1998)。而其合成酶是該途徑中非常重要的限速酶，控制著這些藥用成分前體合成的第一步反應(yīng)，因此對(duì)該基因的克隆具有極其重要的意義。齊墩果酸是該反應(yīng)中的最終產(chǎn)物，在龍膽科植物麻花艽中P-aniyrin合成酶基因?qū)τ诳垢窝子行С煞铸R墩果酸的積累具有很高的促進(jìn)作用。到現(xiàn)在為止，已從許多雙子葉植物中分離到了e-amyrin合成酶基因，如雙子葉人參中的PNY1(Kushiroetal.，1998)，PNY2(Kushiroetal,，1998);干草中的GgbASl(Hayashietal.,2001);豌豆中的PSY(Moritaetal.，2000);還有截形苜蓿(Suzukietal.,2002)和白樺(Zhangetal.，2003)等:單子葉植物燕麥中的AsbASl(Haralampidisetal.,2001)。并有文章報(bào)道對(duì)其功能的驗(yàn)證。對(duì)于盡管目前已經(jīng)在許多物種中克隆到e-amyrin合成酶基因，但是對(duì)于龍膽科植物麻花艽來(lái)說(shuō)該基因都克隆、功能驗(yàn)證并在植物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道，并且對(duì)于該基因與齊墩果酸關(guān)系的研究也是未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明在麻花艽中克隆得到的基因G"S2與其他物種中的類(lèi)似基因相比同源性在50-75%之間，但是對(duì)于其保守區(qū)都分析發(fā)現(xiàn)麻花艽中e-amyrin合成酶基因foAi的氨基酸序列含有4個(gè)QW和l個(gè)DCTAE基元，在已知其它物種中的0-amyrin合成酶基因都含有該基元，而該結(jié)構(gòu)上的特征對(duì)于其功能的發(fā)揮具有一定的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種麻花艽中齊墩果酸相關(guān)基因——e-arayrin合成酶基因及其在制備齊墩果酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是從麻花艽中分離得到e-amyrin合成酶基因foAS"么在真核系統(tǒng)中驗(yàn)證功能，然后將該基因轉(zhuǎn)到原植株麻花艽中得到高齊墩果酸含量的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明提供的麻花艽0-amyrin合成酶基因foA5"么其特征在于所述基因cDNA序列如SEQIDNo.1所示。本發(fā)明還提供了一種含上述的麻花艽e-amyrin合成酶基因foAC的酵母表達(dá)載體pPICZA,其特征在于所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本發(fā)明還提供了一種含上述的麻花宄e-amyrin合成酶基因"W5^的植物表達(dá)載體pROKII，其特征在于所述植物表達(dá)載體核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。該植物表達(dá)載體PROKII都構(gòu)建主要通過(guò)以下四步完成l)帶有Sacl和Xball酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增目的基因fcA5^;2)將目的基因foAW克隆入pMD18-T載體；3)將含有foA9i"基因的pMD18-T載體和PROKII載體分別用Sacl和Xball進(jìn)行雙酶切；4)將回收的foA5"i"基因和PR0KII載體連接。本發(fā)明所述麻花艽e-arayrin合成酶基因foAS^在制備齊墩果酸中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)將GsASl基因轉(zhuǎn)化進(jìn)原植株麻花艽中，通過(guò)該基因的過(guò)表達(dá)使齊墩果酸含量得到大的提高，其中齊墩果酸的含量通過(guò)HPLC方法測(cè)定。本發(fā)明的有益效果利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了麻花艽的0-amyrin合成酶基因fo力6^并在畢赤酵母中進(jìn)行功能驗(yàn)證，通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化的方法將該基因轉(zhuǎn)入原植株麻花艽中，經(jīng)過(guò)比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的齊墩果酸含量可提高2-3倍。所以對(duì)于該基因6^AW的研究具有重要都意義和應(yīng)用前景。圖〗為麻花艽e-amyrin合成酶基因foAW的cDNA電泳圖，其中M為Marker。圖2為轉(zhuǎn)P-amyrin合成酶基因foA5^后麻花艽陽(yáng)性愈傷組織篩選圖。圖3為轉(zhuǎn)基因麻花艽DNA鑒定圖，其中M為Marker,2-7、10、12、14-20、22-24均為麻花艽轉(zhuǎn)基因植株的cDNA。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l、CW5^的克隆1.1麻花宄總RNA的提取(1)麻花艽材料放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過(guò)程中要保證材料浸在液氮中。(2)待液氮揮發(fā)后將材料迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，每50-10(kg組織材料加入1mlTRIZ0L溶液，混勻后，于室溫放置5min，12000r/min，2-8。C離心10min去沉淀。(3)每1mlTRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振蕩15sec充分混勻，于室溫放置5min，12000r/min,2-8。C離心15min。(4)取上清，每lmlTRIZOL加入0.5ml的異丙醇，混勻，室溫放置1020min。(5)2-8。C12000r/min離心10min，棄上清。(6)加lml75°/。乙醇洗滌沉淀2次，4。C不超過(guò)7500r/min離心5min，棄上清。(7)室溫放置晾干后，加入15P1DEPC處理的雙蒸水溶解RNA。1.2逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA(1)0.2mlEppendorf管中，加入下列成分用DNaseI純化的上述總RNA(0.1yg/y1)2.On1Olige(dT)anchoredprimer(2wM)2.0u1(2)(TC水浴變性10分鐘，立即置于冰浴中。(3)在10u1反應(yīng)體系中加入下列成分2.0ul5XMMLVRTbuffer;1.0nl250umol/L藩Pmix;O.25iURnasin;O.5u1(200u/u1)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶;2ul上述RNA變性液。42'C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)lhr。反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA用于后面的反應(yīng)。1.3PCR以上述逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA為模板，PCR法擴(kuò)增基因片段。(1)PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物P2:5'-ATGTGGAGGCTAAAGATCG-3'引物P3:5'-AGAAGTTGATTATAAGTTAGCTGCA-3'(2)PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer2u1MgCl2(25mmol/L)1.5u1dNTP(each250umol/L)0.1P2(10iimol/L)lu1P3(4ymol/L)ly1逆轉(zhuǎn)錄第一鏈產(chǎn)物"1ExT叫0.2u1無(wú)菌水10.lu1(3)PCR反應(yīng)程序94°C5min;94°C30sec,50°C30sec，72°C2min,35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物電泳如圖1所示。1.45'-RACE按照TaKaRa5'-FullRACECoreSet說(shuō)明書(shū)所示步驟操作。電泳5'-RACE產(chǎn)物。1.5目的片段的回收(1)用刀片切下上述電泳結(jié)果中含目的條帶的膠條置于1.5mlE卯endorf管中。(2)稱(chēng)重，加入3-4倍體積的DR-IBuffer,65。C加熱lOmin融化膠塊，每隔2min混勻一次保證膠塊能充分融化。(3)加入DR-1Buffer量的1/2體積的DR-IIBuffer,均勻混合。(4)將SpinCloumn安置于CollectionTube上，將上述溶液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，5000rpm離心lmin，棄濾液。(5)將500ylRinseA加入SpinColumn中，5000rpm離心lmin,棄濾液。(6)將700ii1RinseB加入SpinColumn中，5000rpm離心lmin，棄濾液。(7)重復(fù)步驟6，然后12000rpm再離心lmin。(8)將SpinCloumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinCloumn膜的中央處加入預(yù)熱到6(TC的25u1的水或洗脫緩沖液，室溫靜置lmin。(9)12000rpm離心lmin洗脫DNA。(10)重復(fù)步驟9，2次，將所有洗脫液集中收集于一管內(nèi)，混勻，取少量電泳檢査回收效率，其余加入l/10體積的3mol/LNaAc(pH5.3)和2倍體積的無(wú)水乙醇,-20'C沉6淀lhr。(11)然后4。C，12000rpm離心15min，用70%冷乙醇洗滌沉淀，棄盡液體，用40ul無(wú)菌水溶解沉淀?；厥盏钠斡糜诤竺娴倪B接反應(yīng)。1.6連接用上述的回收目的片段與pMD-18T載體(購(gòu)自寶生物工程有限公司，下同)按摩爾比約1:1的比例進(jìn)行連接,連接體系如下目的片段7PlT-vector1y110XT4畫(huà)LigaseBufferlulT4DNALigase1n1混勻并短暫離心，16'C連接過(guò)夜。得到重組質(zhì)粒pMD18T-AS7，用于后面的反應(yīng)。1.7CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞(1)挑取DH10B單菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。(2)按l:100-1:50的比例，取lral菌液接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至菌液OD,為O.3-0.6。(3)將菌液冰浴10min，4°C4000rpm離心10min，收集菌體。(4)沉淀加10ml預(yù)冷的0.1MCaCl2懸浮后，冰浴30min。(5)4'C4000rpm離心10min。沉淀重懸浮于lml預(yù)冷的0.1MCaCl2，混勻并冰水浴中保存，備用或加入15y。的甘油置于-7(TC中保存。1.8熱擊法轉(zhuǎn)化EcoliDH10B(1)在無(wú)菌條件下吸取100u1感受態(tài)細(xì)胞，加入1.5ml預(yù)冷的無(wú)菌Eppendorf管中，加入10ul連接產(chǎn)物(1.6中的重組質(zhì)粒)，輕輕混勻，立即置于冰上30min。(2)在42'C恒溫水浴中熱激90sec(準(zhǔn)確記時(shí))。(3)冰浴3-5min。(4)加入800ul不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻，37。C振蕩培養(yǎng)45-60min。(5)短暫離心收集菌體，用150ulLB液體培養(yǎng)基重懸菌體，轉(zhuǎn)至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布。(6)將平板于37'C正向放置15-30min至液體被吸收，倒置平板，于37'C培養(yǎng)12-16hr，觀(guān)察平板會(huì)有藍(lán)白斑。白斑用于后面的質(zhì)粒提取。1.9堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒(1)挑取白色單菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3mlLB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)也要保存所挑取的白色單菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固體LB平板中，37'C震蕩培養(yǎng)12-16h;(2)12000rpm離心30sec，收集培養(yǎng)物中的菌體，盡量棄盡上清；(3)加入100ul冰預(yù)冷的溶液I，在渦旋器上使菌體充分重懸；(4)加入200yl溶液n，立即將離心管緩緩顛倒數(shù)次，冰浴5-10min;(5)加入150y1冰預(yù)冷的溶液III，緩緩顛倒離心管數(shù)次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min;(6)12000rpm離心3min，取上清轉(zhuǎn)入另一微量離心管中，加入2倍體積95%乙醇，混勻后，室溫靜置3min;12000rpm離心3min，使質(zhì)粒DNA沉淀；(7)棄盡上清，取200iUTE溶液溶解沉淀；(8)加入等體積冰預(yù)冷的5mol/LLiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA;(9)12000rpm,離心3min;(10)轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入2倍體積的95W乙醇，混勻后于室溫靜置3min，12000rpm離心3min使質(zhì)粒沉淀；(11)棄上清后用lml70%乙醇洗滌沉淀，棄盡液體；(12)室溫干燥后，取20ul含RNaseA(20ug/ml)的TE溶液溶解沉淀，37。C水浴3060min消化RNA。(13)為減少損失，可先用TE將總體積補(bǔ)充至200ul，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，充分振蕩5-10min，12000rpm離心5min;(14)取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇，重復(fù)以上操作；(15)取上清，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.3)禾n2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后-20。C放置15min，12000卬m離心3min使質(zhì)粒沉淀；(16)棄上清用lml70%乙醇洗滌沉淀，棄液體，用40ulTE或無(wú)菌水溶解沉淀。質(zhì)粒用于后面的反應(yīng)。1.10質(zhì)粒酶切驗(yàn)證用EcoRI酶切上述質(zhì)粒，酶切反應(yīng)體系如下表所示重組質(zhì)粒pMD18T-AS^16u1EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶2ul10XBuffer2ul將上述反應(yīng)體系混勻并5000rpm離心lmin，37"水浴反應(yīng)過(guò)夜，然后進(jìn)行1M的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.11DNA測(cè)序挑取含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性單菌落用含有Amp(50mg/L)的液體LB搖過(guò)夜，然后送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果基因cDNA序列如序列表SEQIDNo.1所示。經(jīng)過(guò)NCBIblast分析，上述cDNA序列與人參的PNYl同源，證明實(shí)驗(yàn)得到的就是麻花艽的13-amyrin合成酶基因，命名為麻花艽P-amyrin合成酶基因foA^。實(shí)施例2、麻花艽6-amyrin合成酶基因foA5^的功能驗(yàn)證2.1酵母表達(dá)載體的構(gòu)建2.1.1目的基因的獲得(1)引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增帶EcoRI和Xhol酶切位點(diǎn)都foA"基因。P01:5'-GAATTCATGTGGAGGCTAAAGATCG-3'EcoRIP02:5'-CTCGAGAGAAGTTGATTATAAGTTAGCTGCA-3'Xhol(2)PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer2p1MgCl2(25mmol/L)1.5y1d,(each250iitnol/L)0.2w1P21(4umol/L)lu1P32(4pmol/L)U1重組質(zhì)粒pMD18T-lu1rT叫(TaKaRa)0.2u1無(wú)菌水13.lul(3)PCR反應(yīng)條件為94'C5min;94°C30sec，60°C30sec，72°C2min，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物電泳回收后用于后面的反應(yīng)。2.1.2表達(dá)載體的構(gòu)建步驟弓I入酵母表達(dá)載體pPICZA(購(gòu)自寶生物工程有限公司)，該載體上含有中所含有EcoR和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。將帶有EcoR和XhoI酶切位點(diǎn)的cDNA與質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoR和XhoI的雙酶切，再按照5:1的比例在T4連接酶的催化下進(jìn)行連接16小時(shí)以上。反應(yīng)體系及條件如下(1)cDNA酶切反應(yīng)體系和條件cDNA/EcoR+XhoI6u1EcoR1U1Xhol1u110XHBuffer2nl37°C16h;(2)質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系和條件pPICZA質(zhì)粒6u19EcoR1U1Xhol1U110XHBuffer137°C16h;連接反應(yīng)用T4DNALigase進(jìn)行，體系和條件同T載體的連接體系和條件。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，得到酵母表達(dá)載體pPICZA-6S。提取陽(yáng)性克隆pPICZA-6"57的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應(yīng)體系和條件同鑒定重組子。2.2DNA導(dǎo)入酵母(1)挑取酵母菌株(畢赤酵母)的單克隆，接種至10ml液體YPD培養(yǎng)基，30°C，200rpm，培養(yǎng)2-3天；(2)按照l(shuí):50的比例將菌液轉(zhuǎn)移至50mlYPD液體培養(yǎng)基中30。C，200rpm，培養(yǎng)35h，此時(shí)的菌液OD0.40.6。(3)將菌液分裝至10nil無(wú)菌離心管中，每管5ml;(4)3000rpm離心5min，收集細(xì)胞。用2.5ml無(wú)菌ddH20重懸菌體；(5)3000rpm離心5min，收集細(xì)胞。用O.lml100mM(IX)LiAc/TEbuffer重懸菌體;(6)3000rpm離心l2min沉淀細(xì)胞(僅需將菌體離心至離心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；(7)用50ullOOmM(IX)LiAc/TEbuffer重懸菌體，將菌懸液移至滅菌的l.5mlEppendorf管中；(8)將lml單鏈擔(dān)體DNA煮沸5min,快速在冰水中冷卻；(注無(wú)需每次使用時(shí)都煮沸擔(dān)體DNA，可分裝成小份凍存；凍融34次后應(yīng)再煮沸，取出后應(yīng)保持在冰上)(9)將步驟7準(zhǔn)備的樣品，3000rpm離心l2ndn沉淀細(xì)胞，用微量取樣器小心吸走上清；(10)按下列順序加入240ulPEG(50%w/v)(加入后用槍頭上下吹打，盡量將菌體懸浮)；36u11M(10X)LiAc;25u1單鏈擔(dān)體DNA(2.0mg/ml)50ul水和質(zhì)粒DNA(O.llOug)(—般情況下，質(zhì)粒加入1040ixl即可)；(11)渦旋振蕩Eppendorf管lmin,直到細(xì)胞完全混勻，30。C水浴30min;(12)42。C水浴中熱激2025min;(13)5000rpm離心l2min，用微量移液器除去轉(zhuǎn)化混合液；(14)吸取0.21.0ml無(wú)菌水加到每個(gè)反應(yīng)管中，用移液器輕輕抽提以懸浮沉淀；(15)取50ul轉(zhuǎn)化液，均勻涂布在含卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)24d。用未轉(zhuǎn)化的酵母做對(duì)照。2.3酵母重組子的鑒定2.3.1菌落PCR鑒定初篩(1)平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見(jiàn)時(shí)。(2)將除了模板以外的其他PCR反應(yīng)液組分準(zhǔn)備好，并分裝。(3)用一根滅菌牙簽挑取菌落，在PCR管中測(cè)一下，放入一個(gè)滅菌的1.5ml離心管，對(duì)PCR管和1.5ml離心管編號(hào)。(4)PCR擴(kuò)增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)PCR擴(kuò)增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，置于1.5ml離心管中的半截牙簽扔到5mlYPD培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)，24±1小時(shí)提取DNA，用DNA作為模板再進(jìn)行PCR進(jìn)一步確定。PCR反應(yīng)體系及條件如下10XPCRbuffer2ii1MgCl2(25mmol/L)1.5yld證(each250umol/L)0.2ulP2(4關(guān)ol/L)lulP3(4nmol/L)ly1菌液lu1rTaq(TaKaRa)0.2u1無(wú)菌水13.1u1PCR反應(yīng)條件為94°C5min;94°C30sec，60°C30sec,72°C2min,35個(gè)循環(huán);最后72。C延伸7min。2.3.2酵母總DNA為模板進(jìn)行二次鑒定酵母基因組的提取(1)接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5mlMD培養(yǎng)基，菌于YPD培養(yǎng)基作對(duì)照，3(TC,培養(yǎng)16-18小時(shí)。(2)室溫下，1500g離心5-10min收集菌體。(3)100uLTE(pH7.0)重懸后1500g離心5-10min收集菌體。(4)用2ml的SCED(PH7.5)重懸。(5)加入l3mg蝸牛酶，37°C，50min。(6)加入2ml1%SDS，輕搖混勻，然后置于冰上5min。(7)加入1.5ral5M醋酸鉀，輕輕混勻。(8)10000g離心5-10min，棄上清。(9)加入2倍體積無(wú)水乙醇，室溫放置15min。(10)10000g離心20min，棄上清。(11)加入0.7mlTE緩沖液。(12)加入等體積的苯酚:氯仿(l:lV/V).(13)加入1/2體積的7.5M醋酸銨溶液。(14)加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-2CTC放置lhr。(15)10000g離心20min。(16)加入lml75%乙醇漂洗沉淀一次。(17)干燥后，加入50ul的TE或H20溶解，-2(TC備用。PCR反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件同菌落PCR，PCR產(chǎn)物O.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。實(shí)施例3、植物表達(dá)載體的構(gòu)建3.1目的基因的獲得引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)的體系和條件(1)設(shè)計(jì)如下一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，引入植物表達(dá)載體pR0K2(購(gòu)自寶生物工程有限公司)中所含有的兩個(gè)酶切位點(diǎn)Sacl和Xball。P41:5'-CGAGCTATGTGGAGGCTAAAGATCG-3'SaclP42:5'-GCTCTAGAAGAAGTTGATTATAAGTTAGCTGCA—3Xball(2)PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer2u1MgCl2(25mm。l/L)1.5uldNTP(each250umol/L)0.2wlP41(4umol/L)llilP42(4um。l/L)lul重組質(zhì)粒P脂18T-AS^liilrTaq(TaKaRa)0,2u1無(wú)菌水13.1u1(3)PCR反應(yīng)條件為94。C5min:94°C30sec,60°C30sec，72°C2min，35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物電泳回收后用于后面的反應(yīng)。3.2表達(dá)載體的構(gòu)建將帶有Sacl，Xball酶切位點(diǎn)的cDNA與質(zhì)粒分別進(jìn)行Sacl和Xball的雙酶切，再按照5:1的比例在T4連接酶的催化下進(jìn)行過(guò)夜連接。反應(yīng)體系及條件如下(1)酶切反應(yīng)體系和條件cDNA/Sacl+Xball6n1Sacl1u110XBuffer2p1ddH201w1上表體系30°Clh，下表體系37'Clh原反應(yīng)液10Xballlul0.1%BSA2u10.l%TritonX-1002pl10XBuffer2u1ddH203u1(2)質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系和條件pR0K2質(zhì)粒6w1Sacllul10XkBuffer2u1ddH201u1上表體系30°Clh，下表體系37'Clh原反應(yīng)液10ulXball1"0.1%BSA2u10.l%TritonX-1002^110XHBuffer2u1ddH203u1連接反應(yīng)用T4DNALigase進(jìn)行，體系和條件同pMD18_T的連接體系和條件。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，提取陽(yáng)性克隆pR0K-AS^的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應(yīng)體系和條件同鑒定重組子。3.3測(cè)序?qū)⒑兄亟M質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBIblast分析，陽(yáng)性質(zhì)粒中確實(shí)含有麻花艽e-amyrin合成酶基因foA5"i的cDNA序列。至此得到了重組表達(dá)載體，即含基因fo/!5"溯植物表達(dá)載體pR0K-A5"么實(shí)施例4、基因槍轉(zhuǎn)化麻花艽P-amyrin合成酶基因foAS^4.1基因槍轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化使用繼代兩周的麻花艽胚性愈傷組織。在微彈轟擊之前轉(zhuǎn)至含有滲透劑的MS繼代培養(yǎng)基上于黑暗、26'C保溫4h進(jìn)行高滲處理。滲透劑為甘露醇，濃度采用O.4mol/L。將2mg金粒(直徑lym)、質(zhì)粒DNA各2.5wl(lug/ul)、25y1亞精胺(O.lmol/L)和50ulCaC12(215mol/L)混合，渦旋或超聲波處理多次使之均勻，10000r/min離心5s后去上清,沉淀用250ul乙醇洗滌并重新懸浮于240ul乙醇溶液。將包被有DNA的金粒懸浮液涂于微彈承載片，每片涂3.5n1，放置幾分鐘干燥后用于基因槍轟擊;每次涂液前將懸浮液旋渦處理使之均勻。每次轟擊的微彈量約2912yg?；驑屝吞?hào)為PDS1000PHe(BioRad),氣壓采用1100psi。4.2培養(yǎng)選擇和再生體系轟擊后16h將胚性愈傷組織塊從高滲培養(yǎng)基移至含600mg/mlKan的IB繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將褐色和黑色愈傷去掉，最終獲得綠色再生植株。4.3CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA(1)稱(chēng)取O.5G的剪股穎葉子，剪碎后用液氮研磨，迅速將粉末轉(zhuǎn)移至l.5ml離心管中，然后加入700ul預(yù)熱至65'C的2xCTAB提取緩沖液及0.1%的疏基乙醇，輕輕顛倒離心管混勻，然后置于65'C水浴保溫2h，不時(shí)顛倒混勻。(2)混合物冷卻至室溫后加入等體積的酚氛仿異戊醇(25:24:1)，4'C下10000g離心10min。(3)將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，4'C下10000g離心10min。(4)將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入兩倍體積無(wú)水乙醇，溫和混勻，-2(TC放置30min沉淀DNA。(5)4'C下10000g離心10min，棄去液體，并用70%乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入100閃含無(wú)DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37°C水浴30min(6)加入200yl無(wú)水乙醇，溫和混勻，-2(rC放置30min沉淀DNA.4。C下10000g離心10min，棄去液體，并用70%乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入40^1無(wú)菌水溶解DNA，4'C保存待用。4.4PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株13以CTAB法提取的DNA為模板，PCR法擴(kuò)增以35S啟動(dòng)子片段。35S片段啟動(dòng)子引物序列35SS:5'-GCAGAGGCATCTTCAACG-3'35SA:5，一GACGATCTACCCGAGCAA—3，(1)PCR反應(yīng)體系10XPCRbuffer2u1MgCl"25畫(huà)l/L)1.5uldNTP(each250uraol/L)0.2ti135SS(4踐ol/L)lul35SA(4uraol/L)lulDNA模板1y1rTaq(TaKaRa)0.2u1無(wú)菌水13.lul(2)PCR反應(yīng)程序94°C5min;94°C30sec,53°C30sec，72°C2min，35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8MTAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性再生植株齊墩果酸測(cè)定轉(zhuǎn)化后篩選得到的陽(yáng)性植株經(jīng)液氮研磨后加入10ml氯仿，超聲40min后離心去上清。最后將上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定齊墩果酸含量。結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的齊墩果酸含量提高1倍以上。注上述實(shí)驗(yàn)中用到的試劑等購(gòu)自TAKARA、Promega、Sigma、Invitrogen等公司。實(shí)驗(yàn)中用到的LB培養(yǎng)基配方(均為重量比)0.5%酵母粉、l%NaCl、1%蛋白胨。其它試劑配方見(jiàn)《分子克隆》第三版。序列表<110〉山東大學(xué)〈120〉麻花艽e-amyrin合成酶基因OsAS7及其應(yīng)用<141>2009-1-18<160〉3<210〉1<211〉2335〈212〉cDNA〈213>麻花艽〈221>麻花艽e-amyrin合成酶基因Gs^S2〈222>(1)…(2335)〈400>1atgtgg鄉(xiāng)ctaaagatcgc卿郷tggt犯tgatccttatttgt3teLgtacaaacaac60城gtgggg3ggc卿catgggagtacgacccg犯cgccggt3CgCCgg3gg卿gggcg120gaggtggaggaatctcgccgtcagttctgggacaaccgccgtgatatt犯gcctagtggt180gatctcctccggcgtttgcagtttttacgtgaaaag犯ttcataccagct240gtgaaagtagaagatggcc3cacca犯tggccaccgattctttacgcaga300gccgtccatttcttctccgccttgcaggcttccgacggccattggccggccgaa犯tgcc360ggccctttgttctttcttcctcctctggtgatgtgtctatacatcacaggtcatctcaac420tcagtatttccagc3g犯c3t3犯Cgtg犯3t3Ct3CgtttC8tC3g33t480ga卿tgggggttggggattacacatagaaggtcacagcacgatgttttgcactgcattg540agtt3c已tttgcatg鄉(xiāng)ctactcggagaagggcccgatggtgggatt犯taacgcgtgt600gctagsgcacgg犯atggattcttgatcatgggagcgtcacttcgattccctcttgggga660犯gacttggctttcgattctgagtggtccgggactaatccgatgcccccg720gaattttggattcttccttcttttcttcctatgtatccagcga犯atgtggtgctattgc780agaatggtttcatgccgatgtcgtatttatattcgtgggcccgattacgc840ccttaattcgag犯ctccgsgacgagtt已cactctgtgccCt3tg3tC犯gttgcttgga900犯a3atacagacatgtttgt3tctatattaccctcatccatttgtacaag960atttgatttgggat8gtttaitaitgt3tgC3cagaigccacttttg3Ct3g3tggccattca1020ataaattgagagcaaaagctcttgaagtaacaatgg犯c3gaag3tg犯31080atagtcgttaC3t^Ct3ttggatgtgUg犯aaggtgttatgtatgcttgcttgttggg1140tggaggatcc犯犯gggg3t犯catctagcaagaatcccggactatatst1200ggattgc卿卿tgg犯tg犯犯tgc已gagttttggtagtcaag已a(bǔ)tgggatacaggtt1260ttgccattcaagcacttcttgcgtgtgatatgaccgeiagatatcgcag犯actctacgta1320aaggacacgEictttgtg已a(bǔ)g犯atcccaggtcaaagat犯cccttctggtgattttaaga1380gcatgcaccgccacatttcg犯3ggttcatggacattttcggatc犯g3tcatggatggc1440犯gtctctgattgcactgctg犯ggctt^aggtttgtctccatttttctacaatgccac1500cgg卿ttgtatggagcctgtgacgccgtcaac3ttttat1560tatcgttacagagcaaa^3tC3gC3tggg3accagcagggtcatc已ga已t1620ggCt聊gCtgttgaatccattgctgatattgtgattgagcatgeLgtatg1680ttg犯tgtactgcatcttcaatccatgctctcattttattcaa^犯ctct已cccgggac17403ccgt犯gaaaga3atcg犯acgtccattataaacgcgtcgaastatctagaag已tgtcc1800aaatgccagatggctcatggtatggaaattggggagtgtgttttacateLtggt3CEltggt1860ttgc已cttgg3gg3tt3gC已gcatctggaaagac3tatg3taattgtaacgcggttcgta1920aagctgttaatttcttgctaaattcacaacg3C3卿tggcggttggggtg犯3gCt3tC2040tttcttgtcctacgtacctcttgaaggcgaSLCgctcaaaicttggttcata2100cttcttgggctstgatgggact犯ttcattCtgg3C郷Cca^g3gstcctacgcctct2160ccatcgtgcagct犯acttat幼tcsactctC3g3tgg犯gatgg卿ttttccccaaca2220ggaaataacaggagttttcatg犯gaattgt3tgtt3C3ttatgctgca/tatcggascat2280atatcctttatgggctttagC3g犯t3tCgc犯g卿gtgccattgccatcttga2335〈210>2〈211〉8621〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉酵母表達(dá)載體pPICZA-"5^〈222〉(1)(8621)〈400>2ag3tctaacatCC犯3g3Cgtg333CCtttttgccatccg60gtccattctcacacataagtgcca犯cgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgt120tgc犯acgcaggacctccactcctcttctcCtC33C3CCCacttttgccatcg犯犯acc240agcccagttattgggcttgaUggagctcgactttattagcctgtctatcctggcccccc360tggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgc犯c犯gctccgcattac3cccg3acat420cactccagatg鄉(xiāng)gctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcc480agtttaaacgctgtcttggaacctaatatg已caa犯gcgtgatctcatcc540犯gatg犯ct犯gtttggttcgttga肌tgct犯cggccagttggtC3犯aagsaacttc600caa犯gtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacg犯tgctc660tcatt犯tgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaa720cgc咖tggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgctt780ccaagattctggtggg犯tactgctgatagcctaacgttctttaactgtt840ctaacccctacttgacagcatgccctgtcttaaacctttt900tttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttt960tgatttt犯cgacttttaacg3C犯Cttg3gaag3tc犯3a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