癌細(xì)胞的檢測(cè)方法及其在診斷和監(jiān)測(cè)疾病治療中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：癌細(xì)胞的檢測(cè)方法及其在診斷和監(jiān)測(cè)疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
癌細(xì)胞的檢測(cè)方法及其在診斷和監(jiān)測(cè)疾病治療中的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域和
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及癌癥的檢測(cè)方法，更具體地講，本發(fā)明涉及優(yōu)化癌癥藥物治療的方法。
在世界范圍內(nèi)，大多數(shù)發(fā)病率和死亡率是由癌癥引起，盡管目前醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷進(jìn) 步。目前的治療策略主要集中在通過(guò)各種外科手術(shù)和非手術(shù)技術(shù)切除患者體內(nèi)的癌細(xì)胞或 使癌細(xì)胞死亡；但最廣泛使用的還是化學(xué)治療和Y輻射。這些方法具有許多顯著缺陷，尤 其是會(huì)破壞患者體內(nèi)的健康細(xì)胞/組織，而且目前生產(chǎn)的用于癌癥治療的化療藥物具有相 當(dāng)大的毒副作用。"分化治療(Differentiation therapy)"是一種替代方法，該方法可促進(jìn)表型從 惡性恢復(fù)到正常。分化治療是根據(jù)以下概念癌細(xì)胞是被阻止在未成熟或未完全分化狀態(tài) 的正常細(xì)胞，缺乏控制其自身生長(zhǎng)的能力，因而以異?？斓乃俾史敝场７只委煹哪康氖瞧?使癌細(xì)胞重新恢復(fù)成熟過(guò)程。盡管分化治療不能殺死癌細(xì)胞，但是可阻止其生長(zhǎng)并可允許 使用更多常規(guī)治療(例如化療)，以消除剩余惡性細(xì)胞。 與旨在癌/腫瘤細(xì)胞死亡的常規(guī)治療策略相比，分化治療具有眾多優(yōu)勢(shì)。 一開(kāi)始， 就不需要用化療藥或Y輻射來(lái)破壞患者體內(nèi)的健康細(xì)胞/組織，同時(shí)也就沒(méi)有其相關(guān)不良 副反應(yīng)。在許多情況下，通過(guò)Y輻射或化療殺死癌細(xì)胞能消除患者體內(nèi)大部分、但并非所 有癌細(xì)胞，因而導(dǎo)致疾病的緩解。用分化治療，推測(cè)通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的某些細(xì)胞進(jìn)入終末 分化途徑并最終衰老，這會(huì)以某種方式將信號(hào)發(fā)給其它癌細(xì)胞經(jīng)不同機(jī)制而跟隨其后。
各種標(biāo)記物已用于監(jiān)測(cè)接受分化治療的患者的方法。 一種這樣的標(biāo)記物就是堿 性磷酸酶，其中該酶的表達(dá)看來(lái)與細(xì)胞分化狀態(tài)有關(guān)[Patnaik A等，Clin. Can Research, 2002 Jul ;8(7) :2142-8 ;R印haeli A，Zhuk R，Nudelman A， 2000， Drug Develop. Res.第50 巻:379-391]。 對(duì)這類標(biāo)記物進(jìn)行快速簡(jiǎn)便而高靈敏度、高選擇性和高精度的檢測(cè)，為定制針對(duì) 特定患者的治療藥(即個(gè)性化醫(yī)療(personalizedmedicine))鋪平了道路。這在癌癥治療 上非常重要，目前已經(jīng)知道，僅根據(jù)腫瘤種類和解剖學(xué)位置是無(wú)法預(yù)測(cè)腫瘤治療反應(yīng)的。
時(shí)至今日，對(duì)于這類標(biāo)記物尚無(wú)檢測(cè)系統(tǒng)能滿足所有這些要求。
美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0060100488公開(kāi)了采用交流電，通過(guò)直接監(jiān)測(cè)細(xì)胞的電反應(yīng)而 檢測(cè)癌細(xì)胞。W0 91/15595公開(kāi)了對(duì)癌細(xì)胞電導(dǎo)率進(jìn)行分析，用于監(jiān)測(cè)對(duì)治療和藥物篩選的 反應(yīng)性。具體地講，W091/15595公開(kāi)了通過(guò)分析其電導(dǎo)率來(lái)監(jiān)測(cè)抑制癌細(xì)胞體積和數(shù)量增 加的特定藥物的有效性。因此，這兩篇專利申請(qǐng)都公開(kāi)了癌細(xì)胞固有電學(xué)性質(zhì)可用作標(biāo)記 物，用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞。 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0040053425公開(kāi)了對(duì)流體中分析物的電流測(cè)量分析，其中電極 中含有電流產(chǎn)生酶。美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0040053425并未公開(kāi)對(duì)胞內(nèi)標(biāo)記物的電流測(cè)量檢 美國(guó)專利號(hào)5， 149， 629公開(kāi)了對(duì)包括癌細(xì)胞標(biāo)記物在內(nèi)的標(biāo)記物的電流測(cè)量分 析，其中電極中含有能與標(biāo)記物結(jié)合的抗體。分析是通過(guò)底物競(jìng)爭(zhēng)來(lái)進(jìn)行的。美國(guó)專利號(hào) 5， 149， 629并未檢測(cè)癌細(xì)胞的內(nèi)源性電流特性。
因此，對(duì)分析物進(jìn)行電流測(cè)量檢測(cè)已經(jīng)成為有效的檢測(cè)方法。然而，時(shí)至今日，電
流測(cè)量檢測(cè)尚未用于分析細(xì)胞酶活性。 發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供癌細(xì)胞的檢測(cè)方法，該方法包括(a)在酶催化細(xì)胞
與底物反應(yīng)的條件下，使細(xì)胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號(hào)的產(chǎn)物；和(b)測(cè)定
電信號(hào)水平，其中電信號(hào)水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細(xì)胞的標(biāo)志。 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供診斷癌癥患者的方法，該方法包括(a)在酶催化細(xì)
胞與底物反應(yīng)的條件下，使患者樣品中的至少一個(gè)細(xì)胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生
電信號(hào)的產(chǎn)物；和(b)測(cè)定電信號(hào)水平，其中電信號(hào)水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌癥
的標(biāo)志。 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供對(duì)癌癥治療進(jìn)行個(gè)性化優(yōu)化的方法，該方法包括
(a)使患者樣品中的至少一個(gè)癌細(xì)胞與至少一種抗癌藥接觸；(b)在酶催化細(xì)胞與底物反
應(yīng)的條件下，使至少一個(gè)癌細(xì)胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號(hào)的產(chǎn)物；和(c)測(cè)
定細(xì)胞所產(chǎn)生的電信號(hào)水平，其中該水平表示抗癌藥對(duì)患者癌癥的療效。 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供監(jiān)測(cè)患者的抗癌治療的方法，該方法包括(a)給予
患者至少一種抗癌藥；(b)按照本發(fā)明方法的步驟(a)，檢測(cè)患者樣品中癌細(xì)胞的存在或水
平，其中所述存在或水平表示癌癥的狀態(tài)。 根據(jù)本發(fā)明的額外方面，提供檢測(cè)患者的抗癌治療的方法，該方法包括 (a)按照本發(fā)明方法，分析患者樣品中癌細(xì)胞的存在或水平；(b)根據(jù)患者樣品中
癌細(xì)胞的存在或水平，給予患者治療有效量的抗癌藥。 根據(jù)下文所述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的其它特征，方法還包括在步驟(b)后重復(fù) 步驟(a)。 根據(jù)本發(fā)明又一額外方面，提供能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性表型的藥物的鑒定方法，該方法 包括(a)使至少一個(gè)癌細(xì)胞接觸藥物；(b)按照本發(fā)明方法的(a)和任選在(a)之前，測(cè)定 細(xì)胞的惡性表型，其中表型逆轉(zhuǎn)表明藥物能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性表型。 根據(jù)本發(fā)明再一額外方面，提供藥盒，該藥盒包含(i)電化學(xué)電解池 (electrochemical cell)的至少一種組分，該電化學(xué)電解池適合于容納至少一個(gè)生物細(xì)胞 并適合于進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定；和(ii)至少一種抗癌藥。 根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，藥盒還包含底物，該底物被所述生物細(xì) 胞的酶催化而進(jìn)行酶促反應(yīng)以生成反應(yīng)產(chǎn)物，從而在所述電化學(xué)電解池的電極上發(fā)生氧還 反應(yīng)。 根據(jù)本發(fā)明的額外方面，提供一種專為按照本發(fā)明方法檢測(cè)癌細(xì)胞而設(shè)計(jì)的系 統(tǒng)。 根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，至少一個(gè)細(xì)胞包括多個(gè)細(xì)胞。 根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，測(cè)定是用高通量方式進(jìn)行。 根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，所述方式選自自動(dòng)取樣裝置、液體處理
裝置、分配器、電極陣列、機(jī)器人或其任何組合。 根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，接觸是在體外進(jìn)行。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，接觸是在離體情況下進(jìn)行。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，樣品包含不多于500個(gè)細(xì)胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，活檢樣品包含不少于10個(gè)細(xì)胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，酶是堿性磷酸酶。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，底物是對(duì)氨基苯磷酸(p-APP)。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，癌細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，測(cè)定是用電化學(xué)電解池來(lái)進(jìn)行。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，測(cè)定是在多孔陣列中進(jìn)行。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，多孔陣列的各孔包含電化學(xué)電解池。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再一些特征，多孔陣列的各孔是納升體積的孔 (nano-volume well)。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再 化學(xué)物、碳水化合物、脂質(zhì)及其組合。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中的再
本發(fā)明通過(guò)提供癌細(xì)胞的電學(xué)檢測(cè)方法而成功克服了目前已知配置的缺陷。
除非另有說(shuō)明，否則本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人 員公知的含義。盡管在本發(fā)明實(shí)踐或試驗(yàn)中可采用類似于或等同于本文所述的方法與材 料，但是合適方法與材料如下所述。本文所提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考 文獻(xiàn)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。在有矛盾的情況下，以包括定義在內(nèi)的本專利說(shuō)明書 為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例僅為說(shuō)明性、而非限制性的。
附圖簡(jiǎn)述 參考附圖，僅以舉例方式描述本發(fā)明。具體參考附圖而言，強(qiáng)調(diào)的是具體的顯示是 以舉例方式并僅用于說(shuō)明性討論本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的目的，并且是為了提供據(jù)信是對(duì)本 發(fā)明原理和概念方面的最有用且最易理解的描述。就此而言，并未顯示超出對(duì)本發(fā)明基本 理解所需的更詳細(xì)的本發(fā)明結(jié)構(gòu)性細(xì)節(jié)，根據(jù)描述和附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是
本發(fā)明的幾種形式是怎樣在實(shí)踐中實(shí)施的。
在附圖中

圖1A-C是描述HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)BA、磷酸丁?；柞ザ阴ズ投∷嵝挛祯Ｑ?基甲酯的反應(yīng)的曲線圖。用電化學(xué)陣列芯片產(chǎn)生對(duì)堿性磷酸酶活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)的電流反應(yīng)曲 線。使HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞接觸以下分化劑丁酸(2. 5慮)-圖1A，磷酸丁?；柞ザ阴ズ?丁酸新戊酰氧基甲酯(50 ii M)-分別為圖1B和圖1C。將HT-29細(xì)胞和底物PAPP放入芯片 上的100nL體積的電化學(xué)小室中。用電流測(cè)量技術(shù)在220mV測(cè)定電流。誤差估計(jì)(5次重 復(fù))為2nA RMS。 圖2A-C是顯示每份樣品中細(xì)胞數(shù)的照片。
些特征，藥物包括試驗(yàn)組合物。
-些特征，試驗(yàn)組合物選自多核苷酸、多肽、小分子
些特征，藥物包括試驗(yàn)條件。 些特征，試驗(yàn)條件是輻射條件。 些特征，細(xì)胞是完整的。 些特征，癌細(xì)胞是完整的。 些特征，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 些特征，癌細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
圖2D-F顯示的是樣品酶活性與細(xì)胞數(shù)的曲線圖。誤差估計(jì)(5次重復(fù))為3nA RMS。 圖3是柱狀圖，描述HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞數(shù)與所誘導(dǎo)的堿性磷酸酶活性之間的關(guān)系。 活性用電流/時(shí)間來(lái)表示。每個(gè)結(jié)果代表3次測(cè)量的平均值。用電流測(cè)量技術(shù)在220mV測(cè) 定電流。 圖4A-C顯示用磷酸丁?；柞ザ阴?duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行8小時(shí)處理的效果圖。圖 4A是柱狀圖，描述堿性磷酸酶電流信號(hào)的斜率。圖4B-C顯示的是，對(duì)不同數(shù)量的處理(圖 4B)和未處理(圖4C)細(xì)胞而言，電流隨時(shí)間的變化圖。 圖5A-C顯示用磷酸丁?；柞ザ阴?duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行78小時(shí)處理的效果圖。 圖5A是柱狀圖，描述堿性磷酸酶電流信號(hào)的斜率。圖5B-C顯示的是，對(duì)不同數(shù)量的處理 (圖5B)和未處理(圖5C)細(xì)胞而言，電流隨時(shí)間的變化圖。 圖6A-C顯示用磷酸丁?；柞ザ阴?duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行96小時(shí)處理的效果圖。 圖6A是柱狀圖，描述堿性磷酸酶電流信號(hào)的斜率。圖6B-C顯示的是，對(duì)不同數(shù)量的處理 (圖6B)和未處理(圖6C)細(xì)胞而言，電流隨時(shí)間的變化圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述 本發(fā)明涉及癌細(xì)胞的檢測(cè)方法。具體地講，本發(fā)明可用于診斷癌癥，監(jiān)測(cè)治療，確 定治療方案和開(kāi)發(fā)針對(duì)疾病的新型治療模式。 參考附圖和所附說(shuō)明，可以更好地理解本發(fā)明方法的原理和操作。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)當(dāng)知道，以下實(shí)施例中的描述或 舉例說(shuō)明所給出的細(xì)節(jié)并不限制本發(fā)明的應(yīng)用?？梢杂闷渌鼘?shí)施方案或不同方式來(lái)實(shí)施或 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。另外，應(yīng)當(dāng)知道，本文所用的措詞和術(shù)語(yǔ)都用于描述的目的，不應(yīng)視為限制性。
分化治療集中在通過(guò)迫使癌細(xì)胞重新恢復(fù)成熟過(guò)程而誘導(dǎo)癌細(xì)胞變?yōu)檎＜?xì)胞。 各種標(biāo)記物已用于監(jiān)測(cè)接受分化治療的患者的手段。 一種這樣的標(biāo)記物就是堿性磷酸酶， 其中該酶的表達(dá)看來(lái)與細(xì)胞分化狀態(tài)有關(guān)。 一般而言，正常酶活性表明，作為特定藥物治療 結(jié)果，細(xì)胞適當(dāng)?shù)胤只?；而缺乏酶活性則表明，對(duì)于特定癌癥和/或特定患者而言是無(wú)效藥 物治療。 然而，對(duì)這類標(biāo)記物，尚無(wú)方法能快速簡(jiǎn)便而高靈敏度、高選擇性和高精度地進(jìn)行 檢測(cè)。 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)出新的電化學(xué)方法，用于靈敏而高通量地檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì) 分化治療的反應(yīng)。 在將本發(fā)明付諸實(shí)施的時(shí)候，本發(fā)明的發(fā)明人就已經(jīng)知道可以使用p-APP等電化 學(xué)底物來(lái)進(jìn)行酶的電流測(cè)量法，以便確定分化劑的有效性。如圖l所示，用本發(fā)明方法評(píng)價(jià) 了 3種分化劑對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的有效性。使用含小型電化學(xué)電解池陣列的芯片，本發(fā)明的 發(fā)明人能夠以高靈敏度、高精度和快速方式來(lái)監(jiān)測(cè)這些分化治療劑對(duì)極少量細(xì)胞樣品(少 于 15個(gè)細(xì)胞)的有效性(圖2A-F和圖3)。 在5分鐘內(nèi)，可用分辨率為10毫微安培的電流反應(yīng)測(cè)定藥物效果。此外，這些結(jié)
果表明所誘導(dǎo)的電流信號(hào)與納升體積的小室內(nèi)癌細(xì)胞計(jì)數(shù)之間的數(shù)量關(guān)系。 在臨床相關(guān)樣品中采用納升體積的分析設(shè)備很令人感興趣，因?yàn)橹恍枰苌倭拷M
織進(jìn)行診斷，而且還能進(jìn)行高通量分析并比較不同藥物對(duì)同一腫瘤樣品的效果，同時(shí)還能保持均一的生物條件和環(huán)境條件。另外，這一新方法有助于針對(duì)個(gè)別患者來(lái)定制癌癥藥物 和治療，成為"個(gè)性化醫(yī)療"。 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供癌細(xì)胞的檢測(cè)方法。方法包括在酶催化細(xì)胞與 底物反應(yīng)的條件下，使細(xì)胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號(hào)的產(chǎn)物，然后測(cè)定電信 號(hào)水平，其中電信號(hào)水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細(xì)胞的標(biāo)志。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"是指檢測(cè)、診斷、檢查、發(fā)現(xiàn)、揭示、觀察或鑒定細(xì)胞的行動(dòng)。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"是指哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人體細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，可使用單 細(xì)胞以及多個(gè)細(xì)胞。優(yōu)選多個(gè)細(xì)胞包含不少于10個(gè)細(xì)胞，且不多于500個(gè)細(xì)胞。優(yōu)選地， 細(xì)胞是在單個(gè)懸浮液中，這樣可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，盡管也可檢測(cè)粘附細(xì)胞和聚集物。多個(gè) 細(xì)胞可來(lái)自任何生物樣品，例如細(xì)胞系、原代培養(yǎng)物和細(xì)胞樣品，例如活檢樣品(手術(shù)活檢 樣品，包括切除或截除的活檢物、細(xì)針吸出物等)、完整切除物或體液。提取活檢樣品的方法 是本領(lǐng)域眾所周知的。 無(wú)需任何預(yù)處理，就可以評(píng)價(jià)生物樣品中細(xì)胞的功能酶。因此，生物樣品中的細(xì)胞 優(yōu)選是完整的(即整個(gè)細(xì)胞)，并且優(yōu)選是活的，盡管可以理解，本發(fā)明也包括對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 預(yù)處理，例如產(chǎn)生細(xì)胞提取物或非完整細(xì)胞。"癌細(xì)胞"，本文亦稱"惡性細(xì)胞"，是指已從正常細(xì)胞分裂控制中釋放出來(lái)的細(xì)胞， 因而其特性是異常生長(zhǎng)并趨向于以非受控方式增殖，在某些情況下還會(huì)轉(zhuǎn)移。因此，癌細(xì)胞 可以是贅生性細(xì)胞、惡性前細(xì)胞(pre-malignant cell)、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、致癌細(xì)胞、 具有癌基因型的細(xì)胞、惡性表型的細(xì)胞、癌基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞、病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞、表達(dá)癌基因的細(xì) 胞、表達(dá)癌癥標(biāo)記物的細(xì)胞或其組合。 可以用本發(fā)明方法檢測(cè)的癌細(xì)胞的非限制性實(shí)例是腺癌細(xì)胞、腎上腺腫瘤細(xì) 胞、成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞、退行性細(xì)胞(an即lastic cell)、甲狀腺細(xì)胞的退行性癌、血管纖 維瘤細(xì)胞、血管瘤細(xì)胞、血管肉瘤細(xì)胞、胺前體攝取脫羧細(xì)胞瘤細(xì)胞(apudoma cell)、 嗜銀細(xì)胞瘤細(xì)胞(argentaffmoma cell)、卵巢男胚瘤細(xì)胞、腹水腫瘤細(xì)胞(ascites t咖orcell)、腹水瘤細(xì)胞(ascitic tumor cell)、星形母細(xì)胞瘤細(xì)胞、星形細(xì)胞瘤細(xì)胞、 共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張細(xì)胞、前房粘液瘤細(xì)胞(atrial myxomacell)、基底細(xì)胞癌細(xì) 胞、良性腫瘤細(xì)胞、骨癌細(xì)胞、骨瘤細(xì)胞、腦干膠質(zhì)瘤細(xì)胞、腦瘤細(xì)胞、乳癌細(xì)胞、伯基特淋 巴瘤細(xì)胞(Burkitt' slymphoma cell)、癌性細(xì)胞(cancerous cell)、類癌細(xì)胞、癌細(xì)胞 (carcinomacell)、小腦星形細(xì)胞瘤細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、櫻桃狀血管瘤細(xì)胞、膽管癌細(xì)胞、 膽管瘤細(xì)胞、軟骨母細(xì)胞瘤細(xì)胞、軟骨瘤細(xì)胞、軟骨肉瘤細(xì)胞、成絨毛膜細(xì)胞瘤細(xì)胞、絨毛 膜癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、常見(jiàn)急性成淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞、顱因管瘤細(xì)胞、囊性癌細(xì)胞、 囊性纖維瘤細(xì)胞(cystofbroma cell)、囊瘤細(xì)胞、細(xì)胞瘤細(xì)胞、腺管原位癌細(xì)胞、腺管乳 頭瘤細(xì)胞(ductal papilloma cell)、無(wú)性細(xì)胞瘤細(xì)胞、腦瘤細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、內(nèi) 皮瘤細(xì)胞、室管膜瘤細(xì)胞、上皮瘤細(xì)胞、紅白血病細(xì)胞、尤因肉瘤細(xì)胞(Ewing' s sarcoma cell)、外結(jié)節(jié)淋巴瘤細(xì)胞(extranodal lymphoma cell)、貓科肉瘤細(xì)胞、纖維腺瘤細(xì) 胞(fibro adenomacell)、纖維肉瘤細(xì)胞(fibro sarcoma cell)、甲狀腺濾泡癌細(xì)胞、神 經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞、胃泌素瘤細(xì)胞、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、成性 腺細(xì)胞瘤細(xì)胞、成血管細(xì)胞瘤細(xì)胞(haemangioblastomacell)、成血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤細(xì)胞(haemangioendothelioblastoma cell)、血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤細(xì)胞(haemangioendothelioma cell)、血管夕卜皮細(xì)胞瘤細(xì)胞(haemangiopericytoma cell)、血f林巴管瘤細(xì)胞 (haematolymphangiomacell)、成血細(xì)胞瘤細(xì)胞(haemocytoblastoma cell)、血細(xì)胞瘤細(xì)胞 (haemocytoma cell)、毛細(xì)胞白血病細(xì)胞、錯(cuò)構(gòu)瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、肝細(xì)胞瘤 細(xì)胞、組織瘤細(xì)胞、霍奇金病細(xì)胞(Hodgkin'sdisease cell)、腎上腺樣瘤細(xì)胞、浸潤(rùn)性癌細(xì) 胞、浸潤(rùn)性腺管細(xì)胞癌細(xì)胞、胰島素瘤細(xì)胞、幼年血管纖維瘤細(xì)胞(juvenile angioforoma cell)、卡波西肉瘤細(xì)胞、腎瘤細(xì)胞、大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、慢性白血病細(xì)胞、急性 白血病細(xì)胞、脂肪瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞、呂克癌細(xì)胞(Lucke carcinoma cell)、淋 巴腺瘤細(xì)胞、淋巴管瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞瘤 細(xì)胞(lymphoeytoma cell)、淋巴水腫細(xì)胞(lymphoedema cell)、淋巴瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、 惡性間皮瘤細(xì)胞、惡性畸胎瘤細(xì)胞、肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、腦 膜瘤細(xì)胞、間皮瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)移性細(xì)胞(metastatic cell)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞(metastasis cell)、 轉(zhuǎn)移擴(kuò)散細(xì)胞(metastatic spread cell)、摩頓神經(jīng)瘤細(xì)胞(Morton' s neuroma cell)、 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、成髓細(xì)胞瘤細(xì)胞、髓性白血病細(xì)胞、骨髓脂肪瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、成 肌細(xì)胞瘤細(xì)胞、粘液瘤細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、贅生性細(xì)胞(neoplastic cell)、腎胚細(xì)胞瘤細(xì) 胞、成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞、神經(jīng)纖維瘤病細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、神經(jīng)瘤細(xì) 胞、非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞(Non-Hodgkin' s lymphoma cell)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、視神 經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、骨軟骨瘤細(xì)胞、成骨肉瘤細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、乳頭細(xì)胞的佩吉 特病(Paget' s disease of the nipple cell)、潘禾斗其jf特月中瘤細(xì)胞(pancoast tumor cell)、胰腺癌細(xì)胞、暗色素細(xì)胞瘤細(xì)胞(phaeochromocytoma cell)、嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞 (pheoehromocytoma cell)、漿細(xì)胞瘤細(xì)胞、原發(fā)性腦瘤細(xì)胞、錯(cuò)構(gòu)瘤細(xì)胞、催乳素瘤細(xì)胞、 腎細(xì)胞癌細(xì)胞、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞、橫紋肌肉瘤細(xì)胞(rhabdomyosarcomacell)、橫紋肌肉 瘤細(xì)胞(rhabdosarcoma cell)、實(shí)體瘤細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、繼發(fā)性腫瘤細(xì)胞、精原細(xì)胞瘤細(xì)胞、 皮膚癌細(xì)胞、小細(xì)胞癌細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、草莓狀血管瘤細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、畸胎 瘤細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、胸腺瘤細(xì)胞、滋養(yǎng)層腫瘤細(xì)胞、致瘤細(xì)胞(tumorigeniccell)、腫瘤發(fā) 生細(xì)胞(tumor initiation cell)、月中瘤發(fā)展細(xì)胞(tumorprogression cell)、前庭神經(jīng)銷 瘤細(xì)胞、維爾姆斯瘤細(xì)胞(Wilm' s tumorcell)或它們的組合。
根據(jù)本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方案，癌細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞。 如上所述，本發(fā)明的方法是通過(guò)使酶的底物與細(xì)胞接觸、引起細(xì)胞反應(yīng)而進(jìn)行的， 其中酶促反應(yīng)產(chǎn)物能夠產(chǎn)生電信號(hào)。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞反應(yīng)"是指底物與細(xì)胞所表達(dá)的內(nèi)源性酶之間發(fā)生的反應(yīng)， 而不是與外源性酶發(fā)生的反應(yīng)。 根據(jù)需要檢測(cè)的酶(在本文也稱為"標(biāo)記酶")來(lái)選擇底物。酶可位于細(xì)胞內(nèi)(即 胞內(nèi)酶)或細(xì)胞膜上(即膜結(jié)合酶)。根據(jù)另一實(shí)施方案，酶是分泌酶?？梢岳斫?，當(dāng)待檢 測(cè)的酶是胞內(nèi)酶時(shí)，優(yōu)選底物是膜滲透性的。此外，優(yōu)選選擇底物，使得在催化后，所生成的 產(chǎn)物也是膜滲透性的，使得它可從細(xì)胞中擴(kuò)散出來(lái)并到達(dá)檢測(cè)電極。 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，需要檢測(cè)的酶是堿性磷酸酶(或分泌型堿性磷酸酶(SEAP))， 而底物是17，4-氨基苯磷酸(p-APP)。堿性磷酸酶使p-APP轉(zhuǎn)化為電化學(xué)產(chǎn)物，即對(duì)氨基苯 酚(PAP)。
p-APP是一種普通的市售產(chǎn)品，可得自Sigma-Aldrich公司(www. sigmaaldrich. com) 、 Bio-world公司(www. Bio-world, com)禾口許多其他公司。 堿性磷酸酶存在于正常細(xì)胞中，但在癌細(xì)胞中減少(或甚至不存在)。因此，對(duì)細(xì) 胞的堿性磷酸酶活性水平進(jìn)行分析，可用作評(píng)價(jià)特定藥物有效性的標(biāo)記，可用于治療癌癥 乃至用于診斷目的。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"接觸"是指在底物可被酶催化的條件下，使底物接近細(xì)胞。因此， 例如應(yīng)在緩沖劑條件下，在允許催化底物并生成電化學(xué)電解池所檢測(cè)的足夠的產(chǎn)物的溫度 和時(shí)間下進(jìn)行接觸。例如，當(dāng)p-APP用作底物時(shí)，優(yōu)選在室溫下接觸至少5分鐘_參見(jiàn)以下 實(shí)施例2和實(shí)施例3。 可在體外、離體或體內(nèi)進(jìn)行接觸?？稍谌萜髦羞M(jìn)行接觸，該容器也能檢測(cè)酶促反應(yīng) 產(chǎn)物(即在電化學(xué)電解池中)，這樣就可在線檢測(cè)電信號(hào)。下文將進(jìn)一步介紹這樣的容器。 或者，可在分離的容器中進(jìn)行接觸，從中進(jìn)行檢測(cè)，使得能夠在特定時(shí)間點(diǎn)連續(xù)取樣并將所 取樣品放入電化學(xué)電解池內(nèi)。因此，可在試管、燒瓶、組織培養(yǎng)器、芯片、陣列、板、微量板、毛 細(xì)管等中進(jìn)行接觸。可將細(xì)胞放在振動(dòng)板上，再加入底物，用于連續(xù)充分混合細(xì)胞內(nèi)容物。
如上所述，在化學(xué)電解池的電極上對(duì)能經(jīng)歷氧還反應(yīng)(即能進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移)而得 到電信號(hào)的產(chǎn)物(即電化學(xué)產(chǎn)物)進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量，通常是在電化學(xué)電解池中進(jìn)行。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"電信號(hào)"是指電子或電化學(xué)活性物。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"電化學(xué)測(cè)量"是指通過(guò)使用溶液中的、尤其是電化學(xué)電解池中的 電極來(lái)進(jìn)行的測(cè)量。可通過(guò)例如定時(shí)電流法、定時(shí)電位法、循環(huán)伏安法、定時(shí)庫(kù)侖法或方波 伏安法，來(lái)進(jìn)行測(cè)量。在這樣的測(cè)量中可檢測(cè)的信號(hào)，與在這些電化學(xué)測(cè)量中來(lái)自對(duì)照的信 號(hào)是不同的。 對(duì)于在線測(cè)量，本發(fā)明的電化學(xué)電解池包括測(cè)量電極、返回電極(return electrode)、參考電極和容納電解池的小室。 工作電極具有各種不同類型，例如可由碳(包括玻璃碳、活性碳布電極、碳?xì)帧K
化碳布、平紋碳布)制成，也可由金、鉑或銀制成。對(duì)電極也可由與工作電極相同的材料制
成。參考電極可以是例如飽和甘滎電極，可以是Ag/AgCl電極。此夕卜，電極可以是絲網(wǎng)印刷
電極，其可插入到含電解池的容器中，而無(wú)需取出樣品并轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的電化學(xué)電解池中。 用于按照本發(fā)明方法測(cè)定產(chǎn)物的電極可以是可重復(fù)使用的電極或一次性電極。可
重復(fù)使用的電極可以是例如由玻璃碳制成的盤狀或棒狀電極，其可嵌入特氟隆中。 一次性
電極可以是例如呈碳紙、碳布、碳?xì)中问降碾姌O或上述種類的絲網(wǎng)印刷電極。 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，電化學(xué)電解池是三電極電解池。根據(jù)另一實(shí)施方案，電化學(xué)電
解池是兩電極電解池。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，可以陣列(即芯片)形式提供電化學(xué)電解池，
所述陣列包含多個(gè)這樣的電解池即多孔陣列，其中各孔的大小是納升體積。 用于測(cè)定由反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生的電信號(hào)的系統(tǒng)還可包括控制模塊，其可以是計(jì)算機(jī)、
恒電位儀和復(fù)用器模塊(multiplexer module)，復(fù)用器模塊在同時(shí)測(cè)量多個(gè)電化學(xué)電解池
的典型實(shí)施方案的情況下是需要的。 參考定時(shí)電流模式，將描述在電解池中進(jìn)行的電化學(xué)測(cè)量。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)其加以必 要的修正，也可用于上述其它電化學(xué)測(cè)量模式。此外，參考使用多電極系統(tǒng)(包含多個(gè)電極 的系統(tǒng))，可進(jìn)行描述，并且顯然也可用于含單個(gè)電解池的系統(tǒng)。
在電化學(xué)測(cè)量開(kāi)始，一起操作所有電極，計(jì)算機(jī)通過(guò)并聯(lián)端口掃描所有電極，并通 過(guò)計(jì)算機(jī)記錄針對(duì)各電極施用電位時(shí)的背景響應(yīng)。在一段長(zhǎng)時(shí)間中，可進(jìn)行完整的電化學(xué) 測(cè)量程序，同時(shí)測(cè)量因產(chǎn)物濃度改變而產(chǎn)生的電流。在電極表面因天然變異性所導(dǎo)致的不 相同的情況下，可通過(guò)測(cè)量電活性物(尤其是與電化學(xué)電解池中的酶促反應(yīng)產(chǎn)物相同種 類)的氧化或還原并比較所有電極結(jié)果，來(lái)標(biāo)定系統(tǒng)。 在進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可將電極與恒電位儀相連接，并同時(shí)也通過(guò)復(fù)用器聚集到微機(jī)并 聯(lián)端口。 將各電極插入到含參考電極和反電極的電化學(xué)電解池中，這些電極也與恒電位儀 相連接。通過(guò)恒電位儀將特定電位施加在電極上(所有電極可以施加相同電位，或者每個(gè) 電極施加不同電位)并檢測(cè)各電極的電流。在計(jì)算機(jī)屏幕上可實(shí)時(shí)觀察電信號(hào)。
因?yàn)槊复俜磻?yīng)的電化學(xué)產(chǎn)物所產(chǎn)生的電信號(hào)反映出細(xì)胞中的酶水平，而且酶(其 存在、不存在或水平)是癌癥的標(biāo)記物，所以信號(hào)可用于確定細(xì)胞是否癌變(即惡性)。具 體地講，如果所產(chǎn)生的電信號(hào)水平與預(yù)定閾值不同，則表明細(xì)胞是癌細(xì)胞。通常，預(yù)定閾值 是通過(guò)對(duì)照細(xì)胞所產(chǎn)生的電信號(hào)來(lái)確定的。 對(duì)照細(xì)胞可以是正常分化細(xì)胞、非癌變細(xì)胞，優(yōu)選與懷疑癌變或未分化表型的被 測(cè)細(xì)胞同屬相同組織和樣本。與對(duì)照細(xì)胞相比，優(yōu)選差異至少為10%、20%、30%、40%、 50%、80%、100% (即2倍)、3倍、5倍或10倍。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，癌細(xì)胞中的酶含量(和由此而來(lái)的電信號(hào))低于非 癌細(xì)胞中的酶含量(和由此而來(lái)的電信號(hào))。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，癌細(xì)胞中的酶含量(和由此而來(lái)的電信號(hào))高于
非癌細(xì)胞中的酶含量(和由此而來(lái)的電信號(hào))。 可以理解，本發(fā)明的方法可用于診斷癌癥患者。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"診斷"是指對(duì)癌癥進(jìn)行分類，確定癌癥的嚴(yán)重程度(分級(jí)或分 期)，監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)展，預(yù)測(cè)癌癥的結(jié)果和/或痊愈的希望。 受試者可以是經(jīng)過(guò)常規(guī)健康檢查的健康動(dòng)物或人類受試者?；蛘撸茉囌呖梢允?處于癌癥危險(xiǎn)中的患者(例如具有遺傳傾向的受試者，具有病史和/或家族史的受試者， 已接觸致癌物、職業(yè)危害、環(huán)境危害的受試者，和/或表現(xiàn)出可疑癌癥臨床癥狀(例如便血 或黑便、不明原因的疼痛、出汗、不明原因的發(fā)熱、不明原因的體重減輕至厭食、腸習(xí)性改變 (便秘和/或腹瀉)、里急后重(感覺(jué)排便不完全，尤其是對(duì)于直腸癌而言)、貧血和/或全 身乏力)的受試者。 可以理解，本發(fā)明具有涉及以下的各種用途個(gè)性化優(yōu)化癌癥治療，監(jiān)測(cè)患者的抗 癌治療，測(cè)定患者的抗癌治療和鑒定能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性表型的藥物。 因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性表型的藥物的鑒定方法。方法 包括使至少一個(gè)癌細(xì)胞接觸藥物并測(cè)定抗癌藥的效果，即按照本發(fā)明的方法來(lái)監(jiān)測(cè)標(biāo)記酶 (例如堿性磷酸酶)的活性或表達(dá)。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"逆轉(zhuǎn)惡性表型"是指至少部分地逆轉(zhuǎn)惡性細(xì)胞的增殖和/或侵 襲性。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"藥物"是指包含生物制劑或化學(xué)制劑的試驗(yàn)組合物。 經(jīng)本發(fā)明的方法測(cè)試為潛在抗癌藥的生物制劑的實(shí)例包括但不限于核酸(例如多核苷酸、核酶、siRNA和反義分子(包括但不限于RNA、 DNA、 RNA/DNA雜合體、肽核酸以及 具有改變的主鏈和/或基本結(jié)構(gòu)(bass structure)或其它化學(xué)修飾的多核苷酸類似物)； 蛋白質(zhì)、多肽(例如肽)、碳水化合物、脂質(zhì)和"小分子"候選藥物。"小分子"可以例如是天 然存在的化合物(例如衍生自植物提取物、微生物肉湯等的化合物)或合成的有機(jī)化合物 或有機(jī)金屬化合物，其分子量小于約10， 000道爾頓，優(yōu)選小于約5， 000道爾頓，最優(yōu)選小于 約1， 500道爾頓。 根據(jù)本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方案，藥物可以是分化劑，包括但不限于丁酸及其 衍生物。 經(jīng)本發(fā)明方法測(cè)試為潛在抗癌藥的條件的實(shí)例包括但不限于輻射暴露(例如Y 輻射、紫外輻射、X射線)。 根據(jù)本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案，也可在接觸藥物之前對(duì)"標(biāo)記酶"進(jìn)行測(cè)定分 析，從而可在治療前后進(jìn)行比較。 根據(jù)本發(fā)明該方面的另一實(shí)施方案，使藥物接觸癌細(xì)胞足夠長(zhǎng)時(shí)間，以產(chǎn)生抗癌 效果。因此，例如如果是分析丁酸和/或其衍生物的話，優(yōu)選這些藥物接觸癌細(xì)胞的時(shí)間至 少為l天，更優(yōu)選為3天。 可以理解，可以使藥物在體外、離體或體內(nèi)接觸癌細(xì)胞。如果接觸是在體內(nèi)進(jìn)行， 通常在接觸本發(fā)明底物之前，將細(xì)胞從患者體內(nèi)取出。 在理論上，盡管可用單個(gè)電化學(xué)電解池實(shí)施本發(fā)明，但是這樣的方法既無(wú)效果又 不合乎要求。優(yōu)選本發(fā)明的方法使用多個(gè)電化學(xué)電解池同時(shí)篩選不同藥物，用于高通量藥 物篩選。電解池可以是芯片的組成部分，所述芯片例如以下實(shí)施例1所述的硅芯片。
因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，采用高通量方式實(shí)施本發(fā)明的方法。因此，可使用例如 自動(dòng)取樣裝置、液體處理裝置、分配器、電極陣列、機(jī)器人或其任何組合，來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方 法。 目前已經(jīng)知道，僅根據(jù)腫瘤類型和解剖學(xué)位置是無(wú)法預(yù)測(cè)腫瘤治療反應(yīng)的?？梢?理解，可以修改能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性表型的藥物的鑒定方法，使得特定患者細(xì)胞可用于測(cè)定系
統(tǒng)，因而可定制針對(duì)特定患者的治療藥。此外，可以理解，用本發(fā)明的方法不僅可選擇具體 藥物，而且還可根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)鑒定最佳劑量和最佳治療方案。采用這樣的方式，可以 確定藥物的治療有效量。 可根據(jù)本發(fā)明方法所選擇的最佳治療條件來(lái)治療患者，并任選在合適的時(shí)間周期 之后進(jìn)行復(fù)檢。采用這樣的方式，可以在治療進(jìn)行期間連續(xù)監(jiān)測(cè)患者的反應(yīng)。
可以理解，在治療期間，對(duì)酶水平的分析和給藥步驟可重復(fù)多次。例如可以每周分 析堿性磷酸酶水平，然后給予藥物。如果堿性磷酸酶水平比對(duì)照高，就減少藥物劑量。如果 堿性磷酸酶水平比對(duì)照低，就增加藥物劑量。 可以理解，可在藥盒中提供本發(fā)明的電化學(xué)電解池以及至少一種抗癌藥(例如分
化劑，例如丁酸)，用于測(cè)定其對(duì)癌細(xì)胞的效果。如有必要，本發(fā)明的藥盒可以呈包裝形式， 其可含有本發(fā)明藥盒的一個(gè)或多個(gè)單位。包裝中可帶有藥盒的使用說(shuō)明書和抗癌藥對(duì)具體
細(xì)胞數(shù)的估計(jì)劑量。包裝中也可帶有由政府機(jī)構(gòu)對(duì)實(shí)驗(yàn)室添加物(laboratorysupplement) 的制造、使用或銷售所規(guī)定的、與該包裝容器有關(guān)的信息，這種信息表明政府機(jī)構(gòu)許可所述 組合物的形式。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，藥盒還可包含底物，所述底物被生物細(xì)胞(即癌細(xì)胞)的標(biāo)記 酶催化而進(jìn)行酶促反應(yīng)以生成反應(yīng)產(chǎn)物，從而在電化學(xué)電解池的電極上發(fā)生氧還反應(yīng)。這 樣的底物在上文已有描述。 在本專利有效期間，預(yù)計(jì)將會(huì)開(kāi)發(fā)出許多相關(guān)底物，并且底物這一術(shù)語(yǔ)的范圍包 括所有這類新技術(shù)成果(all such new technologies apriori)。 根據(jù)以下非限制性實(shí)施例，本發(fā)明的額外目的、優(yōu)勢(shì)和新特征將是本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。另外，以上所述的和以下權(quán)利要求書部分要求保護(hù)的本發(fā)明各實(shí)施方 案和方面，在以下實(shí)施例中都可找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例 下面給出了以下實(shí)施例的參考文獻(xiàn)，這些參考文獻(xiàn)連同以上描述一起，以非限制 性方式說(shuō)明本發(fā)明。 通常，本文所用的命名法和本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子技術(shù)、生物化學(xué)技 術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分解釋。參見(jiàn)例如"Molecular Cloning :A laboratory Maruml，，S咖brook等(1989) ;"Current Protocols in Molecular Biology，，第I-III巻，Ausubel， R. M.編著(1994) ;Ausubel等，"Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ;Perbal， "A Practical Guide to Molecular Cloning，，， John Wiley&Sons， New York(1988); Watson等，"Recombinant DNA，，, Scientific AmericanBooks， New York ;Birren等(編 著)"Genome Analysis :A LaboratoryMa皿al Series，，，第1-4巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork(1998);美國(guó)專利號(hào)4,666,828 ;4,683,202 ;4,801,531 ; 5， 192， 659和5， 272， 057中記載的方法;"Cell Biology :A Laboratory Handbook",第 I-III巻，Cellis， J. E.編著(1994) ;"Culture of Animal Cells-A Ma麗l ofBasic Technique", Freshney， Wiley-Liss， N. Y. (1994)， 第3片反；"Cur:rentP:rotocols in Immunology"第I-III巻，Coligan J. E.編著(1994) ;Stites等(編著)，"Basic and Clinical Immunology"(第8版)，Appleton&Lange， Norwalk， CT(1994) ;Mishell禾口 Shiigi(編 著)，"Selected Methods inCellular Immunology", W. H. Freeman and Co. ， New York(1980);有用的免疫測(cè)定在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中有廣泛深入描述，參見(jiàn)例 如美國(guó)專利號(hào)3， 791， 932 ;3， 839， 153 ;3， 850， 752 ;3， 850， 578 ;3， 853， 987 ;3， 867， 517 ; 3， 879， 262 ;3， 901， 654 ;3， 935， 074 ;3， 984， 533 ;3， 996， 345 ;4， 034， 074 ;4， 098， 876 ; 4， 879， 219 ;5， 011， 771和5， 281， 521 ;"01igonucleotideSynthesis"Gait， M. J.編著 (1984) ;"Nucleic Acid Hybridization" Hames， B. D.禾P Higgins S.J.編著(1985); "Transcription and Translation" Hames， B. D.禾口 Higgins S.J.編著(1984) ;"Animal Cell Culture" Freshney， R. I. 編著 (1986) ;"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ;"APractical Guide to Molecular Cloning"Perbal， B. ， (1984); 禾口 "Methods inEnzymology，， 第 1-317巻，Academic Press ;"PCR Protocols :A Guide ToMethods and Applications", Academic Press, San Diego， CA(1990) ;Marshak等， "Strategies for Protein Purification and Characterization-Al^boratory Course Ma皿al"CSHL Press (1996);所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。本文全文提供了其它的一般性參考文獻(xiàn)。其中的方法據(jù)信在本領(lǐng)域是眾所周知的并且為了讀者方便而提
供。其中所含所有信息都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。 實(shí)施例1 納米生物芯片的制備 利用標(biāo)準(zhǔn)微系統(tǒng)技術(shù)(micro-system-technology, MST)方法，設(shè)計(jì)并制造出了納 米生物芯片(nano-bio-chip)。其構(gòu)造包括小型電化學(xué)電解池陣列。將電解池放入納升體 積的小室(即電化學(xué)電解池)中。每個(gè)圓柱狀小室容納100nL體積。所有陣列都包括陽(yáng)性 和陰性對(duì)照小室。 裝置分兩部分來(lái)制備a) —次性芯片其具有納升小室，其中放入了電解池 (cell)，和b)可重復(fù)使用芯片其與包括復(fù)用器、恒電位儀、溫度控制和袖珍型PC在內(nèi)的電 子電路相連接，用于傳感和數(shù)據(jù)分析。這套設(shè)置允許連續(xù)重復(fù)使用，用于多次測(cè)量。
芯片由硅制成，并含有8個(gè)小型電化學(xué)電解池陣列。每個(gè)電化學(xué)電解池由以下3 個(gè)圓形、周圍有絕緣氮化硅層的電極組成1)金工作電極，2)金反電極和3)Ag/AgCl參考 電極。電極是通過(guò)金濺射、顯微光刻技術(shù)(microlithography)和選擇性沉積Ag而制成，而 對(duì)于參考電極，還要使其在含氯溶液中陽(yáng)極化。小室壁是由光聚合的聚酰亞胺構(gòu)成(SU-8) (圖1A-B)。硅芯片通過(guò)導(dǎo)線與塑料芯片連接，后者接入電子電路。 通過(guò)接入電子電路的手持式掌上恒電位儀進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，用于電極信號(hào)的調(diào)制和 檢測(cè)(Palm Instruments BV-2004)。該電子儀器是由具有溫度控制的電化學(xué)電解池的8個(gè) 獨(dú)立重復(fù)電路組成。在各電化學(xué)電解池的工作電極與參考電極之間施加電位并測(cè)定輸出電 流。 實(shí)施例2-3
通用材料與方法 細(xì)胞系和培養(yǎng)物在37°〇/95%空氣/5%0)2中，將1^-29人結(jié)腸癌細(xì)胞在含胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，然后進(jìn)行丁酸處理。將不同濃度的丁酸加入到HT-29細(xì)胞 培養(yǎng)物中。所用濃度為0mM、0. 078mM、0. 156mM、0. 3125mM、0. 625mM、 1. 25mM、2. 5mM、5mM和 10mM。由此求出最佳丁酸濃度、LC50和活力。測(cè)定在PBS中進(jìn)行，用完整細(xì)胞而沒(méi)有對(duì)癌 細(xì)胞進(jìn)行額外處理(例如溶解細(xì)胞)。 丁酸(BA)及其衍生物將范圍在0. 08-10mM之內(nèi)的丁酸(BA) (Sigma， Israel)加 入到HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中并孵育72小時(shí)，用于優(yōu)化。固定濃度為2. 5mM的BA用于所有電 化學(xué)實(shí)驗(yàn)。如文獻(xiàn)所述，合成BA衍生物即磷酸丁酰基甲酯二乙酯和丁酸新戊酰氧基甲酯 [R印haeliA， Zhuk R， Nudelman A，2000， Drug Develop. Res.第50巻379-391]。將磷酸 丁酰基甲酯二乙酯溶于PBS中，丁酸新戊酰氧基甲酯溶于匿SO中，然后用培養(yǎng)基稀釋至最 終匿S0濃度為《0. 1%。再將固定濃度為50iiM的前體藥物加入到細(xì)胞中并在37t:/95% 空氣/5% C02的條件下孵育96小時(shí)。與分化劑一起孵育之后，通過(guò)錐蟲藍(lán)排出法(tripa blue exclusion)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)并檢測(cè)活力，求出LC50。在所有電化學(xué)測(cè)量之前，將細(xì)胞 離心并在PBS中稀釋。所有測(cè)量都在PBS中進(jìn)行。通過(guò)測(cè)定堿性磷酸酶的酶活性，來(lái)測(cè)定 BA、 丁酸新戊酰氧基甲酯和磷酸丁?；柞ザ阴サ挠绊?。
堿性磷酸酶活性測(cè)定 光學(xué)測(cè)定用光學(xué)底物對(duì)硝基苯磷酸(現(xiàn)成的PNPP試劑盒，Sigma)測(cè)定堿性磷酸酶活性。在420nm波長(zhǎng)處測(cè)定所得酶促產(chǎn)物。 電化學(xué)測(cè)量用電化學(xué)底物p-APP進(jìn)行酶的電流測(cè)量。在220mV下，酶促反應(yīng)產(chǎn)物 氨基苯酚(p-AP)在金工作電極上被氧化，測(cè)量所產(chǎn)生的電流。在8通道100nL體積的電化 學(xué)小室中加入經(jīng)BA或其衍生物處理過(guò)的HT-29癌細(xì)胞。將細(xì)胞放入電化學(xué)小室中，加入底 物至終濃度為lmg/ml，總體積為100nL。測(cè)量所產(chǎn)生的電流并在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。 分析細(xì)胞數(shù)與電流密度之間的關(guān)系。
實(shí)施例2 經(jīng)本發(fā)明生物芯片測(cè)定的藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的效果 為了進(jìn)行個(gè)性化癌癥治療，檢測(cè)各種單一來(lái)源的藥物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)的 影響。 結(jié)果 使HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞與不同分化治療劑接觸96小時(shí)，然后測(cè)定所誘導(dǎo)的堿性磷酸 酶活性。陣列上的各電化學(xué)小室中加入接觸過(guò)不同試劑的細(xì)胞，這些試劑是丁酸、磷酸丁酰 基甲酯二乙酯和丁酸新戊酰氧基甲酯。結(jié)果見(jiàn)圖1A-C。正常酶活性表明，作為特定藥物治 療結(jié)果，細(xì)胞適當(dāng)?shù)胤只Ｈ鐖DlA-C所示，在50iiM濃度時(shí)，BA和磷酸丁?；柞ザ阴フT 導(dǎo)堿性磷酸酶的酶活性，而丁酸新戊酰氧基甲酯卻未誘導(dǎo)出任何酶活性，對(duì)于HT-29癌細(xì) 胞，這可能涉及其潛力降低[M. Entin-Meer等，Molecular Cancer Ther即eutics，第4巻， 第1952-1961頁(yè)，2005 ;D. Engel等，Clinical Cancer Research,第11巻，第9052S-9052S 頁(yè)，2005]。另外，設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照在小室中加入經(jīng)藥物處理的細(xì)胞，未處理細(xì)胞作為 陰性對(duì)照，而純化的堿性磷酸酶作為陽(yáng)性對(duì)照。重要的是，注意到磷酸丁?；柞ザ阴ヅc BA的分化效果類似，盡管前者濃度要低1. 5個(gè)數(shù)量級(jí)，即磷酸丁?；柞ザ阴ズ虰A的濃 度分別為50iiM和2. 5mM。
實(shí)施例3 用生物芯片對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行定量測(cè)定
結(jié)果 測(cè)定所誘導(dǎo)的電流信號(hào)與納升體積小室內(nèi)癌細(xì)胞計(jì)數(shù)之間的顯著的數(shù)量關(guān)系。癌 細(xì)胞計(jì)數(shù)和相對(duì)酶活性見(jiàn)圖2A-F。用電化學(xué)陣列芯片，得到對(duì)堿性磷酸酶活性監(jiān)測(cè)的電流 反應(yīng)曲線。將HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞暴露給丁酸(2. 5mM)。將HT-29細(xì)胞以及底物PAPP放入芯 片中100nL體積的電化學(xué)小室內(nèi)。用電流測(cè)量技術(shù)在220mV測(cè)量電流。上中下3條曲線分 別表示小室內(nèi)計(jì)數(shù)的約100個(gè)細(xì)胞、15個(gè)和0個(gè)細(xì)胞的電流反應(yīng)。多次測(cè)量表明小室內(nèi)細(xì) 胞計(jì)數(shù)與堿性磷酸酶活性之間具有高相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)圖3。定量測(cè)定酶促反應(yīng)的能力是因 為芯片的小型化設(shè)計(jì)，并結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)方法上的優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例4 經(jīng)本發(fā)明生物芯片測(cè)定的磷酸丁?；柞ザ阴?
對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的效果 為了進(jìn)一步檢測(cè)生物芯片的靈敏度，將數(shù)量遞增的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞與磷酸丁酰 基甲酯二乙酯一起孵育不同時(shí)間。用本發(fā)明生物芯片測(cè)定內(nèi)源性堿性磷酸酶的含量。
結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖4A-C、5A-C和6A-C。磷酸丁?；柞ザ阴?duì)癌細(xì)胞的效果隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。另外，可以觀察到，效果的大小與所檢測(cè)細(xì)胞數(shù)有關(guān)。
結(jié)論 已經(jīng)證明了靈敏而高通量檢測(cè)響應(yīng)分化治療的癌細(xì)胞的新方法。就人結(jié)腸癌細(xì)胞
而言，這些細(xì)胞用不同分化治療藥物處理，同時(shí)在線測(cè)量細(xì)胞對(duì)不同藥物的反應(yīng)。這樣的微
陣列技術(shù)提供了在線檢測(cè)多種藥物的能力并能針對(duì)個(gè)體來(lái)定制有效治療。 這樣的"芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)"系統(tǒng)提供了對(duì)極少量樣品(少于 15個(gè)
細(xì)胞)的靈敏的檢測(cè)能力，而且在插入芯片之前無(wú)需進(jìn)行特別的細(xì)胞處理。 可以理解，為了清楚起見(jiàn)，在獨(dú)立的實(shí)施方案內(nèi)容中所描述的本發(fā)明的某些特征，
也可以組合方式在單個(gè)實(shí)施方案中提供。相比之下，為了簡(jiǎn)明起見(jiàn)，在單個(gè)實(shí)施方案中所描
述本發(fā)明的不同特征也可分別或在任何合適的亞組合中提供。 盡管結(jié)合具體的實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，但是很明顯，許多替代、修改和改動(dòng) 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。因此，所有落入所附權(quán)利要求書的精神和寬范圍內(nèi)的這 樣的替代、修改和改動(dòng)都涵蓋在內(nèi)。本說(shuō)明書所提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過(guò) 引用全部結(jié)合到本文中，其程度與每篇出版物、專利和專利申請(qǐng)各自通過(guò)引用結(jié)合到本文 中一樣。另外，在本申請(qǐng)中任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定都不應(yīng)視為承認(rèn)這類參考文獻(xiàn)對(duì)本 發(fā)明是可用的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)癌細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)在酶催化細(xì)胞與底物反應(yīng)的條件下，使所述細(xì)胞與所述酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號(hào)的產(chǎn)物；和(b)測(cè)定所述電信號(hào)水平，其中所述電信號(hào)水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細(xì)胞的標(biāo)志。
2. —種診斷癌癥患者的方法，所述方法包括(a) 在酶催化細(xì)胞與底物反應(yīng)的條件下，使患者樣品中的至少一個(gè)所述細(xì)胞與所述酶 的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號(hào)的產(chǎn)物；禾口(b) 測(cè)定所述電信號(hào)水平，其中所述電信號(hào)水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌癥的標(biāo)志o
3. —種對(duì)癌癥治療進(jìn)行個(gè)性化優(yōu)化的方法，所述方法包括(a) 使患者樣品中的至少一個(gè)癌細(xì)胞與至少一種抗癌藥接觸；(b) 在酶催化細(xì)胞與底物反應(yīng)的條件下，使所述至少一個(gè)癌細(xì)胞與所述酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號(hào)的產(chǎn)物；禾口(c) 測(cè)定所述細(xì)胞所產(chǎn)生的所述電信號(hào)水平，其中所述水平表示所述抗癌藥對(duì)所述患 者癌癥的療效。
4. 一種監(jiān)測(cè)患者的抗癌治療的方法，所述方法包括(a) 給予所述患者至少一種抗癌藥；(b) 按照權(quán)利要求1的方法的步驟(a)，檢測(cè)所述患者樣品中癌細(xì)胞的存在或水平，其 中所述存在或水平表示癌癥狀態(tài)。
5. —種檢測(cè)患者的抗癌治療的方法，所述方法包括(a) 按照權(quán)利要求1的方法，分析所述患者樣品中癌細(xì)胞的存在或水平；(b) 根據(jù)所述患者樣品中所述癌細(xì)胞的存在或水平，給予所述患者治療有效量的抗癌藥。
6. —種能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性表型的藥物的鑒定方法，所述方法包括(a) 使至少一個(gè)癌細(xì)胞接觸藥物；(b) 按照權(quán)利要求1的方法的(a)并任選在(a)之前，測(cè)定所述細(xì)胞的惡性表型，其中 表型逆轉(zhuǎn)是藥物能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性表型的標(biāo)志。
7. 權(quán)利要求5的方法，所述方法還包括在步驟(b)后重復(fù)步驟(a)。
8. 權(quán)利要求2、3和6中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞包括多個(gè)細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求1、2、3和6中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)定是用高通量方式進(jìn)行。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述方式選自自動(dòng)取樣裝置、液體處理裝置、分配器、電極 陣列、機(jī)器人或其任何組合。
11. 權(quán)利要求l的方法，其中所述接觸是在體外進(jìn)行。
12. 權(quán)利要求l的方法，其中所述接觸是在離體情況下進(jìn)行。
13. 權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包含不多于500個(gè)細(xì)胞。
14. 權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述活檢樣品包含不少于IO個(gè)細(xì)胞。
15. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶是堿性磷酸酶。
16. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述底物是對(duì)氨基苯磷酸。
17. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞。
18. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)定是用電化學(xué)電解池來(lái)進(jìn)行。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述測(cè)定是在多孔陣列中進(jìn)行。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述多孔陣列的各孔包含電化學(xué)電解池。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述多孔陣列的各孔是納升體積的孔。
22. 權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥物包括試驗(yàn)組合物。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述試驗(yàn)組合物選自多核苷酸、多肽、小分子化學(xué)物、碳 水化合物、脂質(zhì)及其組合。
24. 權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述藥物包括試驗(yàn)條件。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述試驗(yàn)條件是輻射條件。
26. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是完整的。
27. 權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌細(xì)胞是完整的。
28. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
29. 權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
30. —種專為按照權(quán)利要求1的方法檢測(cè)癌細(xì)胞而設(shè)計(jì)的系統(tǒng)。
31. —種藥盒，所述藥盒包含(i) 電化學(xué)電解池，所述電化學(xué)電解池適合于容納至少一個(gè)生物細(xì)胞并適合于進(jìn)行電 化學(xué)測(cè)定；禾口(ii) 至少一種抗癌藥。
32. 權(quán)利要求31的藥盒，所述藥盒還包含底物，所述底物被所述生物細(xì)胞的酶催化而 進(jìn)行酶促反應(yīng)以生成反應(yīng)產(chǎn)物，從而在所述電化學(xué)電解池的電極上發(fā)生氧還反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了癌細(xì)胞的檢測(cè)方法。所述方法包括(a)在酶催化細(xì)胞與底物反應(yīng)的條件下，使所述細(xì)胞與所述酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號(hào)的產(chǎn)物；和(b)測(cè)定所述電信號(hào)水平，其中所述電信號(hào)水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細(xì)胞的標(biāo)志。所述方法適合于診斷、監(jiān)測(cè)癌癥治療，鑒定能治療癌癥的藥物并可對(duì)癌癥治療進(jìn)行個(gè)性化優(yōu)化。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101702920SQ200880018299
公開(kāi)日2010年5月5日 申請(qǐng)日期2008年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日
發(fā)明者J·里什龐, R·波波夫特澤, S·弗尼克, T·紐費(fèi)爾德, Y·沙錢-戴曼德 申請(qǐng)人:特拉維夫大學(xué)拉莫特有限公司