擴(kuò)增甲基化核酸或非甲基化核酸的方法

專利名稱：：擴(kuò)增甲基化核酸或非甲基化核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及擴(kuò)增存在于生物學(xué)試樣中的甲基化核酸或非甲基化核酸的方法。進(jìn)而，涉及包含該擴(kuò)增方法的方法，該方法檢測生物學(xué)試樣中可能含有的目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)中的甲基化和/或非甲基化。本申請基于作為參照而援引于此的日本專利申請?zhí)卦?007-153086號請求優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
：在哺乳類中，在存在于基因組DNA序列中的5'-CG-3'DNA部分(以下，稱為CpG部位，或簡單稱之為CpG)中，已知位于該鳥嘌呤(G)的5'側(cè)的胞嘧啶(C)被甲基化的現(xiàn)象。CpG的甲基化修飾被認(rèn)為會對基因表達(dá)產(chǎn)生影響。特別是在富含CpG的區(qū)域(CpG島)存在于基因的啟動子區(qū)域內(nèi)時(shí)，CpG被認(rèn)為會對基因表達(dá)產(chǎn)生重要影響。通常，染色體中的多數(shù)CpG島因甲基化而被保護(hù)。但是，由于某些原因，如果存在于啟動子區(qū)域的CpG島被甲基化，則該基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。例如，在人體內(nèi)的抑癌基因中，發(fā)生存在于其啟動子區(qū)域的CpG島的異常甲基化，該抑癌基因的轉(zhuǎn)錄被鈍化時(shí)，細(xì)胞增殖的控制變得無效，從而導(dǎo)致癌等細(xì)胞增殖性疾病發(fā)生。另一方面，在CpG島以外的區(qū)域中，通常CpG中的胞嘧啶被甲基化。但是，有報(bào)道稱，在癌和瘤中，通常被甲基化的CpG的胞嘧啶被非甲基化。隨著近年來的分子生物學(xué)方法的發(fā)展，通過檢測DNA的有無甲基化來對癌、腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療進(jìn)行監(jiān)控逐漸成為可能。例如，在日本特表2000-511776號公報(bào)(專利文獻(xiàn)1)、國際公開第02/38801Al號公開文本(專利文獻(xiàn)2)和XiongZ，LairdPW.NucleicAcidsRes.1997jun15;25(12):2532-4(非專利文獻(xiàn)1)中，公開了為了迅速檢測出含CpG核酸中的甲基化，利用PCR法，診斷癌等的方法。對于這些方法，重點(diǎn)置于特異性地檢測出甲基化DNA方面。進(jìn)而，具體來說，公開有由各種體液、組織或細(xì)胞系制備核酸試樣，利用重亞硫酸鹽等進(jìn)行將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的修飾，然后，(1)通過能夠區(qū)分非甲基化DNA和甲基化DNA的特異性引物用PCR法(Methylation-Specific-PCR:MSP法)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測出甲基化DNA的方法(專利文獻(xiàn)l);以及(2)通過不區(qū)分非甲基化DNA和甲基化DNA的非特異性引物用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，用識別該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部堿基序列的不同的限制酶進(jìn)行處理，從而檢測出甲基化DNA的有無和/或比例的方法(CombinedBisulfiteRestrictionAnalysis:COBRA法)(非專利文獻(xiàn)1)。通過采用這些方法檢測出特定的基因堿基序列中的甲基化DNA的存在，能夠?qū)Π㎎中瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療進(jìn)行監(jiān)控。另外，公開了以高靈敏度檢測出甲基化DNA和/或非甲基化DNA的方法(日本特開2007-74950號公報(bào)(專利文獻(xiàn)3))。公開了在PCR擴(kuò)增工序之后，用核酸外切酶處理已擴(kuò)增的雙鏈DNA片段，得到單鏈DNA片段，通過DNA微陣列進(jìn)行檢測的方法。對于MSP法、C0BRA法，核酸試樣(DNA試樣)并不是來自組織或細(xì)胞系、而是由各種體液而得的試樣時(shí)，含有DNA量為微量，因此成為對象的DNA不被擴(kuò)增的情況很多?！愕卣f，已知PCR法本身的靈敏度(通過PCR法得到擴(kuò)增產(chǎn)物的概率)和特異性(僅擴(kuò)增目標(biāo)基因區(qū)域的概率)取決于引物的堿基序列和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件。為了提高PCR的靈敏度，有必要放寬PCR擴(kuò)增工序的條件，這時(shí)PCR的特異性減小。對于MSP法，使用對非甲基化DNA和甲基化DNA分別具有特異性序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增工序。在模板DNA量少時(shí)或純化度差時(shí)，例如以各種體液為樣本時(shí)，必須放寬擴(kuò)增工序的條件，而導(dǎo)致特異性減小。因此，不知道檢測出的擴(kuò)增產(chǎn)物是否真的僅由非甲基化DNA或甲基化DNA擴(kuò)增而得，成為問題。另外，由于對非甲基化DNA的特異性引物和對甲基化DNA的特異性引物的序列大為不同(例如，非甲基化DNA用的引物多含A和T，甲基化DNA用的引物多含C和G)，而導(dǎo)致非甲基化DNA和甲基化DNA的擴(kuò)增靈敏度、特異性不同。進(jìn)而，由于僅以PCR產(chǎn)物的有無來判斷有無非甲基化和甲基化，因此無法確認(rèn)擴(kuò)增工序自身的錯(cuò)誤。對于COBRA法，對甲基化DNA的靈敏度低成為問題。將各種體液用于樣本時(shí)，有可能無法用COBRA法檢測出。專利文獻(xiàn)1:日本特表2000-511776號公報(bào)專利文獻(xiàn)2:國際公開第02/38801A1號公開文本專利文獻(xiàn)3:日本特開2007-74950號公報(bào)非專利文獻(xiàn)l:XiongZ，LairdPW.NucleicAcidsRes.1997junl5;25(12):2532-
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供用于對各種樣本高靈敏度地檢測出目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)有無非甲基化核酸或甲基化核酸的擴(kuò)增方法，以及非甲基化和/或甲基化的檢測方法。本申請發(fā)明人等鑒于上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)明了，通過對能夠擴(kuò)增非甲基化DNA和甲基化DNA兩者的非特異性引物、以及能夠擴(kuò)增非甲基化DNA或甲基化DNA中的任一者的特異性引物進(jìn)行設(shè)計(jì)來進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，從而能夠正確且高靈敏度地?cái)U(kuò)增成為對象的DNA，并且，通過使引物的比例變化，從而以任意比率擴(kuò)增甲基化和非甲基化核酸，進(jìn)行檢測的方法。SP，本發(fā)明如下構(gòu)成。1.—種核酸擴(kuò)增方法，是來源于生物學(xué)試樣中可能含有的目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)的含CpG核酸的擴(kuò)增方法，包含使用引物組來擴(kuò)增該含CpG核酸的工序，所述引物組至少含有不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1弓l物、以及區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第2引物，第2引物具有與第1引物實(shí)質(zhì)相同的引物區(qū)域。2.前項(xiàng)1所述的核酸擴(kuò)增方法，在第1引物的序列中含有至少1個(gè)CpG部位，并且，與該CpG部位的胞嘧啶對應(yīng)的位置的堿基被混合堿基(Y)和/或混合堿基(R)和/或肌苷酸(I)取代。3.前項(xiàng)1或2所述的核酸擴(kuò)增方法，在第2引物的序列中含有至少2個(gè)CpG部位，并且，該CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特異性存在。4.前項(xiàng)13中任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，擴(kuò)增通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行。5.前項(xiàng)4所述的核酸擴(kuò)增方法，進(jìn)一步使用第3引物，所述第3引物是不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的引物，具有與第1引物或第2引物成對地?cái)U(kuò)增核酸的功能。6.前項(xiàng)15中任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，第1引物和第2引物的濃度比為io:ii:i。7.前項(xiàng)16中任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，在上述擴(kuò)增工序之前，包含如下工序使生物學(xué)試樣與修飾非甲基化胞嘧啶的試劑接觸，將能夠存在于生物學(xué)試樣中的核酸的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，從而對生物學(xué)試樣進(jìn)行處理。8.—種檢測生物學(xué)試樣中可能含有的目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)中的甲基化和/或非甲基化的方法，包含前項(xiàng)17中任一項(xiàng)所述的方法。9.前項(xiàng)8所述的檢測方法，包含利用限制酶處理擴(kuò)增片段，該限制酶識別擴(kuò)增片段的序列中除引物區(qū)域以外的序列中存在的CG或TG。10.—種引物組，至少含有不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物，以及區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸、且具有與第1引物實(shí)質(zhì)相同的引物區(qū)域的第2引物。11.前項(xiàng)10所述的引物組，用于前項(xiàng)19中任一項(xiàng)所述的方法。12.—種試劑盒，含有前項(xiàng)11所述的引物組。根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增方法，可以使用各種樣本，高精度地?cái)U(kuò)增非甲基化核酸或甲基化核酸。進(jìn)而，該擴(kuò)增方法具有可以對非甲基化或甲基化核酸設(shè)定任意的靈敏度這樣的優(yōu)點(diǎn)。例如，即使在非甲基化的檢測重要、且該非甲基化核酸的比率相對于甲基化核酸來說非常小的情況下，根據(jù)本方法，也能夠正確地?cái)U(kuò)增該非甲基化核酸。核酸的甲基化異常不僅在增殖性疾病中得到確認(rèn)，在其他疾病中也得到確認(rèn)。本發(fā)明是能夠以任意比率擴(kuò)增甲基化核酸或非甲基化核酸，并將它們定量性或非定量性地算出而進(jìn)行檢測的方法。因此，本方法能夠有效且高精度地判斷(診斷)甲基化異常，可以用于疾病的診斷、治療和預(yù)防的判斷，是對社會產(chǎn)生極其深遠(yuǎn)的影響的方法。圖1是表示實(shí)施例2的結(jié)果的照片。圖2是表示由實(shí)施例2的結(jié)果算出的各體系的非甲基化PCR產(chǎn)物比例的曲線圖。圖3(A)是RASSF2A基因的啟動子區(qū)域的示意圖。(B)是表示實(shí)施例3_1的結(jié)果的照片。(C)是表示實(shí)施例3-2中的COBRA法和Hi-SA法的結(jié)果的照片。圖4是SFRP2、R印rimo和APC基因的啟動子區(qū)域的示意圖。圖5是實(shí)施例4的結(jié)果的照片。圖6是實(shí)施例5的結(jié)果的照片。圖7是實(shí)施例6的結(jié)果的圖。圖8是實(shí)施例7的結(jié)果的圖。符號說明SM尺寸標(biāo)記物C對照IU對非甲基化DNA的特異性引物M對甲基化DNA的特異性引物U非甲基化PCR產(chǎn)物M甲基化PCR產(chǎn)物具體實(shí)施例方式本發(fā)明是來源于生物學(xué)試樣中可能含有的目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)的含CpG核酸的擴(kuò)增方法。另外，是包含該擴(kuò)增方法、檢測生物學(xué)試樣中含有的基因和/或基因位點(diǎn)的甲基化和/或非甲基化的方法。本發(fā)明中，所謂"生物學(xué)試樣"，是指含有由從哺乳類等采集的樣本制備的核酸的試樣(以下，有時(shí)也簡稱為"試樣")。所謂樣本，可以舉出血液、血清、糞便、尿、精液、痰、唾液、鼻涕、腦脊髓液、眼淚等各種體液，或者腦、結(jié)腸、泌尿生殖器、肺、腎臟、造血組織、乳房、胸腺、睪丸、卵巢、子宮組織等各種組織，或者它們所含的細(xì)胞群。優(yōu)選可以舉出糞便、痰、尿等能夠非侵害性獲得的樣本。進(jìn)而，本發(fā)明的生物學(xué)試樣的DNA純化度可以低，并且含有DNA的量可以是微量。作為從樣本獲得生物學(xué)試樣的方法可以使用本身公知的方法。例如，可以使用MagExtractor(東洋紡制)、QIAampStoolDNAIsolationKit(QIAGEN公司)等的市售品等，采用本身公知的方法從樣本提取DNA，以糞便為樣本時(shí)，使用國際公開公報(bào)W02006/064737號中記載的前處理方法即可簡便地得到試樣。優(yōu)選通過修飾生物學(xué)試樣中存在的基因的全部非甲基化胞嘧啶的試劑對得到的生物學(xué)試樣進(jìn)行處理。作為該試劑的例子，可以舉出重亞硫酸鹽。通過重亞硫酸鹽處理，非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不被轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，因此只要在處理后檢測出胞嘧啶，就可以判斷該胞嘧啶為甲基化。這樣的非甲基化胞嘧啶的修飾處理可以使用DNA甲基化檢測用試劑盒的市售品，例如DNAmethylationKit，EZ(ZYMORESEARCH),MethylEasy(HumanGeneticSignatures)，CpGe謹(jǐn)eDNAModificationKit(CHEMICON)等進(jìn)行。本發(fā)明中，所謂"生物學(xué)試樣中可能含有的基因和/或基因位點(diǎn)"，是指生物學(xué)試樣中可能含有的各種疾病相關(guān)基因、微生物相關(guān)基因。例如，可以舉出遺傳病等的致病基因、來源于癌組織的基因，來源于固有菌的基因、來源于采集試樣的宿主所感染的微生物(細(xì)菌、病毒等)的基因等。具體可以舉出EPM2AIP1基因(Genbank登錄號9852)、RASSF2A基因(Genbank登錄號9770)、SFRP2基因(Genbank登錄號6423)、R印rimo基因(Genebank登錄號56475)、APC基因(Genbank登錄號324)。本發(fā)明中，所謂"含CpG核酸"，是來源于上述基因、基因位點(diǎn)的核酸。含CpG核酸可以是由完整的基因序列構(gòu)成的核酸，只要包含成為擴(kuò)增對象的區(qū)域的核酸，也可以是DNA片段或RNA片段等片段。含有CpG的區(qū)域可以舉出例如基因的啟動子區(qū)域、5'區(qū)域。具體可以舉出EPM2AIP基因的啟動子區(qū)域(hMLHl-5'區(qū)域)、RASSF2A基因的啟動子區(qū)域、SFRP2基因的啟動子區(qū)域、R印rimo基因的啟動子區(qū)域、APC基因的啟動子區(qū)域。CpG部位中的胞嘧啶有受到甲基化修飾的情況和未受甲基化修飾的情況。本發(fā)明中，將該胞嘧啶受到甲基化修飾的核酸稱為"甲基化核酸"，將該胞嘧啶未受甲基化修飾的核酸稱為"非甲基化核酸"。本發(fā)明的方法中，其特征在于，使用引物組來進(jìn)行擴(kuò)增工序，所述引物組至少含有不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物、以及區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第2引物。進(jìn)而，其特征還在于，第2引物具有與第1引物實(shí)質(zhì)相同的引物區(qū)域。這里，所謂引物區(qū)域，是指目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)的含CpG核酸的堿基序列的一部分，是為了設(shè)計(jì)引物而選擇的區(qū)域。引物區(qū)域的長度、即引物的大小根據(jù)使用的擴(kuò)增反應(yīng)的種類而定，例如如果使用PCR法，則優(yōu)選為540bp，更優(yōu)選1030bp。本方法中使用的引物，具有與模板含CpG核酸的引物區(qū)域的堿基序列實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的堿基序列，由從其3'末端能夠延伸DNA鏈的低聚核苷酸構(gòu)成。所謂"實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)"，是指引物的堿基序列可以與引物區(qū)域的堿基序列不完全互補(bǔ)，只要在擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，對于與模板核酸進(jìn)行雜交而言為足夠的互補(bǔ)即可。所謂第1引物的"不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸"，是指第1引物在擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，無論是與非甲基化核酸還是與甲基化核酸均能非特異性地進(jìn)行雜交，能夠進(jìn)行其后的擴(kuò)增反應(yīng)。本說明書中，將具有該功能的引物稱為"非特異性引物"。第l引物的序列可以不含CpG部位，也可以含有CpG部位。含有CpG部位時(shí)，與該CpG部位的胞嘧啶互補(bǔ)的堿基優(yōu)選被混合堿基(Y)和/或混合堿基(R)和/或肌苷酸(I)取代。此外，第1引物的序列中，優(yōu)選含有至少1個(gè)CpG部位，并且，與該CpG部位的胞嘧啶互補(bǔ)的堿基優(yōu)選被混合堿基(Y)和/或混合堿基(R)和/或肌苷酸(I)取代。所謂第2引物的"區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸"，是指第2引物在擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，能夠與非甲基化核酸或者甲基化核酸特異性進(jìn)行雜交的引物，因此，意味著與另一者實(shí)質(zhì)上不雜交。本說明書中，將具有該功能的引物稱為"特異性引物"。進(jìn)而，第2引物具有與第1引物實(shí)質(zhì)相同的引物區(qū)域。所謂"實(shí)質(zhì)相同"，并不意味著完全相同。第2引物的序列可以在第1引物的序列的3'末端和/或5'末端分別附加和/或缺失18個(gè)、優(yōu)選15個(gè)堿基。這意味著引物區(qū)域可以延伸和/或縮短。當(dāng)然，可以完全沒有附加和缺失。進(jìn)一步優(yōu)選兩末端的附加和/或缺失的和為5個(gè)以下。另外，對于第2引物的序列，與第1引物的序列相比，堿基不同存在18個(gè)，優(yōu)選存在36個(gè)。該不同中包括上述3'或5'末端中的堿基的附加和/或缺失。例如，第l引物中不含CpG部位時(shí)，通過附加堿基，能夠使第2引物中含有CpG部位。另外，例如，第l引物的混合堿基(Y)和/或混合堿基(R)和/或肌苷酸(I)對于第2引物來說有時(shí)可以被胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)取代。這樣，也有在第1引物和第2引物的引物區(qū)域的重復(fù)部分中存在不同的堿基的情況。這些是由于第1引物為非特異性引物、而與此相對第2引物為特異性引物而產(chǎn)生的序列差異。進(jìn)一步優(yōu)選在第2引物的序列中含有至少2個(gè)CpG部位，并且該CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特異性存在。擴(kuò)增反應(yīng)可以使用本身公知的方法。具體可以舉出聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR法，Science,230:1350-1354，1985)、NASBA法(基于核酸序列的擴(kuò)增(NucleicAcidSequenceBasedAmplification)法，Nature,350，91-92，1991)禾PLAMP法(日本特開2001-242169號公報(bào))等，可以優(yōu)選使用PCR法。另外，引物的設(shè)計(jì)有必要根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的種類而適當(dāng)變化，除了第1引物和第2引物以外，還可以使用其他引物。例如，使用PCR法時(shí)，除了第1引物和第2引物以外，還可以進(jìn)一步使用第3引物。第3引物不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸，與第1引物或第2引物成對，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)時(shí)，由第1引物或第2引物、與第3引物生成的擴(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選約為lOObp300bp，進(jìn)一步優(yōu)選約為100bp200bp，當(dāng)然，在以下的檢測方法中，只要是能夠解析的產(chǎn)物，就并不限于這些。另外，由于第1引物和第2引物的引物區(qū)域?qū)嵸|(zhì)相同，因此由第1引物第3引以及由第2引物和第3引物得到的擴(kuò)增片段是實(shí)質(zhì)上同樣大小的片段。即，可以認(rèn)為這些擴(kuò)增片段的大小的差理論上為016bp，優(yōu)選為010bp。這里，以擴(kuò)增反應(yīng)使用PCR法時(shí)為例，對本發(fā)明的方法中使用的引物進(jìn)行具體說明。應(yīng)說明的是，各引物的堿基序列請參照實(shí)施例。對于EPM2AIP基因的啟動子區(qū)域(hMLHl-5'區(qū)域)，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用EPM2AIP-F(序列編號1)，作為第2引物，可以使用EPM2AIP-IM(序列編號4)，作為第3引物，可以使用EPM2AIP-R(序列編號2)。而對于相同的hMLHl-5'區(qū)域，以非甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第l引物，可以使用EPM2AIP-F(序列編號1)，作為第2引物，可以使用EPM2AIP-IU(序列編號3)，作為第3引物，可以使用EPM2AIP-R(序列編號2)。對于RASSF2A基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用RASSF2A-R(序列編號6)，作為第2引物，可以使用RASSF2A-IM(序列編號8)，作為第3引物，可以使用RASSF2A-F(序列編號5)。而對于相同的RASSF2A基因^啟動子區(qū)域，以非甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用RASSF2A-R(序列編號6)，作為第2引物，可以使用RASSF2A-IU(序列編號7)，作為第3引物，可以使用RASSF2A-F(序列編號5)。對于SFRP2基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用SFRP2-F(序列編號9)，作為第2引物，可以使用SFRP2-IM(序列編號11)，作為第3引物，可以使用SFRP2-R(序列編號10)。對于R印rimo基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用R印-R(序列編號13)，作為第2引物，可以使用R印-IM(序列編號14)，作為第3引物，可以使用R印-F(序列編號12)。對于APC基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用APC-R(序列編號16)，作為第2引物，可以使用APC-IM(序列編號18)，作為第3引物，可以使用APC-F2(序列編號17)。本發(fā)明的方法中使用的引物可以使用以往型的磷酸三酯法和磷酸二酯法、或者它們被自動化的實(shí)施方式等任意的合適方法進(jìn)行制備。對于這樣的自動化的實(shí)施方式之一，作為起始原料使用二乙基亞磷酰胺，該化合物可以按照Beaucage等的報(bào)道(TetrahedronLetters,22:1859-1862，1981)合成。在改變固體支持體上合成低聚核苷酸的方法記載于美國專利第4458066號。本發(fā)明的引物還包括在其序列末端附加了用于檢測的適當(dāng)標(biāo)記，例如熒光色素、酶、蛋白、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素等的引物。作為本發(fā)明中使用的熒光色素，可以優(yōu)選使用一般將堿基標(biāo)記，用于核酸的定量、檢測等的熒光色素，可以舉出例如HEX(4，7，2'，4'，5'，7'-六氯-6-羧基熒光素，綠色熒光色素)、熒光黃(fluorescein)、NED(AppliedBiosystems公司商品名，黃色熒光色素)、或者6-FAM(AppliedBiosystems公司商品名，黃綠色熒光色素)、若丹明(rhodamin)或其衍生物(例如，四甲基若丹明(TMR))、VIC(AppliedBiosystems公司商品名，綠色熒光色素)、PET(AppliedBiosystems公司商品名，紅色熒光色素)等，但并不限于這些。用熒光色素標(biāo)記堿基的方法可以使用公知的標(biāo)記法中合適的方法(參照NatureBiotechnology，14，p303_308(1996))。另外，還可8以使用市售的熒光標(biāo)記試劑盒(例如，AmershamPharmacia公司制低聚核苷酸ECL3'-低聚標(biāo)記體系等)。熒光物質(zhì)可以附加到非特異性引物中，在擴(kuò)增反應(yīng)使用PCR法時(shí)，優(yōu)選在第1引物或第3引物中的任一者中附加熒光色素。本發(fā)明的方法中，對采用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的用熒光色素標(biāo)記的引物的具體例進(jìn)行說明。對于引物的序列請參照實(shí)施例。對于RASSF2A基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用RASSF2A-R(序列編號6)，作為第2引物，可以使用RASSF2A-IM(序列編號8)，作為第3引物，可以使用RASSF2A-F(序列編號5)、在第3引物的5'末端中附加了6-FAM的引物。對于SFRP2基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用SFRP2-F(序列編號9)，作為第2引物，可以使用SFRP2-IM(序列編號11)，作為第3引物，可以使用SFRP2-R(序列編號10)、在第3弓|物的5'末端中附加了NED的引物。對于R印rimo基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用R印-R(序列編號13)，作為第2引物，可以使用R印-IM(序列編號14)，作為第3引物，可以使用R印-F(序列編號12)、在第1弓|物的5'末端中附加了VIC的引物。對于APC基因的啟動子區(qū)域，以甲基化核酸的擴(kuò)增為目的時(shí)，作為第1引物，可以使用APC-R(序列編號16)，作為第2引物，可以使用APC-IM(序列編號18)，作為第3引物，可以使用APC-F2(序列編號17)、在第3弓|物的5'末端中附加了PET的引物。本方法中，通過使第1引物和第2引物的濃度比例發(fā)生變化，能夠以所需的比例和靈敏度得到擴(kuò)增產(chǎn)物。優(yōu)選第i引物和第2引物的濃度比為i0:ii:1，更優(yōu)選為5:ii:i，進(jìn)一步優(yōu)選為3:ii:i。使第2引物的濃度增加時(shí)，來源于第2引物能夠特異性擴(kuò)增的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的比例增加。該第2引物的效果認(rèn)為在第1引物和第2引物的濃度比為2:i時(shí)得到最大發(fā)揮。本發(fā)明的檢測方法中，所謂進(jìn)行目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)中的甲基化核酸或非甲基化核酸的檢測，是指檢測有無甲基化核酸和/或非甲基化核酸，或者檢測甲基化核酸和非甲基化核酸的比例。本發(fā)明的檢測方法包括如下工序?qū)⒂缮鲜鰯U(kuò)增方法得到的擴(kuò)增產(chǎn)物(1)用合適的限制酶進(jìn)行處理，通過電泳、序列分析儀等確認(rèn)片段的大小，判斷非甲基化DNA和/或甲基化DNA的有無和/或量的工序；(2)用搭載了由與擴(kuò)增產(chǎn)物的除引物區(qū)域以外的區(qū)域的堿基序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的核苷酸的微陣列，判斷非甲基化DNA和/或甲基化DNA的有無和/或量的工序。根據(jù)該檢測方法，能夠?qū)U(kuò)增產(chǎn)物的除引物區(qū)域以外的區(qū)域檢測出非甲基化和/或甲基化。在包含用限制酶進(jìn)行處理的工序的檢測方法中使用的限制酶，優(yōu)選識別在擴(kuò)增片段序列的除了引物區(qū)域的序列中存在的CG或TG?？梢愿鶕?jù)基因的種類、擴(kuò)增產(chǎn)物的序列選擇限制酶。對于用限制酶進(jìn)行處理的時(shí)間等處理?xiàng)l件，可以適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。用限制酶進(jìn)行處理的時(shí)間優(yōu)選為5分鐘至12小時(shí)，更優(yōu)選5分鐘至15分鐘。對于EPM2AIP基因的啟動子區(qū)域(hMLHl-5'區(qū)域)，使用EPM2AIP-F(序列編號1)、EPM2AIP-R(序列編號2)、EPM2AIP-M(序列編號4)或EPM2AIP-IU(序列編號3)三者作為弓I物組進(jìn)行擴(kuò)增工序時(shí)，可以使用限制酶Hhal。對于RASSF2A基因的啟動子區(qū)域，使用RASSF2A-R(序列編號6)、RASSF2A-F(序列編號5)、RASSF2A-IM(序列編號8)或RASSF2A-IU(序列編號7)三者作為引物組進(jìn)行擴(kuò)增工序時(shí)，可以使用限制酶HhaI。對于SFRP2基因的啟動子區(qū)域，使用SFRP2-F(序列編號9)、SFRP2-IM(序列編號11)、SFRP2-R(序列編號10)作為引物組進(jìn)行擴(kuò)增工序時(shí)，可以使用限制酶BssHII。對于R印rimo基因的啟動子區(qū)域，使用R印-R(序列編號13)、R印-IM(序列編號14)、R印-F(序列編號12)作為引物組進(jìn)行擴(kuò)增工序時(shí)；以及對于APC基因的啟動子區(qū)域，使用APC-R(序列編號16)、APC-IM(序列編號18)、APC-F2(序列編號17)作為引物組進(jìn)行擴(kuò)增工序時(shí)，可以使用限制酶Taql。另外，還可以對多個(gè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行限制酶處理。對RASSF2A基因和SFRP2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行限制酶處理時(shí)，可以使用限制酶Hhal。對R印rimo基因和APC基因的擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行限制酶處理時(shí)，可以使用限制酶Taql。通過采用電泳確認(rèn)用限制酶處理后的擴(kuò)增片段的大小，可以判定非甲基化DNA和/或甲基化DNA的有無和/或量。電泳可以通過本身公知的方法進(jìn)行。還可以使用序列分析儀來代替電泳，確認(rèn)片段的大小。使用序列分析儀時(shí)，用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物優(yōu)選使用通過熒光色素等標(biāo)記的引物。使用序列分析儀的檢測方法中，能夠?qū)Χ喾N基因區(qū)域一次性進(jìn)行解析，是有用的。例如使用能夠區(qū)分4種熒光色素的序列分析儀時(shí)，可以將各個(gè)熒光色素附加到與4種基因區(qū)域?qū)?yīng)的引物中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。另外，為了使來源于4種基因區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度不同，有必要進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度不同至少為2bp，優(yōu)選10bp以上。反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物可以同時(shí)應(yīng)用于序列分析儀而進(jìn)行解析。使用序列分析儀的檢測方法的另一優(yōu)點(diǎn)在于，能夠大幅縮短、減少限制酶反應(yīng)時(shí)間和試樣量。例如，不使用序列分析儀進(jìn)行判定時(shí)，用限制酶得到擴(kuò)增物的處理時(shí)間根據(jù)限制酶的濃度而變化，基本需要8小時(shí)以上。另外，對于采用不使用序列分析儀的電泳進(jìn)行判定時(shí)，對每個(gè)成為擴(kuò)增對象的各基因需要30分鐘以上的泳動時(shí)間。例如，使用4個(gè)基因作為標(biāo)記進(jìn)行判定時(shí)，由于必須對各基因進(jìn)行電泳，因此需要的時(shí)間為120分鐘(4X30分鐘)以上。此外，對于電泳，用PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，至少需要5iiL的擴(kuò)增反應(yīng)液。另一方面，使用序列分析儀進(jìn)行判定時(shí)，在采用序列分析儀進(jìn)行的泳動中，用PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)所必需的擴(kuò)增反應(yīng)液的量為微量，例如使用0.02iiL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液就足夠了。由于必需的擴(kuò)增反應(yīng)液的量與電泳相比為微量，因此使用同等的限制酶量時(shí)，限制酶處理需要的時(shí)間為5分鐘至10分鐘就足夠了。另外，即使在使用多個(gè)基因作為標(biāo)記時(shí)，也能用序列分析儀一次性地進(jìn)行泳動。因此，對于1個(gè)試樣的4個(gè)基因進(jìn)行判定所需要的時(shí)間為30分鐘(1X30分鐘)。在使用微陣列捕捉擴(kuò)增產(chǎn)物的方法中，優(yōu)選在搭載于微陣列的低聚核苷酸中附加檢測物質(zhì)、例如熒光物質(zhì)。根據(jù)上述擴(kuò)增方法，在為了提高擴(kuò)增工序的成功率而放寬擴(kuò)增工序的條件時(shí)，各引物對于與該引物的序列互補(bǔ)的DNA的特異性有可能減少。但是，由于通過上述(1)、(2)的工序識別非甲基化和/或甲基化DNA，因此特異性減少的問題得到消除。另外，通過本發(fā)明的檢測方法，由于并非僅以有無擴(kuò)增產(chǎn)物來判斷有無非甲基化或甲基化DNA，因此能夠確認(rèn)擴(kuò)增工序的錯(cuò)誤。因此，能夠比現(xiàn)有例更可靠地判定非甲基化和/或甲基化DNA的有無和/或量。另外，對于本方法，作為樣本，不僅可以使用組織、血液，還可以使用各種體液、排泄物。由于排泄物等能夠非侵害性獲得的樣本無需在特定場所進(jìn)行采集，因此能夠利用它們的本方法對于各種癌的早期診斷等可以非常通用地使用，是有用的。因此，通過本發(fā)明的檢測方法，通過對規(guī)定基因和/或基因位點(diǎn)、例如抑癌基因的啟動子區(qū)域檢測有無甲基化，能夠簡便且高精度地進(jìn)行癌等細(xì)胞增殖性疾病的判定(診斷)。當(dāng)基因的啟動子區(qū)域中發(fā)生DNA的甲基化時(shí)，該基因的表達(dá)受到抑制。當(dāng)該基因?yàn)橐职┗驎r(shí)，由于機(jī)體中抑癌基因的表達(dá)受到抑制，因此導(dǎo)致癌產(chǎn)生并發(fā)展。使用本方法，通過檢測上述生物學(xué)試樣的甲基化核酸和非甲基化核酸，能夠檢測細(xì)胞增殖性疾病和/或炎癥性疾病。上述細(xì)胞增殖性疾病和/或炎癥性疾病可以選自低度星形細(xì)胞瘤、未分化星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、咽喉癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、胰腺炎、小腸癌、克羅恩病、結(jié)腸癌、直腸癌、潰瘍性大腸炎、肺癌、腎癌、白血病、乳癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。進(jìn)而，本發(fā)明還涉及上述擴(kuò)增方法和檢測方法中使用的引物組。該引物組是至少含有第1引物和第2引物、可進(jìn)一步含有第3引物的組。進(jìn)而，可以含有本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)所必需的引物。另外，這些引物可以用熒光色素進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明還涉及包含上述引物組的試劑盒。試劑盒可以含有其他需要的試劑，例如酶、緩沖液等。實(shí)施例以下，通過實(shí)施例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受它們的限定。(實(shí)施例1)DNA試樣的制備從大腸正常粘膜提取DNA。對于從大腸正常粘膜提取出的DNA，各基因的啟動子區(qū)域的CpG區(qū)域基本上為非甲基化。因此，由從大腸正常粘膜提取出的DNA篩選已確認(rèn)為非甲基化的DNA，作為"非甲基化DNA"。"甲基化DNA"通過將該"非甲基化DNA"用Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行處理而得到。對于各DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽(bisulfite)處理。處理后，將甲基化DNA和非甲基化DNA以各種比率混合制成混合模板的試樣。混合模板試樣以將甲基化DNA的比率(％)調(diào)節(jié)為100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0的方式制成。(實(shí)施例2)通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法進(jìn)行試樣DNA的擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，從而對其效果進(jìn)行研究。以下，將采用電泳進(jìn)行的本發(fā)明的檢測方法也稱為Hi-SA法(高靈敏度分析，High-SensitiveAssay)。首先，使用實(shí)施例1中制作的模板試樣中甲基化DNA的比率為50%的試樣(非甲基化DNA:甲基化DNA=1:1)，對于Hi-SA法的"非特異性引物"的效果，以EPM2AIP基因的啟動子區(qū)域(hMLHl-5'區(qū)域)為模型進(jìn)行研究。能夠擴(kuò)增EPM2AIP基因的啟動子區(qū)域(hMLHl-5'區(qū)域)的Hi-SA法的引物如下所示。EPM2AIP-F:5'-YGGGTAAGTYGTTTTGAYGTAGA(序列編號1)EPM2AIP-R:5'-TATACCTAATCTATCRCCRCCTCA(序列編號2)EPM2AIP-IU:5'-CGGGTAAGTCGTTTTGACGTAGA(序列編號3)EPM2AIP-M:5'-TGGGTAAGTTGTTTTGATGTAGA(序列編號4)EPM2AIP-F(序列編號1)和EPM2AIP-R(序列編號2)為非特異性引物，設(shè)計(jì)為既與存在非甲基化胞嘧啶的DNA雜交又與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交。通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。EPM2AIP-IU(序列編號3)是對非甲基化DNA的特異性引物，EPM2AIP-M(序列編號4)是對甲基化DNA的特異性引物(以下，有時(shí)也將對非甲基化DNA的特異性引物記為"IU"，將對甲基化DNA的特異性引物記為"IM")。添加HotStarTaq(QIAGEN公司)15iiL、試樣DNA溶液2iiL、EPM2AIP-F(序列編號1)的引物和EPM2AIP-R(序列編號2)的引物各0.4iiM(最終濃度)，使EPM2AIP-IU(序列編號3)的引物或EPM2AIP-IM(序列編號4)的引物濃度變化而添加，制備合計(jì)30yL的PCR反應(yīng)溶液，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。EPM2AIP-IU(序列編號3)的引物或EPM2AIP-IM(序列編號4)的引物以最終濃度(pM)為下述表l所示的數(shù)值的方式變化而添加。此外，表中記為"C"的體系為沒有添加IU和IM任一者的體系。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)如下進(jìn)行以95。C進(jìn)行15分鐘，然后以95。C20秒、59。C40秒、72°C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、57。C30秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行7個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、55t:30秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72t:進(jìn)行7分鐘。PCR擴(kuò)增工序后，使用限制酶Hhal，在37t:進(jìn)行12小時(shí)處理，用2.5%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳。將其結(jié)果示于圖1。在圖1中，SM表示尺寸標(biāo)記物，各列表示表1的各體系。U表示非甲基化PCR產(chǎn)物的條帶，M表示將甲基化PCR產(chǎn)物用限制酶分解而生成的2個(gè)條帶。另外，EPM2AIP基因的Hi-SA法合計(jì)進(jìn)行6次，算出沒有被限制酶切斷的PCR產(chǎn)物的比例(％)。在本實(shí)施例中，沒有被限制酶切斷的PCR產(chǎn)物可以認(rèn)為是以非甲基化DNA為模板而擴(kuò)增的產(chǎn)物。將這些結(jié)果示于圖2和表2。應(yīng)說明的是，將以非甲基化DNA為模板而擴(kuò)增的產(chǎn)物稱為非甲基化PCR產(chǎn)物，將以甲基化DNA為模板而擴(kuò)增的產(chǎn)物稱為甲基化PCR產(chǎn)物。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將特異性引物的濃度、以及能檢測出的非甲基化PCR產(chǎn)物、甲基化PCR產(chǎn)物的檢測量以曲線表示的圖示于圖2。可以確認(rèn)，用于檢測非甲基化、甲基化的特異性引物的濃度，相對于Hi-SA法的非特異性引物的濃度，直到l/2量為止顯示出加性效果，但在l/2量以上不顯示效果。由以上結(jié)果可知，通過使識別非甲基化DNA或甲基化DNA的特異性引物的比例變化，能夠以任意比率擴(kuò)增甲基化DNA和非甲基化DNA兩者并進(jìn)行檢測。此外，能夠獲得相加的特異性引物的效果可以推測為是特異性引物和非特異性引物的濃度比為l:2時(shí)。直到特異性引物為非特異性引物的濃度的1/2為止，特異性引物的濃度和目標(biāo)非甲基化或甲基化DNA的PCR產(chǎn)物的濃度可以確認(rèn)為相加性(直線性)關(guān)系。(實(shí)施例3)然后，對于RASSF2A基因的啟動子區(qū)域，與實(shí)施例2同樣地設(shè)定Hi-SA法引物(圖3A)，甲基化DNA和非甲基化DNA使用1:1的試樣進(jìn)行IU和IM效果的確認(rèn)。應(yīng)說明的是，在圖3A中，上部的灰色方塊表示非翻譯區(qū)域的外顯子，其上方的箭頭表示轉(zhuǎn)錄開始部。中央實(shí)線上的豎線表示各CpG部位。豎線上的菱形表示限制酶識別部位。下部的粗線表示由COBRA法或Hi-SA法得到的PCR產(chǎn)物。其下的箭頭表示IM引物。另外，使用實(shí)施例1中制作的各種混合比例的9種DNA試樣，進(jìn)行C0BRA法和Hi-SA法，進(jìn)行Hi-SA法效果的確認(rèn)。(實(shí)施例3-l)能夠擴(kuò)增RASSF2A基因的啟動子區(qū)域的Hi-SA法引物如下所示。RASSF2A-F:5，-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA(序列編號5)RASSF2A-R:5，-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA(序列編號6)RASSF2A-IU:5，-CCAACCAAACTAAACAAACAATAACCA(序列編號7)RASSF2A-M:5'-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG(序列編號8)RASSF2A-F(序列編號5)和RASSF2A-R(序列編號6)為非特異性引物，設(shè)計(jì)為既與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交又與存在非甲基化胞嘧啶的DNA雜交，通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到160bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。RASSF2A-IU(序列編號7)設(shè)計(jì)為僅與存在非甲基化胞嘧啶的DNA雜交，RASSF2A-IM(序列編號8)設(shè)計(jì)為僅與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交。添加HotStarTaq(QIAGEN公司)15iiL、試樣DNA溶液2iiL、RASSF2A-F(序列編號5)的引物和RASSF2A-R(序列編號6)的引物各0.4yM(最終濃度)，使RASSF2A-IU(序列編號7)的引物或RASSF2A-IM(序列編號8)的引物濃度變化而添加，制備合計(jì)30yL的PCR反應(yīng)溶液，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。RASSF2A-IU(序列編號7)的引物或RASSF2A-IM(序列編號8)的引物以最終濃度(iiM)為0.8、0.4、Q.2、0.1的方式添加。13PCR擴(kuò)增反應(yīng)如下進(jìn)行以95。C進(jìn)行15分鐘，然后以95。C20秒、59。C40秒、72°C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、57。C30秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行7個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、55t:30秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72t:進(jìn)行7分鐘。PCR擴(kuò)增工序后，使用限制酶Hhal，在37t:進(jìn)行12小時(shí)處理，用3X瓊脂凝膠進(jìn)行電泳。圖3B中示出其結(jié)果。圖3中，SM表示尺寸標(biāo)記物，各列表示加入的非甲基化或甲基化特異性引物的濃度(yM)。U表示非甲基化PCR產(chǎn)物的條帶，M表示將甲基化PCR產(chǎn)物用限制酶分解而生成的2個(gè)條帶。與實(shí)施例2同樣地確認(rèn)了IU或IM引物的效果。(實(shí)施例3-2)然后，為了檢測甲基化DNA，對于RASSF2A基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行COBRA法和Hi-SA法。使用實(shí)施例1中制作的9種混合比例的DNA試樣，進(jìn)行COBRA法和Hi-SA法的甲基化檢測靈敏度的研究。能夠擴(kuò)增RASSF2A基因的啟動子區(qū)域的COBRA法引物與Hi-SA法同樣使用RASSF2A-F(序列編號5)禾PRASSF2A-R(序列編號6)。本實(shí)施例中，由于以檢測甲基化DNA為目的，因此Hi-SA法中的特異性引物僅使用作為甲基化特異性引物的RASSF2A-IM(序列編號8)。COBRA法的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15iiL、各引物0.4iiM(最終濃度)、各DNA試樣(實(shí)施例1中制備)2iiL、合計(jì)30yL的PCR反應(yīng)溶液。Hi-SA法的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，使用HotStarT叫(QIAGEN公司)15iiL、非特異性引物各0.4iiM(最終濃度)、特異性引物0.2iiM(最終濃度)、各DNA試樣(實(shí)施例1中制備)2iiL、合計(jì)30iiL的PCR反應(yīng)溶液。Hi-SA法和COBRA法的擴(kuò)增反應(yīng)均如下進(jìn)行以95"進(jìn)行15分鐘，然后以95°C20秒、59。C40秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、57。C30秒、72°C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行7個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、55。C30秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72t:進(jìn)行7分鐘。PCR擴(kuò)增工序后，使用限制酶HhaI，在37t:進(jìn)行12小時(shí)處理，用3%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳。將RASSF2A基因的啟動子區(qū)域的Hi-SA法和COBRA法的結(jié)果示于圖3C。在圖3C中，SM表示尺寸標(biāo)記物，各列的數(shù)值表示試樣DNA中的甲基化DNA的比率(％)。箭頭表示甲基化PCR產(chǎn)物的分解物。COBRA法以1%的甲基化檢測為檢測限，但根據(jù)本實(shí)施例的引物比率，Hi-SA法能夠進(jìn)行O.1%的甲基化檢測。這樣，Hi-SA法能夠高靈敏度地檢測出作為目標(biāo)的DNA的非甲基化或甲基化。(實(shí)施例4)與實(shí)施例3-2同樣，以甲基化DNA的檢測為目的，對3個(gè)區(qū)域進(jìn)行了COBRA法和Hi-SA法。進(jìn)行研究的區(qū)域是SFRP2、R印rimo、APC基因的啟動子區(qū)域(圖4)，這些是在大腸癌中報(bào)道被甲基化的基因的啟動子區(qū)域。圖4中，中央的實(shí)線表示各基因。上部的灰色方塊表示非翻譯區(qū)域的外顯子，上部的黑色方塊表示翻譯區(qū)域的外顯子，方塊上方的箭頭表示轉(zhuǎn)錄開始部。中央實(shí)線上的豎線表示各CpG部位。豎線上的菱形表示限制酶識別部位。下部的粗線表示由COBRA法或Hi-SA法得到的PCR產(chǎn)物。其下的箭頭表示IM引物。使用實(shí)施例1中制作的10種試樣，進(jìn)行COBRA法和Hi_SA法的甲基化檢測靈敏度的研究。(i)SFRP2基因能夠擴(kuò)增SFRP2基因的啟動子區(qū)域的COBRA法引物如下所示。SFRP2-F:5，-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG(序列編號9)SFRP2-R:5，-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC(序列編號10)SFRP2-F(序列編號9)和SFRP2_R(序列編號10)設(shè)計(jì)為既與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交又與存在非甲基化胞嘧啶的DNA雜交。通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到139bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。能夠擴(kuò)增SFRP2基因的啟動子區(qū)域的Hi-SA法引物如下所示。SFRP2-F:5，-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG(序列編號9)SFRP2-R:5，-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC(序列編號10)SFRP2-M:5，—CGGAGTTTTTCGGAGTTGC(序列編號11)SFRP2-F(序列編號9)和SFRP2-R(序列編號10)為與COBRA法相同的非特異性引物，通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到139bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。SFRP2-IM(序列編號11)設(shè)計(jì)為僅與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交。(ii)R印rimo基因能夠擴(kuò)增R印rimo基因的啟動子區(qū)域的COBRA法引物如下所示。R印-F:5，-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列編號12)R印-R:5，-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC(序列編號13)R印-F(序列編號12)和R印-R(序列編號13)設(shè)計(jì)為既與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交又與存在非甲基化胞嘧啶的DNA雜交。通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到138bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。能夠擴(kuò)增R印rimo基因的啟動子區(qū)域的Hi_SA法引物如下所示。R印-F:5，-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列編號12)R印-R:5，-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC(序列編號13)R印-頂5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG(序列編號14)R印-F(序列編號12)和R印-R(序列編號13)為與COBRA法相同的非特異性引物，通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到138bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。R印-IM(序列編號14)設(shè)計(jì)為僅與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交。(iii)APC基因能夠擴(kuò)增APC基因的啟動子區(qū)域的COBRA法引物如下所示。APC-F1:5'-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列編號15)APC-R:5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC(序列編號16)APC-Fl(序列編號15)和APC-R(序列編號16)設(shè)計(jì)為既與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交又與存在非甲基化胞嘧啶的DNA雜交。通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到156bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。能夠擴(kuò)增APC基因的啟動子區(qū)域的Hi-SA法引物如下所示。15APC-F2:5，-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG(序列編號17)APC-R:5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC(序列編號16)APC-IM:5'-ACCAATACAACCACATATCGATCACG(序列編號18)APC-F2(序列編號17)和APC-R(序列編號16)為與COBRA法相同的非特異性引物，通過這2個(gè)引物，無論有無甲基化胞嘧啶，都得到138bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。APC-IM(序列編號18)設(shè)計(jì)為僅與存在甲基化胞嘧啶的DNA雜交。應(yīng)說明的是，APC-F2(序列編號17)和APC-R(序列編號16)的序列中的N為肌苷酸(1)。(iv)擴(kuò)增工序COBRA法的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15iiL、各引物10mM(最終濃度)、各DNA試樣(實(shí)施例1中制備)2yL、合計(jì)30yL的PCR反應(yīng)溶液。Hi-SA法的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15iiL、非特異性引物各0.4iiM(最終濃度)、特異性引物0.2iiM(最終濃度)、各DNA試樣(實(shí)施例1中制備)2iiL、合計(jì)30iiL的PCR反應(yīng)溶液。對于SFRP2基因的擴(kuò)增反應(yīng)，Hi-SA法和COBRA法均如下進(jìn)行以95。C進(jìn)行15分鐘，然后以95°C20秒、58°C40秒、72°C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、56。C30秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行8個(gè)循環(huán)，然后以95°C20秒、54。C30秒、72°C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，以95°C20秒、52。C30秒、72。C20秒為1個(gè)循環(huán)合計(jì)進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，最后在72t:進(jìn)行7分鐘。對于R印rimo基因和APC基因的擴(kuò)增反應(yīng)，Hi-SA法和COBRA法均以與RASSF2A相同的條件(實(shí)施例3)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增工序后，對于Hi-SA法和COBRA法均進(jìn)行如下操作對SFRP2的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用限制酶BssHII(NewEnglandBioLab公司)，在50。C進(jìn)行12小時(shí)處理，對R印rimo禾口APC的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用限制酶Taql(NewEnglandBioLab公司)，在65。C，進(jìn)行12小時(shí)處理。將各區(qū)域的Hi-SA法和COBRA法的結(jié)果示于圖5。圖5中，SM表示尺寸標(biāo)記物，各列的數(shù)值表示試樣DNA中的甲基化DNA的比率(％)。箭頭表示甲基化PCR產(chǎn)物的分解物。SFRP2基因、R印rimo基因和APC基因的各啟動子區(qū)域中，COBRA法以0.55%的甲基化檢測為檢測限，但Hi-SA法顯示出COBRA法510倍的靈敏度。這樣，Hi-SA法能夠高靈敏度地檢測出作為目標(biāo)的DNA的非甲基化或甲基化。另外，雖然在各基因中使用了不同種類的限制酶(對RASSF2A基因使用Hhal(實(shí)施例3)，對SFRP2基因使用BssHII，對R印rimo基因和APC基因使用T叫I)，但與限制酶的種類無關(guān)顯示出同樣的效果。由以上可以預(yù)測，Hi-SA法可以與擴(kuò)增的基因或基因位點(diǎn)的部位、限制酶的效果無關(guān)地使用。即，可以認(rèn)為Hi-SA法能夠普遍成立。可以認(rèn)為，通過改變特異性引物的濃度和序列，能夠以任意的靈敏度檢測出作為目標(biāo)的DNA的非甲基化和/或甲基化。(實(shí)施例5)然后，使用Hi-SA法，以RASSF2A基因?yàn)闃?biāo)記，以由大腸癌患者14例得到的糞便和由在大腸內(nèi)窺鏡檢查中大腸中沒有發(fā)現(xiàn)瘤的患者14例得到的糞便為對象，進(jìn)行研究。糞便樣本的核酸修飾處理通過特開2006-166712號公報(bào)(特愿2004-359471號)的方法進(jìn)行，使用得到的試樣進(jìn)行Hi-SA法。Hi-SA法與實(shí)施例3的方法同樣地進(jìn)行。將結(jié)果示于圖6。在圖6中，各列的編號表示試樣編號。SM表示尺寸標(biāo)記物，箭頭表示甲基化PCR產(chǎn)物的分解物，M表示檢測出了甲基化。對于RASSF2A基因的甲基化，來源于大腸患者的糞便樣本在14例中檢測出6例(43%)，來源于健康者的糞便樣本在14例中檢測出0例(0%)。(實(shí)施例6)DNA試樣的制備從大腸正常粘膜提取DNA。對于從大腸正常粘膜提取出的DNA，各基因的啟動子區(qū)域的CpG區(qū)域基本上為非甲基化。因此，由從大腸正常粘膜提取出的DNA篩選已確認(rèn)為非甲基化的DNA，作為"非甲基化DNA"。"甲基化DNA"通過將該"非甲基化DNA"用Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行處理而得到。對于各DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽(bisulfite)處理。處理后，將僅為非甲基化DNA的試樣作為U(非甲基化DNA的對照)，將甲基化DNA作為M(甲基化DNA的對照)。(實(shí)施例7)通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法進(jìn)行試樣DNA的擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用于序列分析儀進(jìn)行非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物和/或甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。引物使用附加有熒光物質(zhì)的引物。將使用該熒光物質(zhì)的方法也稱為熒光Hi-SA法。在實(shí)施例3和實(shí)施例4中使用的RASSF2A基因、SFRP2基因、R印rimo基因、APC基因中，使用實(shí)施例6中制作的試樣，進(jìn)行熒光Hi-SA法。對于各基因的區(qū)域，使用以下的附加有熒光物質(zhì)的引物。(i)RASSF2A基因RASSF2A-F:5'-FAM-TGAAGAGYGAGAGAAAAGAGAGGA(序列編號5)RASSF2A-R:5'-TCCAACCAAACTAAACAAACRATAA(序列編號6)RASSF2A-M:5'-CCAACCAAACTAAACAAACGATAACCG(序列編號8)(ii)SFRP2基因SFRP2-F:5，-GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG(序列編號9)SFRP2-R:5，-NED-ACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC(序列編號10)SFRP2-M:5，-CGGAGTTTTTCGGAGTTGC(序列編號11)(iii)R印rimo基因R印-F:5，-GGTTTTGTGTTTTATTGYGGAGTG(序列編號12)R印-R:5，-VIC-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCC(序列編號13)R印-頂5'-AAAAATTTCCCAAAAACCTCTCCGACG(序列編號14)(iv)APC基因APC-F2:5'-PET-GGTTTTGTGTTTTATTGNGGAGTG(序列編號17)APC-R:5'-CACCAATACAACCACATATCNATCAC(序列編號16)APC-M:5'-ACCAATACAACCACATATCGATCACG(序列編號18)熒光Hi-SA法的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，使用HotStarTaq(QIAGEN公司)15iiL、非特異性引物各0.4PM(最終濃度)、特異性引物0.2iiM(最終濃度)、各DNA試樣(實(shí)施例6中制備)2iiL、合計(jì)30iiL的PCR反應(yīng)溶液。擴(kuò)增反應(yīng)按照實(shí)施例4進(jìn)行。將RASSF2A基因和SFRP2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物各1PL混合，用限制酶Hhal，在37。C進(jìn)行10小時(shí)處理。將R印rimo基因和APC基因的擴(kuò)增產(chǎn)物各1PL混合，用限制酶T叫I，在65t:進(jìn)行10小時(shí)處理。采集將RASSF2A基因和SFRP2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物各1PL混合并用限制酶Hhal進(jìn)行了處理的產(chǎn)物1yL、以及將R印rimo基因和APC基因的擴(kuò)增產(chǎn)物各1PL混合并用限制酶T叫I進(jìn)行了處理的產(chǎn)物1yL，加入超純水98L制成100L，由該溶液取出IPL應(yīng)用于序列分析儀(ABI310RGeneticAnalyzer)。數(shù)據(jù)的獲取包括預(yù)載在內(nèi)約需1小時(shí)。為了比較檢測靈敏度，對各擴(kuò)增產(chǎn)物(PCR反應(yīng)液10iiL)用3%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳。將結(jié)果示于圖7。表示各RASSF2A基因、SFRP2基因、R印rimo基因、APC基因的結(jié)果。對于各區(qū)域，上段表示使用對照(僅為非甲基化DNA的試樣)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，下段表示使用甲基化DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。另外，左面的波形為序列分析儀的結(jié)果，右面的照片為電泳的結(jié)果。SM表示尺寸標(biāo)記物，白色箭頭表示非甲基化PCR產(chǎn)物，灰色箭頭表示甲基化PCR產(chǎn)物的分解物。對于使用序列分析儀的熒光Hi-SA法，可知比使用電泳的Hi-SA法靈敏度高，能夠檢測出甲基化DNA或非甲基化DNA。(實(shí)施例8)通過使用以熒光物質(zhì)標(biāo)記的引物的Hi-SA法，以由大腸腺瘤性息肉病患者和大腸癌患者得到的糞便為對象進(jìn)行研究。糞便樣本的核酸修飾處理通過特開2006-166712號公報(bào)(特愿2004-359471號)的方法進(jìn)行。作為標(biāo)記物使用實(shí)施例7中記載的4個(gè)區(qū)域，與實(shí)施例7的方法同樣地進(jìn)行熒光Hi-SA法。將結(jié)果示于圖8。各患者的波形從上段開始表示RASSF2A基因、R印rimo基因、SFRP2基因、APC基因的結(jié)果。對于各區(qū)域，白色箭頭表示非甲基化PCR產(chǎn)物，灰色箭頭表示甲基化PCR產(chǎn)物的分解物。由這些結(jié)果可知，即使是使用序列分析儀時(shí)，也能夠高靈敏度地檢測出糞便樣本中的甲基化DNA和非甲基化DNA。產(chǎn)業(yè)上的可應(yīng)用性如以上說明所述，本發(fā)明的方法可以與擴(kuò)增的基因和/或基因位點(diǎn)的部位、限制酶無關(guān)地實(shí)施。另外，通過改變特異性引物的濃度和序列，使靈敏度任意上升，能夠檢測出作為目標(biāo)的核酸的非甲基化或甲基化。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠正確且高靈敏度地檢測出有無甲基化或非甲基化，另外，還能夠定量地檢測出甲基化核酸和/或非甲基化核酸。另外，本發(fā)明的檢查方法能夠由機(jī)體樣本、尤其是由糞便樣本來判定大腸中存在的癌。實(shí)施例中示出的基因啟動子區(qū)域的甲基化的有無表示，能夠通過本方法由糞便檢測來源于正常粘膜組織的DNA或來源于大腸癌組織的DNA的甲基化的有無。像這樣能夠在實(shí)用上利用非侵害性DNA材料，不僅在各種疾病的診斷上有用，而且能夠在操作上處理多個(gè)樣本，因此能夠進(jìn)行以正常群體為對象的對大腸癌等的各種診斷的應(yīng)用。另外，已知糞便難以進(jìn)行DNA的提取和精制，因此可以認(rèn)為，本發(fā)明的方法不僅能夠使用糞便、還能夠?qū)崿F(xiàn)使用各種機(jī)體樣本的應(yīng)用。因此，本方法不僅能夠應(yīng)用于大腸癌的診斷，還能夠應(yīng)用于對廣泛的各種存在于各臟器的癌、瘤的診斷，另外，還可以認(rèn)為能對該瘤進(jìn)行某種程度的預(yù)測。權(quán)利要求一種核酸擴(kuò)增方法，其特征在于，是來源于生物學(xué)試樣中可能含有的目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)的含CpG核酸的擴(kuò)增方法，包含使用引物組來擴(kuò)增該含CpG核酸的工序，所述引物組至少含有不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物、以及區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第2引物，第2引物具有與第1引物實(shí)質(zhì)相同的引物區(qū)域。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，在第1引物的序列中含有至少1個(gè)CpG部位，并且與該CpG部位的胞嘧啶對應(yīng)的位置的堿基，被混合堿基(Y)和/或混合堿基(R)和/或肌苷酸(I)取代。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，在第2引物的序列中含有至少2個(gè)CpG部位，并且，該CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特異性存在。4.根據(jù)權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，擴(kuò)增是通過聚合酶鏈反應(yīng)PCR進(jìn)行的。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，進(jìn)一步使用第3引物，所述第3引物是不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的引物，具有與第1引物或第2引物成對地?cái)U(kuò)增核酸的功能。6.根據(jù)權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，第1引物和第2引物的濃度比為io:ii:i。7.根據(jù)權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，在所述擴(kuò)增工序之前，包含如下工序使生物學(xué)試樣與修飾非甲基化胞嘧啶的試劑接觸，將能夠存在于生物學(xué)試樣中的核酸的非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，從而對生物學(xué)試樣進(jìn)行處理。8.—種檢測生物學(xué)試樣中可能含有的目標(biāo)基因和/或基因位點(diǎn)中的甲基化和/或非甲基化的方法，其特征在于，包含權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的方法。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其中，包含利用限制酶處理擴(kuò)增片段，該限制酶識別擴(kuò)增片段的序列中除引物區(qū)域以外的序列中存在的CG或TG。10.—種引物組，其特征在于，至少含有不區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物，以及區(qū)分非甲基化核酸和甲基化核酸、且具有與第1引物實(shí)質(zhì)相同的引物區(qū)域的第2引物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的引物組，其中，用于權(quán)利要求19中任一項(xiàng)所述的方法。12.—種試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求11所述的引物組。全文摘要本發(fā)明的課題在于，提供能夠?qū)⑸飳W(xué)試樣中存在的甲基化核酸和非甲基化核酸兩者擴(kuò)增，進(jìn)而能夠適當(dāng)調(diào)節(jié)甲基化核酸和/或非甲基化核酸的擴(kuò)增率的基因擴(kuò)增方法。該課題通過如下的擴(kuò)增方法解決，即，使用與甲基化和非甲基化核酸都能雜交的非特異性引物、及與甲基化或非甲基化核酸特異性雜交的特異性引物的擴(kuò)增方法；進(jìn)而，通過使這些引物的混合率發(fā)生變化而使甲基化核酸或非甲基化核酸的擴(kuò)增率發(fā)生變化的擴(kuò)增方法。文檔編號C12Q1/68GK101796185SQ20088001822公開日2010年8月4日申請日期2008年6月3日優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日發(fā)明者屜本博美,松原長秀,永坂岳司,田中紀(jì)章申請人:拜奧-迪克薩姆合同會社