專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蛋白定向進(jìn)化是指通過(guò)模擬自然進(jìn)化機(jī)制、人為創(chuàng)造特殊進(jìn)化條件，從一個(gè)或多個(gè)已存在的親本蛋白出發(fā)，經(jīng)過(guò)基因突變和重組來(lái)改變蛋白基因序列和創(chuàng)造蛋白分子的多樣性，從而構(gòu)建人工蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)，進(jìn)一步結(jié)合靈敏的、高通量的篩選技術(shù)可以迅速獲得理想的進(jìn)化蛋白，所以又稱(chēng)為蛋白體外分子進(jìn)化(KolkmanJA,Ste,erWPC.Directedevolutionofproteinsbyexonshuffling.NatureBiotechnology,19:423-428,2001.)。蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化可以引起蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生多種變化，其功能也相應(yīng)出現(xiàn)一些精細(xì)的改變，從而產(chǎn)生具有許多優(yōu)良性狀的蛋白質(zhì)，可以極大地發(fā)展和豐富蛋白質(zhì)資源。許多天然蛋白質(zhì)、酶、抗體或細(xì)胞因子經(jīng)改造后，其特性和活性都得到了明顯的改進(jìn)，如改變了蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，提高了蛋白質(zhì)的耐熱性和(或)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了半衰期，提高了酶分子的酶活性、專(zhuān)一性和對(duì)極端環(huán)境的耐受性，增強(qiáng)了對(duì)變性劑和表面活性劑的抗性或與其相應(yīng)配體的親和性，改變了對(duì)輔因子的需求以及對(duì)抗體的親和性等，從而更適于臨床或工業(yè)用途(ShoebAhmada，Md.ZahidKamal，RajanSankaranarayanan,andN.MadhusudhanaRao.Thermostable"3"'J7i/sswZ^7j'51Lipases:InVitroEvolutionandStructuralInsight.JournalofMolecularBiology.381(2):324-340,2008)。應(yīng)用各種基因突變方法改造蛋白質(zhì)基因和構(gòu)建基因突變庫(kù)需要高效的表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)由于具有操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉、外源基因表達(dá)產(chǎn)物水平高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是研究最為深入、發(fā)展最為完善、使用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，但是在表達(dá)異源蛋白時(shí)易形成無(wú)活性的包涵體。枯草芽孢桿菌是一種好氧、產(chǎn)孢子的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛存在于土壤與植物中，是一種安全的工程菌株。枯草芽孢桿菌含有多種類(lèi)型信號(hào)肽，能直接將許多蛋白分泌到胞外，如Sac型信號(hào)肽、雙精氨酸信號(hào)肽、脂蛋白信號(hào)肽等(TjalsmaH，BolhuisA，JongbloedJDH,etal.Signalpeptidedependentproteintransportinfeci77w515Y/Z^7is:Agenomebasedsurveyofthesecretome[J].MicrobiolMolBiolR.64:515-547,2000)，重組蛋白常常能以可溶的形式分泌到培養(yǎng)基中，并具有活性，因此枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)在各種工業(yè)生產(chǎn)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用(DeBoerAS，DiderichsenB.Onthesafetyofjfec^/7"5"幼Z"h'sand丑柳7JaZj'(7we/"acie/3s:areview.ApplMicrobiolBiotechnol.36:1-4,1991.)。例如利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)a-淀粉酶的產(chǎn)量可以達(dá)到卜3g/L、酯酶A產(chǎn)量達(dá)到600mg/L，胰島素原的產(chǎn)量達(dá)到lg/L，葡聚糖內(nèi)切酶的產(chǎn)量達(dá)到8300U/L等(WestersL，WestersH,QuaxWJ.5aciL/wssw/fi2isascellfactoryforpharmaceuticalproteins:abiotechnologicalapproachtooptimizethehostorganism.BiochimBiophysActa.1694(1-3):299-310，2004)。隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，枯草芽孢桿菌作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，外源DNA的轉(zhuǎn)化效率低，而且可用的表達(dá)載體相當(dāng)有限，所以采用傳統(tǒng)方法在枯草芽孢桿菌操作系統(tǒng)內(nèi)建立蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)具有一定的難度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體，包括如下元件枯草芽孢桿菌的復(fù)制起始蛋白的編碼序列、枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子序列、分泌型信號(hào)肽的編碼序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列。所述分泌型信號(hào)肽具體可為果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽，所述枯草芽孢桿菌的復(fù)制起始蛋白具體可為R印B蛋白、所述枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子序列具體可為P43啟動(dòng)子序列、所述大腸桿菌的復(fù)制起始序列具體可為PBR322復(fù)制起始序列。所述果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽具體可為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。所述R印B蛋白具體可為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列5的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的由序列5衍生的蛋白質(zhì)。5所述果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽的編碼序列具體可為如下l)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的D織序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；所述R印B蛋白的編碼序列具體可為如下4)或5)或6)的DNA分子4)其編碼序列是序列表中序列4所示的咖A分子；5)在嚴(yán)格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；6)與4)或5)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；所述P43啟動(dòng)子序列具體可為如下7)或8)的DNA分子7)其編碼序列是序列表中序列6所示的DNA分子；8)與7)限定的DNA序列具有909i以上同源性，且具有相同功能的DNA分子；所述pBR322復(fù)制起始序列具體可為如下9)或IO)的DNA分子9)其編碼序列是序列表中序列7所示的DNA分子；10)與9)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。所述載體還可包括抗菌素編碼基因和多克隆位點(diǎn)序列；所述多克隆位點(diǎn)序列與所述分泌型信號(hào)肽的編碼序列相接，且位于所述分泌型信號(hào)肽的下游。所述抗菌素編碼基因具體可為卡那霉素抗性基因和/或氨節(jié)青霉素抗性基因。具體來(lái)說(shuō)，所述穿梭表達(dá)載體自上游至下游依次可以包括以下元件果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽的編碼序列、多克隆位點(diǎn)序列、復(fù)制起始蛋白R(shí)印B的編碼序列、卡那霉素抗性基因、P43啟動(dòng)子序列、氨節(jié)青霉素抗性基因、pBR322復(fù)制起始序列。所述穿梭表達(dá)載體優(yōu)選圖1所示的重組表達(dá)載體。具體來(lái)說(shuō)，以果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽序列起始密碼子ATG的A作為質(zhì)粒的第一位，沿順時(shí)針?lè)较?，所述穿梭表達(dá)載體的元件如下自1至87位為果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽的編碼序列，因此重組蛋白能分泌到細(xì)胞外；自78至106位為多克隆位點(diǎn)序列，用于外源蛋白編碼基因的插入；自481至1485位為復(fù)制起始蛋白R(shí)印B的編碼序列，因此能在枯草芽孢桿菌內(nèi)自主復(fù)制；自1645至2415位為卡那霉素抗性基因，因此具有卡那霉素抗性，便于篩選；自3420至3724位為P43啟動(dòng)子序列，由兩個(gè)重疊啟動(dòng)子組成，能被枯草芽孢桿菌的e-27和e-55RNA聚合酶識(shí)別，因此能在枯草芽孢桿菌內(nèi)大量表達(dá)外源蛋白；自4363至5223位為氨卞青霉素抗性基因，因此具有氨芐青霉素抗性，便于篩選；自5378至5997位為pBR322復(fù)制起始序列，因此能在大腸桿菌內(nèi)自主復(fù)制。所述的穿梭表達(dá)載體可應(yīng)用于外源基因的克隆表達(dá)中。本發(fā)明還保護(hù)所述穿梭表達(dá)載體在獲得重組枯草芽孢桿菌中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種建立蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)的方法，包括如下步驟1)對(duì)目的蛋白的編碼基因進(jìn)行突變；2)將突變基因插入所述穿梭表達(dá)質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；3)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至枯草芽胞桿菌內(nèi)；4)篩選含有所述突變基因的枯草芽孢桿菌，得到蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)。所述步驟l)中，對(duì)目的蛋白的編碼基因進(jìn)行突變的方法可為如下方法的任意一種易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Error-pronePCR)、基因重排(DNAshuffling)、基因家族重排(familyshuffling)、交錯(cuò)延伸、隨機(jī)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、臨時(shí)模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)、異源重組。所述目的蛋白不僅限于實(shí)施例中所涉及的堿性蛋白酶，還可為其它酶，如蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、半乳糖酶等；所述目的蛋白還可為酶分子以外的蛋白質(zhì)，如抗體、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等。本發(fā)明中所涉及的轉(zhuǎn)化過(guò)程既可是化學(xué)轉(zhuǎn)化法也可是電穿孔轉(zhuǎn)化方法，可以根據(jù)已知的技術(shù)靈活操作。對(duì)目的蛋白的編碼基因進(jìn)行突變是在分子水平上進(jìn)行的一種反復(fù)突變、重組的過(guò)程，其得到的重排產(chǎn)物的集合稱(chēng)為基因突變庫(kù)，將基因突變庫(kù)中的突變基因進(jìn)行克隆、連接載體、轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，其得到的所有含突變基因的轉(zhuǎn)化子的集合稱(chēng)為蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)。通過(guò)篩選、分析及多輪篩選，進(jìn)一步對(duì)突變體基因庫(kù)進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體組成下一輪突變的模板，重復(fù)上述步驟進(jìn)行多次重排和篩選，最終獲得理想的性狀。本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體，既能在大腸桿菌內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制，又能在枯草芽孢桿菌內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制，可以快速有效地在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系內(nèi)建立蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)，從而為篩選性狀優(yōu)良的蛋白質(zhì)提供了有效的途徑。本發(fā)明提供的構(gòu)建蛋白基因突變庫(kù)的方法包括首先將突變基因連入表達(dá)質(zhì)粒pBSST385中，使各種突變基因在大腸桿菌DH5。中復(fù)制，再將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)和篩選。本發(fā)明的基因突變庫(kù)是以枯草芽孢桿菌表達(dá)體系為基礎(chǔ)構(gòu)建的，由于枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，外源DNA的轉(zhuǎn)化效率很低，故采用傳統(tǒng)方法直接將基因突變產(chǎn)物連接至載體上轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌細(xì)胞時(shí)很難達(dá)到理想的突變庫(kù)容量。而本發(fā)明借助于轉(zhuǎn)化效率高的大腸桿菌DH5。，建立突變庫(kù)的效率相當(dāng)于大腸桿菌，并且可以簡(jiǎn)單靈活的控制庫(kù)容量大小，同時(shí)充分利用了枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞的外分泌表達(dá)能力，從而方便了突變庫(kù)性能的檢測(cè)和篩選。本發(fā)明所提供的質(zhì)粒和構(gòu)建突變庫(kù)的方法有效地增加了枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)突變庫(kù)的庫(kù)容量，進(jìn)而可以有效快速地篩選所需蛋白。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體pBSST385的質(zhì)粒圖譜。圖2為pBSST385-apr質(zhì)粒酶切電泳圖。圖3為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖4為易錯(cuò)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖5為易錯(cuò)PCR產(chǎn)物的脫氧核糖核苷酸酶(DNaseI)酶切鑒定圖。圖6為無(wú)引物PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖7為有引物PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖8為本發(fā)明的方法建立突變庫(kù)的效果。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售常規(guī)試劑，可從生化試劑商店購(gòu)得。實(shí)施例1、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建一、果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽序列和P43啟動(dòng)子序列的克隆選用攜帶有EcoRI、SacII酶切位點(diǎn)的引物A和攜帶有HindIII、SphI酶切位點(diǎn)的引物B，以枯草芽孢桿菌W168(中國(guó)普通微生物保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC1.1390)(KunstF,OgasawaraN，MoszerI,AlbertiniAM,AlloniG,AzevedoV，BerteroMG,Bessi6resP，BolotinA,BorchertS，BorrissR，BoursierL,BransA,BraunM,BrignellSC，BronS,BrouilletS，BruschiCV，CaldwellB,C即uanoV，CarterNM'ChoiSK,CodaniJJ，ConnertonIF,Danchin4，etal.Thecompletegenomesequenceofthegram—positivebacteriumBacillussubtilis.Nature.390(6657):249-56，1997)(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)的基因組DNA為模板，通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽序列。引物A:5'-ATGAATTCACCGCGGAGGAGGGCTGGAAGAA—3';引物B:5，CGGCATGCAAGCTTAGTTGCGCCTCCTGCCAG3,。電泳純化PCR產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證所獲得的DNA序列，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物含有正確的果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽序列(SEQIDNo:1)。選用攜帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的引物C和攜帶有SacII酶切位點(diǎn)的引物D，以枯草芽孢桿菌W168的基因組DNA為模板擴(kuò)增P43啟動(dòng)子。引物C:5'-GCCGAATTCGAGCTCAGCATTATTGAGTGG-3';引物D:5'-GTGCCGCGGGCTATCACTTTATATTTTACAT-3'。電泳純化PCR產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證所獲得的DNA序列，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物含有正確的P43啟動(dòng)子序列(SEQIDNo:6)。二、P43啟動(dòng)子-SacB信號(hào)肽-多克隆位點(diǎn)序列的克隆將步驟一獲得的果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶(SacB)基因信號(hào)肽序列連入到pMD19T載體(寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)D102A)上，獲得含有SacB信號(hào)肽的質(zhì)粒，命名為pSacT。用HindIII和SphI完全消化pSacT;將合成的多克隆位點(diǎn)序列(SEQIDNo:3)用同樣的酶進(jìn)行酶切；連接純化的酶切產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)D9057)，獲得含有果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒，命名為pSacMT。將pSacMT質(zhì)粒和P43啟動(dòng)子分別用SacII和EcoRI完全消化，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，獲得含有SacB信號(hào)肽、多克隆位點(diǎn)和P43啟動(dòng)子的質(zhì)粒，命名為pSacMPT。用引物A和多克隆位點(diǎn)序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得P43啟動(dòng)子-SacB信號(hào)肽-多克隆位點(diǎn)序列。二、pBSST385載體的構(gòu)建選用攜帶有SphI酶切位點(diǎn)的引物E和攜帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的引物F，以pDG148-StuI質(zhì)粒(購(gòu)自美國(guó)芽孢遺傳保藏中心(BGSC),質(zhì)粒菌編號(hào)ECE148)(JosephP，F(xiàn)antinoJR，HerbaudML,DenizotF.Rapidorientatedcloninginashuttlevectorallowingmodulatedgeneexpressionin^sci77wssw力tiiis.FEMSMicrobiolLett.205(1):91-97，2001.)(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)為模板，PCR擴(kuò)增后得到R印B-卡那霉素基因序列(測(cè)序結(jié)果表明其中的R印B如序列表的序列4所示)。將獲得的PCR產(chǎn)物用SphI和EcoRI完全酶切，然后與用SphI和EcoRI完全酶切的P43啟動(dòng)子-SacB信號(hào)肽-多克隆位點(diǎn)序列相連接，然后轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600(購(gòu)自江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心，編號(hào)B0033)中，獲得質(zhì)粒pBSS38。引物E:5，-AGGCATGCAAGCTAGCTTCAGCACA-3，，引物F:5'-CTGAATTCGCCACCTCAGCAAAGGG-3'。選用攜帶有Sacn酶切位點(diǎn)的引物G和攜帶有SacII酶切位點(diǎn)的引物H，以pUC19(大寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為D3219)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得pBR322-氨芐青霉素基因序列(測(cè)序結(jié)果表明其中的PBR322如序列表的序列7所示)。將所獲得的PCR產(chǎn)物用SacII完全酶切，克隆至質(zhì)粒pBSS38的SacII酶切位點(diǎn)間，得到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體，將其命名為pBSST385，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。引物G:5，-GTACCGCGGTTCACTGGCCGTCGTTTTAC-3';引物H:5，-ATACCGCGGAATCGTCGAACGGCAGGC-3'。實(shí)施例2、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)一、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(apr)序列克隆設(shè)計(jì)有XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)的引物對(duì)如下正向引物5，—ATCGCTCGAGTGCCGGAAAMGCAGTACAGA—3，；反向引物5，-CTAGGGTACCTTATTGTGCAGCTGCTTGT—3'。以枯草芽孢桿菌W168基因組DNA為模板，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系(50lU)如下含有5u110XPCR緩沖液，4"12.5mMdNTP混合物，0.5nl正向引物，0.5lil反向弓l物，0.5ul模板DNA，0.5n1ExTaqDNA聚合酶，加滅菌水39ul，使最終體積為50ul。PCR反應(yīng)條件94t:預(yù)變性5分鐘；繼續(xù)進(jìn)行30循環(huán)94°C30秒、55°C30秒、72°Cl分30秒；最后72。C延伸5分鐘，轉(zhuǎn)入22"C保存。切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有序列表的序列7所示的核苷酸序列，序列7為堿性蛋白酶基因apr(GenBankAccessionNumber:NC—000964自5'末端第1103814至1104872位核苷酸)自5，末端第1-1059位核苷酸，編碼序列表的序列8所示的氨基酸序列。二、酶連及其轉(zhuǎn)化1、用XhoI和KpnI完全消化堿性蛋白酶基因和實(shí)施例1制備的pBSST385載體，回收酶切產(chǎn)物。2、連接酶切純化的pBSST385和堿性蛋白酶基因，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5。與枯草芽孢桿菌WB600(六個(gè)蛋白酶基因缺失菌株)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，獲得含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/DHs。和pBSST-apr/WB600。分別提取兩個(gè)轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，用XhoI和KpnI進(jìn)行酶切驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中，1:質(zhì)粒pBSST385;2:從轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/DHsa中提取的重組質(zhì)粒pBSST-apr;3:從轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/WB600中提取的重組質(zhì)粒pBSST-apr;M:DNAmarker15,000;5:XhoI和KpnI雙酶切質(zhì)粒pBSST385的酶切產(chǎn)物；6:XhoI和KpnI雙酶切泳道2重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；7:XhoI和KpnI雙酶切泳道3重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切得到片段大約為7000bp與lOOObp，與預(yù)期大小一致。分別將pBSST385空載體導(dǎo)入DH"大腸桿菌和WB600枯草芽孢桿菌，得到轉(zhuǎn)化子pBSST385/DH5。和轉(zhuǎn)化子pBSST385/WB600，作為對(duì)照。三、重組菌株發(fā)酵表達(dá)堿性蛋白酶挑取轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/DH5a、pBSST385/DH5a、pBSST-apr/WB600和pBSST385/WB600于LB液體培養(yǎng)基(含有20ug/ml卡那霉素)，培養(yǎng)(37°C、220轉(zhuǎn)每分鐘)24小時(shí)。lOOOOrpm離心10min，收集上清；超聲波破碎菌體，12000rpm離心lOmin收集上清液。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果見(jiàn)圖3;圖3中，1:蛋白Marker;2:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/WB600的胞內(nèi)蛋白；3:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST385/WB600的胞內(nèi)蛋白；4:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/WB600的胞外蛋白；5:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST385/WB600的胞外蛋白；6和7:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/DH"的胞內(nèi)蛋白;8:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST385/DH"胞內(nèi)蛋白；9:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST-apr/DH^的胞外蛋白；10:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST385/DH"的胞外蛋白。結(jié)果表明堿性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中大量表達(dá)并分泌于培養(yǎng)液中(見(jiàn)泳道4)，而在細(xì)胞內(nèi)并沒(méi)有堿性蛋白酶的存在；在大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)外均未檢測(cè)到堿11性蛋白酶基因的表達(dá)；在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST385/WB600和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子pBSST385/DH5。的細(xì)胞內(nèi)外均未檢測(cè)到堿性蛋白酶基因的表達(dá)。實(shí)施例3、堿性蛋白酶突變體基因庫(kù)的建立一、堿性蛋白酶基因即r隨機(jī)突變和基因重排(DNAshuffling)(一)易錯(cuò)PCR突變堿性蛋白酶基因易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系10XPCR緩沖液18mMMnS044u12mMdGTP5u150XdNTP混合物lu1正向引物0.75u1反向引物0.75u1模板DNA(實(shí)施例2制備的堿性蛋白酶基因apr)0.1TaqDNA聚合酶ly1加滅菌水32yl，使最終體積為50nl。正向引物5，—ATCGCTCGAGTGCCGGAAAAAGCAGTACAGA—3，；反向引物5，—CTAGGGTACCTTATTGTGCAGCTGCTTGT—3'。易錯(cuò)PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性30秒；然后94。C30秒、55°C1分鐘、72°C1分20秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5分鐘，轉(zhuǎn)入4。C保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明PCR產(chǎn)物大小約為1000bp，與堿性蛋白酶apr基因的大小相一致。(二)堿性蛋白酶基因的基因重排1、小片段DNA的純化和回收回收堿性蛋白酶基因apr易錯(cuò)PCR產(chǎn)物，用0.001UDNasel進(jìn)行隨機(jī)酶切(10-15。C酶切10min),反應(yīng)完成后用2ul0.5mo1/LEDTA(pH8.0)和2yl10XDNALoadingbuffer終止，酶切產(chǎn)物進(jìn)行低密度瓊脂糖電泳。結(jié)果見(jiàn)圖5。回收酶切產(chǎn)物中約50250bp的片段。2、無(wú)引物PCRPCR體系(25lU):步驟1中所回收的DNA片段(50-250bp)，lOraMdNTP，超純水，PCR緩沖液和0.5UTaq酶。PCR條件94。C預(yù)變性5min;然后94。C變性lmin、48。C退火2min、72。C延伸lmin，35循環(huán)；最后72'C延伸10min;轉(zhuǎn)入4'C保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明得到了從100-2000bp的彌散條帶。(3)有引物PCRPCR體系(50ii1):無(wú)引物PCR產(chǎn)物35ix1，2.5mMdNTP4y1，上下游引物liU，無(wú)菌超純水4.5ul，PCR緩沖液5ul，5U/ulExTaq酶O.5iU。正向引物5，-ATCGCTCGAGTGCCGGAAAAAGCAGTACAGA-3，；反向引物5，_CTAGGGTACCTTATTGTGCAGCTGCTTGT—3'。PCR條件94。C預(yù)變性5min;然后94"變性lmin、55°(3退火lmin、72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；然后72。C延伸10min;轉(zhuǎn)入4。C保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果表明得到大小約為1000bp的條帶為堿性蛋白酶基因重排產(chǎn)物，與堿性蛋白酶apr的大小相一致。二、堿性蛋白酶基因突變庫(kù)I的建立方法1、用XhoI和KpnI完全酶切堿性蛋白酶基因apr隨機(jī)突變產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；用XhoI和KpnI酶切實(shí)施例1制備的pBSST385載體，回收酶切產(chǎn)物。2、切膠純化步驟1得到的兩種酶切產(chǎn)物，用快速連接試劑盒(寶生物(大連)工程有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)D6022)連接1小時(shí)。3、將步驟2得到的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，37"C培養(yǎng)14-16小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化子。4、用含有50pg/ml氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)液(每升培養(yǎng)液中含有氯化鈉5克，胰蛋白胨16克，酵母浸粉10克，pH值7.0)洗滌平板上的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，37°C搖床培養(yǎng)3-4小時(shí)。5、室溫下12，000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，收集菌體，提取質(zhì)粒DNA。6、將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含20ug/ml卡那霉素的LB平板上，37。C培養(yǎng)12-14小時(shí)，挑取平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，保存突變子，即為堿性蛋白酶基因突變文庫(kù)，將其保存于-8(TC。轉(zhuǎn)化率的計(jì)算公式為轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化子/微克突變基因。上述的方法構(gòu)建基因突變文庫(kù)，重復(fù)三次，計(jì)算所得的平均轉(zhuǎn)化率為106個(gè)轉(zhuǎn)化子/微克突變基因(見(jiàn)圖8)。13三、堿性蛋白酶基因突變庫(kù)II的建立方法1、用XhoI和KpnI完全酶切堿性蛋白酶基因重排產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；用XhoI和KpnI酶切實(shí)施例1制備的pBSST385載體，回收酶切產(chǎn)物。2-6步驟采用同步驟二的操作。上述的方法構(gòu)建基因突變文庫(kù)，重復(fù)三次，計(jì)算所得的平均轉(zhuǎn)化率為106個(gè)轉(zhuǎn)化子/微克突變基因。四、建立堿性蛋白酶基因突變庫(kù)的傳統(tǒng)方法1、設(shè)計(jì)含有XbaI和SphI酶切位點(diǎn)的引物對(duì)如下正向引物5，—ATCGTCTAGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGA—3，；反向引物5，—CTAGGCATGTTATTGTGCAGCTGCTTGT—3'。以枯草芽孢桿菌W168基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增含XbaI和SphI酶切位點(diǎn)的枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因。3、含XbaI和SphI酶切位點(diǎn)的堿性蛋白酶基因apr隨機(jī)突變和基因重排同步驟一。2、用XbaI和SphI完全酶切堿性蛋白酶基因apr隨機(jī)突變產(chǎn)物或基因重排產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；用XbaI和Sphl酶切pDG148-StuI質(zhì)粒(購(gòu)自美國(guó)芽孢遺傳保藏中心(BGSC)，質(zhì)粒菌編號(hào)ECE148)，回收酶切產(chǎn)物。3、切膠純化酶切產(chǎn)物，用快速連接試劑盒(大連寶生物公司)連接1小時(shí)。3、將步驟2得到的連接液轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含10ug/ml卡那霉素的LB平板上，37"C培養(yǎng)12-14小時(shí)，挑取平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，保存突變子，即為用傳統(tǒng)方法構(gòu)建的堿性蛋白酶基因突變文庫(kù)，將其保存于-80°C。4、重復(fù)上述步驟三次，計(jì)算平均轉(zhuǎn)化率為50個(gè)轉(zhuǎn)化子/微克突變基因(見(jiàn)圖8)。14序列表<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所〈120〉一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體及其應(yīng)用<130〉CGG應(yīng)Y82115〈160>9<210>1<211>87〈212〉腿<213>枯草芽孢桿菌(Aaci7Jys^//^i7A)〈400>1atgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctg60gcaggaggcgcaactcaagcttttgcc87〈210〉2〈211〉29〈212〉PRT<213〉枯草芽孢桿菌(^sd72〃sst/Z"";)〈400〉2MetAsnlieLysLysPheAlaLysGinAlaThrValLeuThrPheThr151015ThrAlaLeuLeuAlaGlyGlyAlaThrGinAlaPheAla2025〈210〉3<211〉58〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223><400〉3aagcttttgcctcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgc58<210>4〈211〉1005<212〉廳<213〉人工序列〈220〉<223><400>4&tgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcstttattcagatgaaa^atca60agggttttagtggacsag3Ca^aaagtggsaaagtg3g3ccatggag卿aaagaaaatc120gctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagta180aasgsttgtgctgaaatattca^33tcgtgaaacaggcgaaagaaagttg240tatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatg300a犯catggc3ttcagtcacaaaaggttgttgctgaagttagccaacagtt360cgttggttgtttctcacattaatgtttatgatggcgaaga420agtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaMgatgcaatataaaaa■16aatcttgttggttttatgcgtgcaacgg犯gtgacaata^ataataaagataattcttat540aatC3gcac3tgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaac600tacgtgaatca3aaacaatggattcaattttggaaa肌ggcaatgaaattagactatgat660cca^atgtMaagttca犯tgattcgaccgataaatcggatatacaatcg720gc犯ttgacgaaactgca^aatatcctgta卿g3t3Cggattttatgaccgatgatgaa780gaaaaga^tttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatc840tcctatggtggtttgttaaaaaaaaattaaaccttgatgacacagaagaa■ggcgatttgattcatacagatg3tgacg犯aa8gccgatgaagatggattttctattatt恥0gca3tgtgg33ttggg^Cgtttattaaagagtsg1005<210>5<211〉334<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223><400〉5MetGlyValSerPhe15AspGluLysSerArg20ArgProTrpArgGlu35LeuHislieLeuGlu50GlulieLeuGluTyr65AsnlieMetCysPro10ValLeuValAspLys25LysLyslieAlaAsn40PheLysLysAlaGlu55LysGinAsnArgGlu70AsnSerSerlieTyrSer15ThrLysSerGlyLysVal30ValAspTyrPheGluLeu45ArgValLysAspCysAla60ThrGlyGluArgLysLeu7580TyrArgArgArgValTrpPheCysLysSerArgLeuCysProMetCysAsnTrp95AlaGluAlaVallieLys115AsnMet100GinValPhe85LysHisLysGlylieLeu90SerGinLysValLysTyrGin105ArgTrpLeuPheValLys130MetAlaGinGlyPhe145AsnLeuProThrVal120GluGluLeuAsnVal110ThrLeuThrAspAspAsnThrTyrValSerPhe195TrpGlyGlyGly135ArgMetMetGinLeu125SerLeuSerAspArg150MetArgAlaThrPhe165AsnGinHisMetTyr155ValLys140LysLyslieTyr180LysAsnThrGluGlu170ValLeuValCysLysGinPhe210ValGinMetlie225AlalieThrAspGlyLeuAspAspHis275LysGluGlu260ArgLysi\rgThr245GluLysAlaPro230AlaMet215LysAsn200LysAsnHis185TyrValAsnGinAsnLys160ThrlieAsnAsnl>ys175GluProLeuAspTyrLysLysTyrProAspTyrLys205ProVal190GinAsnLys235LysAsp220SerAsplieTrplieValLysLysAsnLeuArgVal250ArgLeuSerAspLeulieHis290HisThrAspAspAsp305LysLeuAsnAspAspGlu310lie280AspLys265SerTyrGlyGlyGinSer240AspThrAspPheMet255GluGluLeu270LeuLysGluLeuAspAsp295LysAlaAspGluThrGluGlu300AspGlyPheSer315Leu285GlyAspLeulielielie32018AlaMetTrpAsnTrpGluArgLysAsnTyrPhelieLysGlu325330<210〉6<211>305<212〉DNA〈213〉枯草芽孢桿菌(萬(wàn)3w7Jwssw/^i7A)<400〉6gagctcagcattattgagtggatgattatattccttttgataggtggtatgttttcgctt60gaacttttaaatacagccattgaaca_t3cggttgstttaataactgacaaacatcaccct120cttgctaasgcggcc犯ggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgtgatttcg180tgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgtaatggctgaaaattcttacattt240attttacatttttagaaatgggcgtg肌aaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtg300atagc305〈210〉7<211>620〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223>〈400〉7agatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaa60aaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttc120cg3a_ggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgt180agttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcc240<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>gcgcaagtccgtgatcgtttagaaagcactgcaacatatcttggaaactctttctactat1020ggaaaagggttaatcaacgtacaagcagctgcacaataa〈210〉9<211〉352<212〉PRT〈213〉枯草芽孢桿菌(萬(wàn)aci"〃ss〃Z7"h's)〈400〉9AlaGly1ThrMetLysGlyAlaThr50ValAla65ProGlyTyrAspSerProSer130ValAla145LysSerSerThrGluLysLys5SerSerAlaSerGly35LeuTyrTyrThrSer115GluAla20LysMetValGinLysAspGluLysValGluGlyGly100Hislie85SerGluSerAla55AspGin40ValLys25PheLysTyr10LysLysGluHislieAlaGinlieAsnValLysProAspLeuThrAsnProGlyThrlieAla150Tyr135AlaAsn120GinLysVal105ValAspAla90AlaArgGlyLeuAsnAsnlieValGlyPheLysGin15LysAspVallieSerGlu30TyrValAsnAlaAlaAla45LeuLysLysAspProSer60HisGluTyrAlaGinSer7580ProAlaLeuHisSerGin95VallieAspSerGlylie110GlyGlyAlaSerPheVal125SerSerHisGlyThrHis140SerlieGlyValLeuGly1551601059<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>權(quán)利要求1、一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體，包括如下元件分泌型信號(hào)肽的編碼序列、枯草芽孢桿菌的復(fù)制起始蛋白的編碼序列、枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列。2、如權(quán)利要求l所述的穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述分泌型信號(hào)肽為果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽，所述枯草芽孢桿菌的復(fù)制起始蛋白為R印B蛋白、所述枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子序列為P43啟動(dòng)子序列、所述大腸桿菌的復(fù)制起始序列為pBR322序列。3、如權(quán)利要求2所述的穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和Z或添加且與序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)；所述R印B蛋白具體可為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列5的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的由序列5衍生的蛋白質(zhì)。4、如權(quán)利要求3所述的穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因信號(hào)肽的編碼序列為如下l)或2)或3)的DNA分子-1)其編碼序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；所述R印B蛋白的編碼序列為如下4)或5)或6)的DNA分子4)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；6)與4)或5)限定的DNA序列具有9(F。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；所述P43啟動(dòng)子序列為如下7)或8)的DNA分子7)其編碼序列是序列表中序列6所示的DNA分子；8)與7)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子；所述pBR322復(fù)制起始序列為如下9)或10)的DNA分子[9)其編碼序列是序列表中序列7所示的DNA分子；[10)與9)或限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。5、如權(quán)利要求1至4中任一所述的穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述載體還包括抗菌素編碼基因和多克隆位點(diǎn)序列；所述多克隆位點(diǎn)序列與所述分泌型信號(hào)肽的編碼序列相接，且位于所述分泌型信號(hào)肽的下游。6、如權(quán)利要求5所述的穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述抗菌素編碼基因?yàn)榭敲顾乜剐曰蚝?或氨芐青霉素抗性基因。7、如權(quán)利要求6所述的穿梭表達(dá)載體，其特征在于所述穿梭表達(dá)載體自上游至下游依次包括以下元件蔗糖酶信號(hào)肽的編碼序列、多克隆位點(diǎn)序列、復(fù)制起始蛋白R(shí)印B的編碼序列、卡那霉素抗性基因、P43啟動(dòng)子序列、氨芐青霉素抗性基因、p服322復(fù)制起始序列；所述穿梭表達(dá)載體優(yōu)選圖1所示的重組表達(dá)載體。8、權(quán)利要求1至7中任一所述穿梭表達(dá)載體在獲得重組枯草芽孢桿菌中的應(yīng)用。9、一種建立蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)的方法，包括如下步驟[1)對(duì)目的蛋白的編碼基因進(jìn)行突變；[2)將突變基因插入權(quán)利要求1至7中任一所述穿梭表達(dá)質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；[3)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至枯草芽胞桿菌內(nèi)；[4)篩選含有所述突變基因的枯草芽胞桿菌，得到蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述目的蛋白為酶或酶以外的蛋白質(zhì)；所述酶為蛋白酶、淀粉酶、果膠酶或半乳糖酶；所述酶以外的蛋白質(zhì)為抗體、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子；所述蛋白酶為堿性蛋白酶。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體，包括如下元件分泌型信號(hào)肽的編碼序列、枯草芽孢桿菌的復(fù)制起始蛋白的編碼序列、枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列。本發(fā)明的載體既能在大腸桿菌內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制，又能在枯草芽孢桿菌內(nèi)復(fù)制并表達(dá)。本發(fā)明的載體可應(yīng)用于建立蛋白質(zhì)突變體基因庫(kù)，先將突變基因連入載體，使各種突變基因在大腸桿菌中復(fù)制，再將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)和篩選，構(gòu)建突變庫(kù)的效率相當(dāng)于大腸桿菌操作系統(tǒng)，不但可以簡(jiǎn)單靈活的控制庫(kù)容量大小，而且可以充分利用枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞的外分泌表達(dá)能力，方便突變庫(kù)性能的檢測(cè)和篩選。文檔編號(hào)C12N15/70GK101451147SQ20081024736公開(kāi)日2009年6月10日申請(qǐng)日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者雷于,蕓張,溫廷益,鄧愛(ài)華申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所