專利名稱：：沙雷氏菌wj39菌株,由其獲得的低溫蛋白酶及其純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及沙雷氏菌(5^ra"ssp.)WJ39菌株，以及從中獲得的低溫蛋白酶及其純化方法。
背景技術(shù)：
：地球表面大部分地區(qū)屬于低溫環(huán)境，其中90X屬于低于5-C的海洋環(huán)境，其余為包括永久凍結(jié)帶、冰川、極地冰山以及雪山等環(huán)境，這些環(huán)境中都存在著大量的低溫微生物，它們是低溫酶的主要來源。蛋白酶是目前應(yīng)用最多的一種酶，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、洗滌、皮革、飼料等領(lǐng)域。但目前應(yīng)用的主要為中溫蛋白酶，其最適酶活溫度一般在5(TC左右，而低溫蛋白酶由于具有產(chǎn)酶最適溫度低、對熱敏感、低溫下高效催化等特點，使其在食品、化妝、廢物處理、飼料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。低溫蛋白酶代替洗衣粉中的中溫蛋白酶，可以提高效率，節(jié)省用量，因此低溫蛋白酶在洗滌工業(yè)中有著很好的應(yīng)用前景。而且在國外如日本、美國等國家，低溫蛋白酶己因應(yīng)用于洗滌、食品等行業(yè)。因iW低溫蛋白酶進行純化，并對其生物學(xué)特性進行分析，將為今后低溫蛋白酶冷適應(yīng)性機制研究及其在工農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究提供一定的理論依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種能在低溫下產(chǎn)生具有較高酶活性的低溫蛋白酶菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供一種從沙雷氏菌(6brra&sp.)WJ39菌株中獲得的低溫蛋白酶及其純4t方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案沙雷氏菌(&ira"asp.)WJ39菌株，菌種保藏號為CGMCCNo.2638。低溫蛋白酶，從沙雷氏菌(&7Y^^3印.)WJ39菌株產(chǎn)生，其酶學(xué)性質(zhì)為最適反應(yīng)溫度為37i:，并在0-25'C保持穩(wěn)定；最適pH為8.0-9.0，在pH6.0-10.0保持穩(wěn)定；蛋白酶的分子量為47.6KDa。低溫蛋白酶，以沙雷氏菌(6ferraz^sp.)WJ39菌株為原料由下述方法制備而得-(l滯ij備粗酶液:沙雷氏菌(6ferra"asp.)WJ39菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度10-25。C，pH7.0-9.0，培養(yǎng)時間15-48小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；(2)^t酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30_40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至60-70%飽和度，離心棄上清，沉淀在50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0中透析過夜；(3)DEAES印harose"FF陰離子交換層析將透析的酶液離心，上清進行,，上樣于磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的DEAES印haros,FF陰離子交換層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純酶。低溫蛋白酶的純化方法，以沙雷氏菌(6b2T^O'asp.)WJ39菌株為原料，其步驟包括(1滯U備粗酶液:沙雷氏菌(6"errs2^asp.)WJ39菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度10-25°C，pH7.0-9.0，培養(yǎng)時間15-48小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；(2毓酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至60_70%飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜；(3)DEAES印haros,FF陰離子交換層析將透析的酶液離心，上清進行濃縮，上樣于磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的DEAES印haros^FF陰離子交換層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純酶。步驟'(l)中發(fā)酵條件的優(yōu)化；步驟(2)中分離純化所用的緩沖液為50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0;進一步將步驟(3將到的純酶樣品進行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。沙雷氏菌(5"e^s"asp.)WJ39菌株，分離自冷凍肉聯(lián)廠。菌株篩選培養(yǎng)基為(g/L):酵母提取物，1;NaCl，10;干酪素，20;瓊脂，20;pH7.0-7.2。沙雷氏菌(&rra"ssp.)WJ39菌株，菌落為圓形，濕潤，淺黃色，粘稠；細胞為短桿狀，革蘭氏陰性菌，生長pH范圍是5.0-9.0，最適pH為7.2;溫度范圍是4-37°C，最適生長溫度為13i:。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定，結(jié)合16SrRNA基因序列分析，將分離的低溫細菌鑒定為沙雷氏菌屬的一個菌株，命名為6brrs"asp.WJ39。本發(fā)明的新菌株5"erra&'asp.WJ39已經(jīng)于2008年8月26日在"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"(中國北京)保藏，保藏號為CGMCCNo.2638。本發(fā)明所涉及的沙雷氏菌(&rra"asp.)WJ39菌株的低溫蛋白酶的純化步驟為_(1)制備粗酶液沙雷氏菌(&rra"a印.)WJ39菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度10-25°C，pH7.0-9.0，培養(yǎng)時間15-48小時。將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液。(2)硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至60_70%飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜。(3)DEAES印harose111FF陰離子交換層析將透析的酶液離心，上清進行濃縮，上樣于磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的DEAES印harose"FF陰離子交換層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純酶。在步驟(2沖分離純化所用的緩沖液為50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0。在步驟(3沖分離純化中所說的洗脫采用含0.5-1.0mol/LNaCl線性梯度的磷酸鹽緩沖液洗脫；分離純化中采用電泳純化，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。低溫蛋白酶，由沙雷氏菌(5"e/ra"asp.)WJ39菌株產(chǎn)生，沙雷氏菌(&rra"asp.)WJ39菌株所產(chǎn)低溫蛋白酶具有以下酶學(xué)性質(zhì)1.純化的沙雷氏菌(&rrs"ssp.)WJ39菌株所產(chǎn)低溫蛋白酶最適酶活ag為37°C，并在0-25"C保持穩(wěn)定。2.最適pH為8.0-9.0，在pH6.0-10.0保持穩(wěn)定。3.蛋白酶的分子量為47.6KDa。圖1為\U39菌株產(chǎn)生的低溫蛋白酶的反應(yīng)溫度和相對酶活關(guān)系曲線；圖2為WJ39菌株產(chǎn)生的低溫蛋白酶的熱穩(wěn)定性曲線；圖3為WJ39菌株產(chǎn)生的低溫蛋白酶的反應(yīng)pH和相對酶活關(guān)系曲線；圖4為WJ39菌株產(chǎn)生的低溫蛋白酶的pH穩(wěn)定性曲線；圖5為WJ39菌株產(chǎn)生的低溫蛋白酶的底物濃度和反應(yīng)速率關(guān)系曲線；具體實施例方式下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例—步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明。實施例l:雷氏菌(&rraWasp.)WJ39菌株的分離篩選及鑒定沙雷氏菌(&2rs"ssp.)WJ39菌株，分離自昆明市東站冷凍肉聯(lián)廠。菌株篩選培養(yǎng)基為(g/L):酵母提取物，1;NaCl，10;干酪素，20;瓊脂，20;pH7.0-7.2。采用細菌系統(tǒng)鑒定方法對沙雷氏菌(&r^"'ssp.)WJ39菌株進行鑒定。該菌的形態(tài)學(xué)特征如下菌落為圓形，濕潤，淺黃色，粘稠；細胞為短桿狀，革蘭氏陰性菌，生長pH范圍是5.0-9.0，最適pH為7.2;生長驗范圍是4-37°C，最適溫度為13°C。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定，結(jié)合16SrRNA基因序列分析，將分離的低溫細菌鑒定為沙雷氏菌屬的一個菌株，命名為5fer^"ssp.WJ39。沙雷氏菌(&rra"asp.)WJ39菌株保藏于微生物菌種保藏普通微生物中心。保藏號為CGMCCNo.2638。實施例2:低溫蛋白酶的純化(1)制備粗酶液沙雷氏菌(5^M"S印.)WJ39菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為^it13°C，pH7.2，i咅養(yǎng)時間48小時。將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液。(2)硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至60-70%飽和度，離心棄上清，沉淀在50mM，pH7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液中透析過夜。(3)DEAES印harose"FF陰離子交換層析將透析的酶液離心棄雜質(zhì)，上,行濃縮，上樣于用50mM,pH7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的DEAES印harose"FF陰離子交換層析柱，流速為0.4ml/min,NaCl濃度梯度(0.05mol/L、0.18mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L)洗脫，收集洗脫峰，檢測蛋白濃度及酶活性部分，用10KDa的濃縮管于4'C離心收集濃縮液透析過夜，即為純酶，冷凍保存。將濃縮的樣品進行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為12.5%,濃縮膠濃度為5%，得到單一條帶，表明純化的低溫蛋白酶已經(jīng)達到電泳純，分子量為47.6KDa。低溫蛋白酶活性的測定酶活力測定方法為使用酪蛋白為底物進行蛋白酶活性測定(張樹政.酶制劑工業(yè).北京科學(xué)出版社，1984，387-449)。低溫蛋白酶的水解活力單位定義為在一定溫度下，每分鐘催化酪蛋白水解生成1毫克酪氨酸的酶量，定義為1個活力單位(U)。蛋白質(zhì)濃度的測定采用LOWRY法進行測定(LOWRY.0H，1951)。SDS-PAGE垂直凝膠電泳按Laeramli法進行(LaenimliUK，1970)。實施例3.:低溫蛋白酶的特性①最適酶活M^將酶液加到磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2)中，在底物濃度為2%干酪素的條件下，測定WJ39菌株所產(chǎn)蛋白酶在0-6(TC范圍內(nèi)不同溫度下的酶活。結(jié)果如圖1所示，表明該低溫蛋白酶的最適酶活溫度為37°C。②熱穩(wěn)定性，將酶液加到磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2)中，并在不同溫度的恒溫水浴中保溫，在不同的時間(0-90min，取樣間隔為15min)取樣，然后按照標準的酶活測定方法測定酶活。M^對酶穩(wěn)定性的影響表示為在一定時間后殘存酶活所占原來酶活的百分比，WJ39菌株所產(chǎn)低溫蛋白酶的熱穩(wěn)定曲線如圖2所示，表明該低溫蛋白酶在45。C下保溫15min，殘留酶活為最大酶活的60°%。③最適pH.用pH5.0至pHll.0的不同的緩沖液稀釋酶液，分別加入相應(yīng)pH的2%的干酪素，在37'C下測定酶活力，結(jié)果如圖3所示，表明WJ39菌株所產(chǎn)的低溫蛋白酶在pH8.0時酶活最高。④pH穩(wěn)定性將酶液加到不同pH的緩沖液中，并在4"C保溫10小時，在不同的時間取樣，然后按照標準的酶活測定方法測定酶活。pH對酶穩(wěn)定性的影響表示為在一定時間后殘存酶活所占原來酶活的百分比，WJ39菌株所產(chǎn)低溫蛋白酶的pH穩(wěn)定性如圖4所示，表明WJ39菌株所產(chǎn)的低溫蛋白酶在pH6.0-10.0保持穩(wěn)定。⑤酶促反應(yīng)動力學(xué)將酶液加到磷酸鹽緩沖液中，在不同的底物濃度(0-2.0%，間隔為0.2%)和溫度梯度下(4-60°C)保溫10min，測定相應(yīng)酶活。將不同溫度下，利用底物濃度的倒數(shù)和反應(yīng)速率的倒數(shù)做曲線，計算相應(yīng)的他和Abat，并計算出活化能(厄)。如圖4和表1所示，表明WJ39菌株所產(chǎn)的低溫蛋白酶的他在37。C時最小，說明在37'C時酶與底物的結(jié)合能力最強，而且在4-37"C，隨著溫度升高，飾逐漸降低，這是低溫酶具有的典型特征。WJ39菌株所產(chǎn)的低溫蛋白酶的壓值為23.OKJmor1，高于目前報道的很多低溫酶的值，這進一步表明純化的蛋白酶為典型的低溫酶。表l:lJ39菌株產(chǎn)生的fKM蛋白酶的,反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、沙雷氏菌(Serratiasp.)WJ39菌株，菌種保藏號為CGMCCNo.2638。2、低溫蛋白酶，由沙雷氏菌(&rra"asp.)WJ39菌株產(chǎn)生，其酶學(xué)性質(zhì)為最適反應(yīng)溫度為37'C，并在0-25X:保持穩(wěn)定；最適pH為8.0-9.0，在pH6.0-10.0保持穩(wěn)定；蛋白酶的分子量為47.6KDa。3、如權(quán)利要求2所述的低溫蛋白酶，以沙雷氏菌(&rra"asp.)WJ39菌株為原料由下述方法制備而得(1).制備粗酶液沙雷氏菌(Arra"asp.)WJ39菌株的發(fā)酵培養(yǎng)^^牛為溫度10-25°C，pH7.0-9.0，培養(yǎng)時間15-48小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；(2).硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至60-70%飽和度，離心棄上清，沉淀在50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0中透析過夜；(3).DEAES印harose^1FF陰離子交換層析將透析的酶液離心，上清進行濃縮，上樣于磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的DEAES印harose111FF陰離子交換層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純酶。4、低溫蛋白酶的純化方法，以沙雷氏菌(6"e2T^"asp.)WJ39菌株為原料，其步驟包括(1).制備粗酶液沙雷氏菌(6"e/ra"asp.)WJ39菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度10-25°C，pH7.0-9.0，培養(yǎng)時間15-48小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；(2).硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至60-70%飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜；(3).DEAES印haroseWFF陰離子交換層析將透析的酶液離心，上清進行濃縮，上樣于磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的DEAES印haros,FF陰離子交換層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透ira夜，即為純酶。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的低溫蛋白酶的純化方法，其特征在于步驟(l)中發(fā)酵餅的優(yōu)化。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的低溫蛋白酶的純化方法，其特征在于步驟(2)中分離純化所用的緩沖液為50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的低溫蛋白酶的純化方法，其特征在于進一步將步驟3)得到的純酶樣品進行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為12.5%，M膠濃度為5%。全文摘要本發(fā)明公開了沙雷氏菌(Serratiasp.)WJ39菌株，以及從中獲得的低溫蛋白酶及其純化方法。該方法包括發(fā)酵上清液的硫酸銨沉淀、用10KDa的超濾管進行離心濃縮，最后進行DEAESepharose<sup>TM</sup>FF陰離子交換層析，最終得到電泳純的低溫蛋白酶。本發(fā)明純化的低溫蛋白酶作用溫度低、具有較寬的pH適應(yīng)范圍、較低的活化能，在洗滌劑、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品加工等領(lǐng)域蘊藏一定的應(yīng)用潛力。文檔編號C12N1/20GK101412981SQ20081023362公開日2009年4月22日申請日期2008年11月24日優(yōu)先權(quán)日2008年11月24日發(fā)明者井申榮,季秀玲,林連兵,陸小波,魏云林申請人:昆明理工大學(xué)