高純度5’核苷酸的生產(chǎn)新工藝的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：：高純度5’核苷酸的生產(chǎn)新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及5'核苷酸的生產(chǎn)工藝。二
背景技術(shù)：
：目前同時(shí)生產(chǎn)四種5'核苷酸只能用專(zhuān)一性的核酸酶P,降解核糖核酸，經(jīng)樹(shù)脂吸附、解析分離純化而獲得，為此制備專(zhuān)一性、高活力、廉價(jià)酶是該工藝的關(guān)鍵點(diǎn)之一，目前國(guó)內(nèi)外有使用固定化和固相化核酸酶Pi的方法，但技術(shù)要求很高，制備成本也高，不適宜在我國(guó)用于大規(guī)模生產(chǎn)5'核苷酸的工藝中。國(guó)內(nèi)有報(bào)道使用浸泡麥芽提取核酸酶Pi，但是麥芽為糧食資源，保存也較困難。經(jīng)核酸酶Pt降解核糖核酸成為5'核苷酸溶液后，在降解液中還留下變性的酶、其它雜蛋白及未能全部降解的核酸，這部分核酸通常不是3'—5'位連接結(jié)構(gòu)或因主體構(gòu)型使酶不能夠作用到該部分核酸，它們?cè)谌芤褐挟a(chǎn)生粘性，影響5'核苷酸在樹(shù)脂上吸附和解析效果，有使用凝聚劑將它們凝聚和離心的方法。但都費(fèi)時(shí)費(fèi)力，降低收率，所得處理液也不夠純清。用陶瓷膜超濾雖可以解決部分雜蛋白、殘余核酸等雜質(zhì)，但是膜表面易被這些物質(zhì)所粘附，造成膜孔堵塞而使通透量顯著降低。所得核苷酸為四種5'混合核苷酸即5'腺苷酸(5'AMP)、5'鳥(niǎo)苷酸(5'GMP)、5'胞苷酸(5'CMP)、5'尿苷酸(5'UMP)，目前四種混合核苷酸的分離都是同時(shí)使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂或者使用一種樹(shù)脂分離開(kāi)二種核苷酸以后，再用其它方法分開(kāi)另二種核苷酸。其主要原因是在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上，酸性條件上柱，尿苷酸不能被吸附而流穿樹(shù)脂，但鳥(niǎo)苷酸和胞苷酸卻在以水為洗脫劑的條件下很大部分同時(shí)解析而不能分開(kāi)，必須再用一根陰離子交換樹(shù)脂將它們分開(kāi)，腺苷酸在最后能被單獨(dú)洗脫分開(kāi)，因此在上世紀(jì)七、八十年代為了獲得ATP的前體5'腺苷酸，也曾使用這樣的工藝于工業(yè)生產(chǎn)中。如果使用一根陰離子交換樹(shù)脂分離，則5'胞苷酸和5'鳥(niǎo)苷酸能夠很好分離。但與其它二種核苷酸卻分離不開(kāi)，又要依靠一根陽(yáng)樹(shù)脂將它們重新分離。另外在核酸降解過(guò)程中，由于存在著少量單酯酶活性，以及核酸末端有3'端的磷酸根，因此降解過(guò)程中無(wú)機(jī)磷顯著增加，據(jù)觀測(cè)降解每公斤核酸會(huì)產(chǎn)生10g—15g無(wú)機(jī)磷，亟需研究一個(gè)除去無(wú)機(jī)磷而不影響核苷酸分離的方法。最后核苷酸樹(shù)脂分離溶液濃度較稀且含有鹽分，不能達(dá)到結(jié)晶濃度，常規(guī)可使用減壓薄膜濃縮，但不能脫鹽，影響產(chǎn)品純度，使用活性炭吸附再解析能脫鹽，但工藝復(fù)雜、收率降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是克服上述不足問(wèn)題，提供一種高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，工藝簡(jiǎn)單易操作，反應(yīng)物穩(wěn)定，產(chǎn)品收率高，純度高。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是深層發(fā)酵培養(yǎng)一株桔青霉菌株M-71，產(chǎn)生胞外的核酸酶P^將2.55%的核糖核酸溶液降解，降解率達(dá)80%以上，然后使用高頻振動(dòng)篩除去雜蛋白和殘余核糖核酸，除雜質(zhì)后的純清的5'核苷酸溶液經(jīng)陶瓷膜超濾，除去大分子殘留物質(zhì)，再用裝有強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂的四根柱串聯(lián)吸附及洗脫核苷酸，為純化單核苷酸，選擇切割分子量為300道爾頓的納濾膜脫鹽并濃縮，活性炭脫色，結(jié)晶和干燥后制得四種高純度的5'單核苷酸產(chǎn)品。所述培養(yǎng)桔青霉菌株M-71，在一個(gè)合適的培養(yǎng)基和深層發(fā)酵條件下，30小時(shí)內(nèi)，產(chǎn)生核酸酶P!活力1200—1400單位/毫升。所述培養(yǎng)基所含成分及百分比是葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HP040.05%、KH2P040.05%、MgS040.04%、CaCl20.04%、ZnS040.02%;PH6.0。所述除去雜蛋白和殘余核糖核酸使用的高頻振動(dòng)篩，振動(dòng)最高頻率為3000次/分，使用濾網(wǎng)為200—300目。所述超濾所采用的陶瓷膜過(guò)濾為20—50nm的陶瓷膜過(guò)濾。所述基本純化了的5'核苷酸溶液被吸附到四根裝有強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂的串聯(lián)柱上，并采用不同濃度的甲酸鹽溶液進(jìn)行分步洗脫，分離到四種單核苷酸的溶液。所述分離得到的四種單核苷酸溶液分別經(jīng)納濾膜脫鹽、濃縮并經(jīng)常規(guī)的活性炭脫色，在各自的等電點(diǎn)加入適量甲醇或水結(jié)晶成高純度的5'核苷酸。所述高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，首先制備核酸酶Pw液體深層通風(fēng)培養(yǎng)桔青霉菌株M-71得核酸酶Pu納濾濃縮核酸酶h，將核酸酶P,經(jīng)300—10000道爾頓納濾膜納濾濃縮6—16倍的酶液備用；然后采用濃縮核酸酶Pt進(jìn)行核糖核酸的降解將RNA配成2.5—5.0%溶液，加濃縮酶1.4一4%(V/V)，降解成5'核苷酸混合液；降解液過(guò)高頻振動(dòng)篩溫度304(TC的降解液，其最高振動(dòng)頻率為3000次/分，使用濾網(wǎng)200—300目，通過(guò)振動(dòng)篩后的降解液除去大量固形蛋白質(zhì)、殘余核酸及其它雜質(zhì)；降解液的超濾過(guò)振動(dòng)篩的降解液經(jīng)20—50nm的陶瓷膜超濾，除去可溶性蛋白，純化5'核苷酸溶液，超濾時(shí)控制進(jìn)口壓為4kg/cm2，超濾后用純水洗膜，得超濾液；在強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂上吸附、分離、洗脫四種5'核苷酸吸附樹(shù)脂四根柱串聯(lián)，將超濾后降解液打入串聯(lián)柱，流速每小時(shí)0.6—1的柱體積，再用純水洗至紫外測(cè)定0D湖〈20，水洗畢用甲酸溶液分步洗脫，分別收集0D柳〉20的洗脫液，收集液分別為5'CMP、5'AMP、5'UMP、5'GMP，吸附洗脫過(guò)程控制溫度1215°C;洗脫中途采用甲酸-甲酸鈉溶液(甲酸濃度0.04—0.08M，甲酸鈉濃度0.03—0.05M)洗去柱上60%以上的磷酸鹽；洗脫后的收集液脫鹽、濃縮5'CMP收集液的納濾采用NF和DK二種型號(hào)的膜，300道爾頓，控制進(jìn)口壓為11.2kg/cm2，得濃縮7—17倍的納濾液。5'AMP收集液、5'UMP收集液和5'GMP收集液的納濾同CMP。納濾液升膜濃縮控制進(jìn)蒸汽壓力0.03—0.05MP，出口溫度50—70°C，將納濾液濃縮4.4一9倍，使?jié)饪s液濃度達(dá)10—15%;升膜濃縮后的單核甘酸分別采用炭粉進(jìn)行脫色，用公知的等電點(diǎn)結(jié)晶法，甲醇用量是濃縮液體積的0—2倍，時(shí)間2—10hr，結(jié)晶后離心，甲醇洗滌，產(chǎn)品置HWZ-20B型微波干燥機(jī)45—50。C，烘干。本發(fā)明新工藝與同類(lèi)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝相比具有顯著的技術(shù)特點(diǎn)自主研發(fā)產(chǎn)生核酸酶P,菌株的培養(yǎng)，方法獨(dú)特且獲得高活性核酸酶P"該高活性核酸酶h降解核糖核酸產(chǎn)生5'核苷酸溶液，其降解率通常在80%以上。除雜質(zhì)采用高頻振動(dòng)篩，將降解液通過(guò)振動(dòng)篩除去大量固形蛋白質(zhì)、殘余核酸及其它雜質(zhì)，通透流速快，操作使用方便。核苷酸的分離采用裝有強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂的四根柱串聯(lián)方式吸附和洗脫單核苷酸，由于是常規(guī)四倍的徑高比，對(duì)單柱而言提高了核苷酸上柱量，選擇適當(dāng)?shù)南疵搫?，極好地分離了四種核苷酸。針對(duì)核糖核酸降解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一類(lèi)含磷化合物，它能同時(shí)吸附到樹(shù)脂上，洗脫時(shí)隨產(chǎn)品一起洗下，影響產(chǎn)品純度的問(wèn)題，本發(fā)明在樹(shù)脂洗脫過(guò)程中設(shè)計(jì)了洗脫無(wú)機(jī)磷的方法，即使用甲酸一甲酸鈉(甲酸濃度0.04—0.08M，甲酸鈉濃度0.03—0.05M)混合試劑能將磷酸鹽除去60%以上，在產(chǎn)品結(jié)晶時(shí)磷酸鹽不能再析出，保證制得高純度的5'核苷酸產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度可達(dá)到98—102%。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1按下述5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝生產(chǎn)高純度5'核苷酸，包括濃縮核酸酶P1降解核糖核酸(RNA)成5'核苷酸溶液，經(jīng)振動(dòng)篩、超濾、樹(shù)脂吸附、分步洗脫、收集、納濾、濃縮、脫色、結(jié)晶、干燥得四種含量》98%的純核苷酸5'CMP、5'AMP、5'UMP、5'GMP。首先制備核酸酶P"液體深層通風(fēng)培養(yǎng)桔青霉菌株M-71，經(jīng)30小時(shí)培養(yǎng)得核酸酶P"酶活力1200單位/毫升。納濾濃縮核酸酶P"將核酸酶h經(jīng)300道爾頓納濾膜濃縮成大于7500單位/毫升的酶液備用；然后采用濃縮核酸酶Pi進(jìn)行核糖核酸的降解取純17.5kgRNA配成2.5%溶液，加濃縮酶3.2°/。(V/V)，降解成5'核苷酸混合液。降解液過(guò)高頻振動(dòng)篩溫度304(TC的降解液，以10001200L/hr的速度過(guò)高頻振動(dòng)篩，其最高振動(dòng)頻率為3000次/分，使用濾網(wǎng)300目，通過(guò)振動(dòng)篩后的降解液除去大量固形蛋白質(zhì)、殘余核酸及其它雜質(zhì)。降解液的超濾過(guò)振動(dòng)篩的降解液經(jīng)50nm膜面積為8M2的陶瓷膜超濾，除去可溶性蛋白，純化5'核苷酸溶液，超濾時(shí)控制進(jìn)口壓為4kg/cm2，超濾后用400L純水洗膜，平均通量137.5L/hrcm2，共得超濾液1100L，用時(shí)60分鐘，超濾損失O.56%。在強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂上吸附、分離、洗脫四種5'核苷酸吸附樹(shù)脂四根柱串聯(lián)，共裝樹(shù)脂190L，將超濾后降解液打入串聯(lián)柱，流速120L/hr，上柱率96.7%。水洗用380770L純水洗至紫外測(cè)定0D26。<20結(jié)束，水洗損失4.2%。洗脫水洗畢用甲酸溶液分步洗脫，分別收集0D，〉20的洗脫液，收集液分別為5'CMP1680L、5'AMP2100L、5'UMP840L、5'GMP1530L，吸附洗脫過(guò)程控制溫度1215°C，收集液總損失13.52°/0。由于在RNA降解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一類(lèi)含磷化合物，同時(shí)被吸附到樹(shù)脂上，又隨產(chǎn)品一起洗下，影響了產(chǎn)品純度，因此洗脫時(shí)采用甲酸-甲酸鈉溶液(甲酸濃度0.04—0.08M，甲酸鈉濃度0.03—0.05M)洗去柱上60%以上的磷酸鹽，這樣產(chǎn)品在結(jié)晶時(shí)磷酸鹽不會(huì)再析出，四種產(chǎn)品純度均》98%。洗脫液的納濾使收集液脫鹽、濃縮。5'CMP收集液的納濾采用NF膜，300道爾頓，膜面積30M2，1680LCMP溶液納濾中途補(bǔ)水400L，平均通量21.73L/min，耗時(shí)110分鐘，控制進(jìn)口壓為11.2kg/cm2，得納濾液120L，滲透液中損失2.74%，膜內(nèi)損失6.04%，總損失8.78%。2、5'AMP收集液的納濾納濾設(shè)備及控制壓力同CMP。2100L5'AMP收集液，納濾中途補(bǔ)水500L，平均通量27.47L/min，耗時(shí)95分鐘，滲透液中損失2.26%，膜內(nèi)損失8.6%，總損失10.86%，得納濾液125L。3、5'UMP收集液的納濾納濾設(shè)備及控制壓力同CMP。840L5'UMP收集液，納濾中途補(bǔ)水500L，平均通量17.33L/min，耗時(shí)75分鐘，滲透液中損失2.12%，膜內(nèi)損失15.94%，總損失18.06%，得納濾液120L。4、5'GMP收集液的納濾納濾設(shè)備及控制壓力同CMP。1530L5'GMP收集液，納濾中途補(bǔ)水630L，平均通量34L/min，耗時(shí)65分鐘，滲透液損失1.77%，膜內(nèi)損失1.07%，總損失2.84%，得納濾液125L。升膜濃縮控制進(jìn)蒸汽壓力0.03-0.05MP，出口溫度50—70。C，濃縮液濃度達(dá)10—15%，5'CMP從120L濃縮至13.5L，5'AMP從125L濃縮至16.72L，5'UMP從120L濃縮至27L，5'GMP從125L濃縮至20L。升膜后的單核甘酸分別采用炭粉進(jìn)行脫色，用公知的等電點(diǎn)結(jié)晶法。甲醇用量是濃縮液體積的0—2倍，時(shí)間2—10hr。結(jié)晶后離心，甲醇洗滌。產(chǎn)品置HWZ-20B型微波干燥機(jī)45—50。C，烘干。所得產(chǎn)品進(jìn)行分析和收率測(cè)算，產(chǎn)品經(jīng)HPLC分析，結(jié)果見(jiàn)下表-<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、高純度5′核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是深層發(fā)酵培養(yǎng)一株桔青霉菌株M-71，產(chǎn)生胞外的核酸酶P1，將2.5～5％的核糖核酸溶液降解，降解率達(dá)80％以上，然后使用高頻振動(dòng)篩除去雜蛋白和殘余核糖核酸，除雜質(zhì)后的純清的5′核苷酸溶液經(jīng)陶瓷膜超濾，除去大分子殘留物質(zhì)，再用裝有強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂的四根柱串聯(lián)一次性吸附及分步洗脫、收集，收集到的四種單核苷酸溶液，選擇切割分子量為300道爾頓的納濾膜脫鹽并濃縮，活性炭脫色，結(jié)晶和干燥后制得四種高純度的5′單核苷酸產(chǎn)品。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是培養(yǎng)桔青霉菌株M-71，在培養(yǎng)基和深層發(fā)酵條件下，30小時(shí)內(nèi)，產(chǎn)生核酸酶Pr活力1200—1400單位/毫升。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是:培養(yǎng)基所含成分及百分比是葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HP040.05%、KH2P040.05%、MgS040.04%、CaCl20.040/0、ZnS040.02%;PH6.0。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是除去雜蛋白和殘余核糖核酸使用的高頻振動(dòng)篩，最高振動(dòng)頻率為3000次/分，使用濾網(wǎng)為200—300目。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是超濾所采用的陶瓷膜過(guò)濾為20—50nm的陶瓷膜過(guò)濾。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是基本純化了的5'核苷酸溶液被吸附到四根裝有強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂的串聯(lián)柱上，并采用不同濃度的甲酸鹽溶液進(jìn)行分步洗脫，分離到四種單核苷酸的溶液。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是分離得到的四種單核苷酸溶液分別經(jīng)納濾膜脫鹽、濃縮并經(jīng)常規(guī)的活性炭脫色，在各自的等電點(diǎn)加入適量甲醇或水結(jié)晶成高純度的5'核苷酸。8、根據(jù)權(quán)利要求l一7任一所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是首先制備核酸酶P1:液體深層通風(fēng)培養(yǎng)桔青霉菌株M-71得核酸酶P"納濾濃縮核酸酶P"將核酸酶Pi經(jīng)300—10000道爾頓納濾膜濃縮至6—16倍的酶液備用；然后采用濃縮核酸酶P:進(jìn)行核糖核酸的降解將RNA配成2.5—5少。的溶液，加濃縮酶1.4一4%(V/V)，降解成5'核苷酸混合液；降解液過(guò)高頻振動(dòng)篩溫度304(TC的降解液，其最高振動(dòng)頻率為3000次/分，使用濾網(wǎng)200—300目，通過(guò)振動(dòng)篩后的降解液除去大量固形蛋白質(zhì)、殘余核酸及其它雜質(zhì)；降解液的超濾過(guò)振動(dòng)篩的降解液經(jīng)20—50mn的陶瓷膜超濾，除去可溶性蛋白，純化5'核苷酸溶液，超濾時(shí)控制進(jìn)口壓為4kg/cm2，超濾后用純水洗膜，得超濾液；在強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂上吸附、分離、洗脫四種5'核苷酸吸附樹(shù)脂四根柱串聯(lián)，將超濾后降解液打入串聯(lián)柱，流速0.6—1倍的柱體積，用純水洗至紫外測(cè)定OD26Q<20結(jié)束，水洗畢用甲酸溶液分步洗脫，分別收集0D湖〉20的洗脫液，收集液分別為5'CMP、5'AMP、5'UMP、5'GMP，吸附洗脫過(guò)程控制溫度1215°C，；洗脫時(shí)采用甲酸-甲酸鈉溶液洗去柱上60%以上的磷酸鹽；洗脫后的收集液脫鹽、濃縮5'CMP收集液的納濾采用NF膜，切割分子量為300道爾頓，控制進(jìn)口壓為11.2kg/cm2，得納濾液。5'AMP收集液、5'UMP收集液和5'GMP收集液的納濾同CMP;納濾液升膜濃縮控制進(jìn)蒸汽壓力0.03—0.05MP，出口溫度50—7(TC，濃縮液濃度達(dá)10—15%。濃縮后的單核甘酸分別用炭粉進(jìn)行脫色，用公知的等電點(diǎn)結(jié)晶法，甲醇用量是濃縮液體積的0—2倍，時(shí)間2—10hr，結(jié)晶后離心，甲醇洗滌，產(chǎn)品置HWZ-20B型微波干燥機(jī)45—50。C，烘干。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的高純度5'核苷酸的生產(chǎn)新工藝，其特征是洗脫時(shí)采用甲酸-甲酸鈉溶液為甲酸濃度0.04—0.08M，甲酸鈉濃度0.03—0.05M的溶液。全文摘要本發(fā)明涉及5′核苷酸的生產(chǎn)工藝。深層發(fā)酵培養(yǎng)一株桔青霉菌株M-71，產(chǎn)生胞外的核酸酶P₁，將2.5～5％的核糖核酸溶液降解，降解率達(dá)80％以上，然后使用高頻振動(dòng)篩除去雜蛋白和殘余核糖核酸，除雜質(zhì)后的純清的5′核苷酸溶液經(jīng)陶瓷膜超濾，除去大分子殘留物質(zhì)，再用裝有強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂的四根柱串聯(lián)一次性吸附及分步洗脫、收集，收集到的四種單核苷酸溶液，選擇切割分子量為300道爾頓的納濾膜脫鹽并濃縮，活性炭脫色，結(jié)晶和干燥后制得產(chǎn)品。本發(fā)明極好地分離了四種核苷酸，洗脫除去無(wú)機(jī)磷，保證制得高純度的5′核苷酸產(chǎn)品，經(jīng)HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度可達(dá)到98-102％。文檔編號(hào)C12R1/80GK101418327SQ20081022896公開(kāi)日2009年4月29日申請(qǐng)日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者喬賓福,于喜慶,俞慧君,劉萬(wàn)峰,趙嘉慶,陳曉麗申請(qǐng)人:大連珍奧生物技術(shù)股份有限公司被以下專(zhuān)利引用(2),