一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法

專利名稱：：一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，屬于微生物應(yīng)用領(lǐng)域病毒培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已成為生物制藥領(lǐng)域關(guān)鍵技術(shù)之一，并在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐方面越來越受到重視，如通過動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)出各種療效很好的藥物、靈敏度很高的診斷試劑以及其它生物制品，尤其是在病毒疫苗的生產(chǎn)中發(fā)揮越來越大的作用。病毒疫苗的生產(chǎn)，其主要的途徑是通過細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。而培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生存和生長的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)最重要的條件，培養(yǎng)基中的某些成分對于提高病毒表達(dá)量也有較大影響(司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳正軍.細(xì)胞培養(yǎng).西安世界圖書出版公司，2004)。合成培養(yǎng)基中一般含有必需氨基酸(包括纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、半胱氨酸)和谷氨酰胺，這些都對細(xì)胞生長、病毒增殖有影響。氨基酸作為一類能夠提高病毒滴度的物質(zhì)，在相同的培養(yǎng)條件下，添加少量氨基酸便可獲得更高病毒滴度的抗原液，提高了培養(yǎng)基的利用率。但是各種氨基酸對不同的細(xì)胞生長和各類病毒增殖起不同的作用，即起促進(jìn)或抑制作用，發(fā)揮不同作用的濃度、時(shí)間和顯著性也各不相同。狂犬病是由彈狀病毒科狂犬病病毒屬的嗜神經(jīng)病毒引起，可在所有哺乳動(dòng)物中傳播，通過接種或吸入傳染性病毒而傳染人。用來源于Pasteur氏1885株及其衍生株(Pasteurvirus—PV株，CVS株、Pitman-Moore—PM株)和近期分離到的毒株(Flury株、SAD株、Vnukovo株和Kdev株)制成的疫苗可對抗迄今為止已分離的所有基因I型毒株。不論是用于人或動(dòng)物的疫苗，狂犬病滅活疫苗制備的原理都一樣。動(dòng)物狂犬病疫苗既包括用于目標(biāo)種類的弱毒活疫苗(如Flury雞胚低代毒疫苗、Flury高代毒疫苗、SAD疫苗和Kelev疫苗等)，又包括經(jīng)化學(xué)或物理方法滅活疫苗及其基因重組疫苗。這些疫苗生產(chǎn)種子病毒可在新生動(dòng)物的中樞神經(jīng)組織、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖。為獲得安全有效的疫苗，特別是減少疫苗接種過程的副反應(yīng)，獲得高滴度的病毒液對于疫苗制備過程中后期精制純化就顯得非常重要。
發(fā)明內(nèi)容[發(fā)明目的]本發(fā)明涉及在用于狂犬病疫苗生產(chǎn)的病毒培養(yǎng)過程中一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法。氨基酸有很多種類，但不是所有種類的氨基酸對不同病毒的增殖都有促進(jìn)作用，本發(fā)明的目的就是眾多的氨基酸中篩選到對狂犬病病毒的增殖有促進(jìn)作用的單一氨基酸、或其組合及其合適的濃度，在狂犬病疫苗制備中的病毒培養(yǎng)過程中利用此方法以獲得高滴度病毒著手，為制備出安全有效又對接種動(dòng)物無副作用的狂犬病疫苗提供保障。在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，通過將不同濃度的各種氨基酸分別添加到細(xì)胞培養(yǎng)的維持液中，培養(yǎng)結(jié)束，測定各自的狂犬病病毒的含量；在此過程中采用單一添加和正交組合法對不同濃度的多種氨基酸進(jìn)行了篩選，篩選出可有效提高狂犬病病毒滴度的適當(dāng)濃度的氨基酸及其組合，并在疫苗生產(chǎn)過程中進(jìn)行驗(yàn)證。具體實(shí)施方式本發(fā)明是通過以下具體方法來實(shí)施的。在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，通過將不同濃度的各種氨基酸分別添加到細(xì)胞培養(yǎng)的維持液中，培養(yǎng)結(jié)束，測定各自的狂犬病病毒的含量；再通過比較，篩選出可有效提高狂犬病病毒滴度的適當(dāng)濃度的氨基酸及其組合，并在疫苗生產(chǎn)過程中進(jìn)行驗(yàn)證；通過狂犬病病毒多克隆抗體免疫熒光染法、在病毒蛋白合成階段對狂犬病病毒N蛋白免疫熒光染色及對不同組別細(xì)胞接種病毒后不同時(shí)間病毒培養(yǎng)液上清病毒釋放的檢測，探討添加有效提高狂犬病病毒滴度的氨基酸的作用機(jī)理。1.氨基酸的篩選(1)狂犬病病毒的培養(yǎng)1)病毒培養(yǎng)細(xì)胞的制備待玻璃扁瓶中BHK-21細(xì)胞(由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)長成致密單層后，倒掉細(xì)胞維持液，先用5ml0.25%的胰蛋白酶溶液清洗細(xì)胞表面，然后再加入5ml0.25%的胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞聚集成團(tuán)開始脫落時(shí)倒掉胰蛋白酶溶液，加入10ml細(xì)胞生長液終止消化，將消化液混合，按常規(guī)方法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)(朱良全.豬瘟兔化弱毒(C株)和雞馬立克火雞皰疹病毒(HVT)氨基酸的研究[碩士學(xué)位論文].中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.2004年)，加適量的細(xì)胞生長液作為細(xì)胞分散液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至lxl()S個(gè)/ml，每個(gè)25cn^塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接入10ml細(xì)胞分散液并放入37'C細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。2)病毒培養(yǎng)待細(xì)胞生長至覆蓋75%80%細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)平面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種10nl生產(chǎn)用狂犬病病毒固定弱毒株Flury-LEP株(由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)種毒(病毒的半數(shù)致死量5.0l。gLD5。/0.03ml;計(jì)算方法參見中國獸藥典委員會(huì)編.中華人民共和國獸藥典，二〇〇五年版，三部，附錄21)和0.5ml添加氨基酸的細(xì)胞維持液(簡稱氨基酸細(xì)胞維持液)，病毒對照組加入0.5ml細(xì)胞維持液，37'C吸附lh，期間每隔15min輕輕搖動(dòng)1次，吸附完畢后，加入9.5ml氨基酸細(xì)胞維持液(病毒對照組加入細(xì)胞維持液)，33.5'C培養(yǎng)96h后收獲。每一組別至少3瓶細(xì)胞。(2)不同組別氨基酸細(xì)胞維持液的配制取各種氨基酸配制而成的儲(chǔ)存溶液(配制方法見以下附錄1)，按表1向細(xì)胞維持液中添加入不同量的氨基酸儲(chǔ)存液，配制成不同終濃度及組別的氨基酸細(xì)胞維持液，4'C避光保存。接種病毒前，將由不同種類氨基酸配制而成的氨基酸細(xì)胞維持液用37-C水浴預(yù)熱，按以上狂犬病病毒的培養(yǎng)方法進(jìn)行病毒培養(yǎng)。病毒對照組以不另外添加氨基酸類物質(zhì)的常規(guī)細(xì)胞維持液作為維持液(稱細(xì)胞維持液)。表1不同組別氨基酸細(xì)胞維持液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)病毒液的收獲將培養(yǎng)至96h的病毒液收獲，于一2(TC凍存。(3)病毒滴度的測定病毒收獲液經(jīng)2次凍融后，將各組別中的3瓶病毒收獲液合并為1瓶，采用小鼠腦內(nèi)接種法(MIT)測定病毒滴度(實(shí)驗(yàn)小鼠，選用昆明系清潔級，911g雌性，購自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。根據(jù)檢測結(jié)果確定所添加氨基酸對病毒增殖的影響。每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。并在篩選試驗(yàn)過程中，進(jìn)行了小鼠腦內(nèi)接種法(FuZF,JacksonAC.Neuronaldysfunctionanddeathinrabiesvirusinfection.JNeuroVirol,2005,11:101-106)與狂犬病病毒核蛋白快速酶聯(lián)免疫法(核蛋白ELISA)和狂犬病病毒糖蛋白快速酶聯(lián)免疫(糖蛋白ELISA)法(附錄2)的平行關(guān)系研究，探索快速測定狂犬病病毒滴度的方法。結(jié)果表明在檢測病毒收獲液病毒滴度時(shí)狂犬病病毒核蛋白快速酶聯(lián)免疫檢測法和狂犬病病毒糖蛋白快速酶聯(lián)免疫檢測法都不能代替小鼠腦內(nèi)接種法。本發(fā)明在檢測病毒收獲液病毒滴度時(shí)均用小鼠腦內(nèi)接種法。(4)對提高病毒滴度有效的氨基酸及其組合1)添加單一氨基酸篩選試驗(yàn)不同種類的氨基酸配制成不同濃度的病毒維持液進(jìn)行病毒培養(yǎng)，收獲病毒液，采用MIT檢測病毒滴度，篩選出可提高狂犬病病毒滴度的氨基酸。病毒收獲液病毒滴度檢測結(jié)果見表2。表2氨基酸對狂犬病病毒增殖影響試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(S)0.72S25.78±0.180.111.44S45.58±0.090.090.16N,5.30±0.320.02天冬酰氨0.32N25.28±0.255.24±0.25-0.04(N)0.64N45.08±0.14-0.20注"表示差異極顯著(P<0.01);*表示差異顯著(P<0.05)表2結(jié)果顯示，病毒維持液中添加氨基酸對病毒滴度有影響，但對病毒滴度的影響作用與添加氨基酸種類及濃度有關(guān)，上述所添加氨基酸對狂犬病病毒增殖的影響依次為R〉L>P>C>E>K、S〉H、D>G〉N。其中以1.2mmol/L的精氨酸和0.8mmol/L的亮氨酸對病毒滴度提高的影響顯著(P<0.05)。2)氨基酸組合篩選試驗(yàn)選取以上病毒滴度測定試驗(yàn)中所篩選出的可提高狂犬病病毒滴度的幾種氨基酸，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，組成多種組合。按上述方法進(jìn)行細(xì)胞制備、病毒培養(yǎng)、添加組合物質(zhì)、收獲和病毒滴度測定，采用正交試驗(yàn)法篩選出對提高病毒滴度較為有效的一種或幾組氨基酸組合。單一氨基酸篩選試驗(yàn)證實(shí)，病毒維持液中添加單一氨基酸對病毒滴度有影響，其中狂犬病病毒滴度提高值大于0.2kgLD5o/0.03ml的氨基酸有R、L、P禾tlC。為對多個(gè)變量進(jìn)行有效的篩選，并按因素和位級要求選擇正交表L9(34)，各組順序?qū)Ω饕蛩睾臀患夁M(jìn)行組合。篩選試驗(yàn)結(jié)果見表3。表3氨基酸組合篩選試驗(yàn)結(jié)果組試驗(yàn)組合3次病毒滴度(fegLD5。/0.03ml)病毒滴度平病毒滴度提別精氨酸(R)亮氨酸脯氨酸(P)半胱氨酸(c)12均值高值1RiP0.5C0.54.836.336.175.780.152&P>5.336.176.3755.%0.33R'P2c26.05.336.3756.240.274R2Pc25.536.176.175.900.13R2P2C0.55.675.676.05.780.156R2P05C,.6.175.335.55.670.04&P25.235.676.05.630.008P05c25.675.566.335.850.129PC0.55.675.676.335.890.2610----5.565.775.565.63—2.添加氨基酸的作用在病毒吸附和脫殼階段，通過狂犬病病毒多克隆抗體免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)添加1.2mmol/L精氨酸組和0.8mmol/L亮氨酸組接種病毒后30min即可吸附，而未添加以上氨基酸的病毒對照組和添加氨基酸組合的均在60min才可觀察到熒光；添加1.2mmol/L精氨酸組和0.8mraol/L亮氨酸組接種病毒后90min時(shí)便可在細(xì)胞內(nèi)觀察到大量熒光，而病毒對照組、抑制劑組和氨基酸組合90min時(shí)只能觀察到少量微弱熒光；添加1.2mmol/L精氨酸組和0.8mmol/L亮氨酸組接種病毒后180min時(shí)熒光變暗或消失，而病毒對照組、抑制劑組和氨基酸組合在210min時(shí)熒光才開始變暗。氨基酸組合在病毒吸附和脫殼階段與病毒對照組相比并無明顯差異。以上結(jié)果可以看出，單添加精氨酸或亮氨酸有助于病毒吸附、脫殼和轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)，從而加快了病毒的復(fù)制。在病毒蛋白合成階段，通過狂犬病病毒N蛋白免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)添加1.2mmol/L精氨酸組和0.8畫ol/L亮氨酸組接種病毒后18h細(xì)胞內(nèi)即可觀察到熒光，21h熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，而病毒對照組、抑制劑組和氨基酸組合21h細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)熒光顆粒，24h熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，并且添加1.2mmol/L精氨酸組和0.8mmol/L亮氨酸組熒光顆粒數(shù)明顯多于病毒對照組、抑制劑組和氨基酸組合。說明精氨酸和亮氨酸均促進(jìn)狂犬病病毒N蛋白的合成速度和合成數(shù)量，保護(hù)病毒mRNA免遭核酸酶的降解，加快了病毒的復(fù)制，為病毒合成數(shù)量的增加提供了基礎(chǔ)。不同組別細(xì)胞接種病毒后36h、48h、56h和60h檢測病毒培養(yǎng)液上清中是否有病毒釋放，發(fā)現(xiàn)添加1.2mmol/L精氨酸組和添加0.8mraol/L亮氨酸組均在接種病毒后42h培養(yǎng)液中即可檢測到病毒，而對照組54h才能在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到病毒。說明單添加1.2mmol/L精氨酸或添加0.8ramol/L亮氨酸促進(jìn)了病毒的成熟。本發(fā)明的積極效果在狂犬病病毒培養(yǎng)的細(xì)胞維持液中單一添加精氨酸、亮氨酸、脯氨酸、半胱氨和酸精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸組合可提高狂犬病病毒滴度。經(jīng)多克隆熒光抗體染色結(jié)果表明，與對照組比較，精氨酸和亮氨酸組病毒吸附由60min縮短為30min，病毒穿膜由90min縮短為60min;經(jīng)核蛋白單克隆熒光抗體染色結(jié)果表明，病毒核蛋白合成由21h縮短為18h;經(jīng)狂犬病病毒抗原檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液，病毒陽性檢出由54h提前到42h。該方法簡便有效，將對狂犬病疫苗生產(chǎn)產(chǎn)生積極效果。實(shí)施例1待125cr^玻璃扁瓶中BHK-21細(xì)胞長成致密單層后，倒掉細(xì)胞維持液，每瓶先用5ml0.25%的胰蛋白酶溶液清洗細(xì)胞表面，然后加入5ml0.25c/。的胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞聚集成團(tuán)開始脫落時(shí)倒掉胰蛋白酶溶液，加入10ml細(xì)胞生長液終止消化，將5瓶玻璃扁瓶消化液混合，吹打混勻，接入轉(zhuǎn)瓶，補(bǔ)充950ml細(xì)胞生長液，置于37'C細(xì)胞培養(yǎng)室，8r/h旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。待3個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞生長至覆蓋75%80%轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種5ml生產(chǎn)用種毒(5.0bgLD5o/0.03ml)和50ml添加了精氨酸的細(xì)胞維持液(精氨酸的最終濃度為1.2mmol/L)，37°C8r/h吸附lh，吸附完畢后，加入950ml添加了精氨酸的細(xì)胞維持液，33.5°C8r/h培養(yǎng)96h后收獲并混合，按小鼠腦內(nèi)接種法進(jìn)行病毒滴度為6.11±0.23kgLD5o/0.03ml，而維持液不另外添加精氨酸的對照組病毒滴度為5.45±0.28logLD5()/0.03ml，與對照組相比病毒滴度提高值為0.66kgLD50/0.03ml。實(shí)施例2同實(shí)施例1一樣轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的的BHK-21細(xì)胞，待3個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞生長至覆蓋75%80%轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種5ml生產(chǎn)用種毒(5.0l。gLD5。/0.03ml)和50ml添加了亮氨酸的細(xì)胞維持液(亮氨酸的最終濃度為0.8mmol/L)，37°C8r/h吸附lh，吸附完畢后，加入950ml添加了精氨酸的細(xì)胞維持液，33.5°C8r/h培養(yǎng)96h后收獲并混合，按小鼠腦內(nèi)接種法進(jìn)行病毒滴度為5.98±0.19kgLD5C)/0.03ml，而維持液不另外添加精氨酸的對照組病毒滴度為5.45±0.28kgLD5o/0.03ml，與對照組相比病毒滴度提高值為0.53^LD50/0.03ml。實(shí)施例3同實(shí)施例1一樣轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的的BHK-21細(xì)胞，待3個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞生長至覆蓋75%80%轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種5ml生產(chǎn)用種毒(5.0l°gLD5()/0.03ml)和50ml添加了脯氨酸的細(xì)胞維持液(脯氨酸的最終濃度為0.16mmol/L)，37'C8r/h吸附lh，吸附完畢后，加入950ml添加了精氨酸的細(xì)胞維持液，33.5°C8r/h培養(yǎng)96h后收獲并混合，按小鼠腦內(nèi)接種法進(jìn)行病毒滴度為5.71±0.20l。gLD5o/0.03ml，而維持液不另外添加精氨酸的對照組病毒滴度為5.36±0.13kgLDW0.03ml，與對照組相比病毒滴度提高值為0.35^LD50/0.03ml。實(shí)施例4同實(shí)施例1一樣轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的的BHK-21細(xì)胞，待3個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞生長至覆蓋75%80%轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種5ml生產(chǎn)用種毒(5.0logLD5()/0.03ml)和50ml添加了半胱氨酸的細(xì)胞維持液(半胱氨酸的最終濃度為0.1mmol/L)，37°C8r/h吸附lh，吸附完畢后，加入950ml添加了精氨酸的細(xì)胞維持液，33.5°C8r/h培養(yǎng)96h后收獲并混合，按小鼠腦內(nèi)接種法進(jìn)行病毒滴度為5.98±0.23kgLD5o/0.03ml，而維持液不另外添加精氨酸的對照組病毒滴度為5.45±0.28kgLDW0.03ml，與對照組相比病毒滴度提高值為0.24^LD50/0.03ml。實(shí)施例5同實(shí)施例1一樣轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的的BHK-21細(xì)胞，待3個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞生長至覆蓋75%80%轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種5ml生產(chǎn)用種毒(5.0l。gLD5Q/0.03ml)和50ml添加了氨基酸組合的細(xì)胞維持液(精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的最終濃度分別為0.6mmol/L、0.8mmol/L、0.16mmol/L和O.lmmol/L)，37。C8r/h吸附lh，吸附完畢后，加入950ml添加了氨基酸組合的細(xì)胞維持液，33.5。C8r/h培養(yǎng)96h后收獲并混合，按小鼠腦內(nèi)接種法進(jìn)行病毒滴度為5.80±0.20kgLD5()/0.03ml，而維持液不另外添加氨基酸的對照組病毒滴度為5.45±0.28kgLD5o/0.03ml，與對照組相比病毒滴度提高值為0.33logLD50/0.03ml。實(shí)施例6同實(shí)施例1一樣轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的的BHK-21細(xì)胞，待3個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞生長至覆蓋75%80%轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種5ml生產(chǎn)用種毒(5.0logLD5G/0.03ml)和50ml添加了氨基酸組合的細(xì)胞維持液(精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的最終濃度分別為0.6mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和0.2mmol/L)，37。C8r/h吸附lh，吸附完畢后，加入950ml添加了氨基酸組合的細(xì)胞維持液，33.5°C8r/h培養(yǎng)96h后收獲并混合，按小鼠腦內(nèi)接種法進(jìn)行病毒滴度為5.69±0.23l。gLD5()/0.03ml，而維持液不另外添加氨基酸的對照組病毒滴度為5.45±0.28logLD5o/0.03ml，與對照組相比病毒滴度提高值為0.24^LD50/0.03ml。實(shí)施例7同實(shí)施例1一樣轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的的BHK-21細(xì)胞，待3個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞生長至覆蓋75%80%轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面時(shí)，倒掉細(xì)胞生長液，每瓶接種5ml生產(chǎn)用種毒(5.0^LD5()/0.03ml)和50ml添加了氨基酸組合的細(xì)胞維持液(精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的最終濃度分別為2.4mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和O.05mmol/L)，37°C8r/h吸附lh，吸附完畢后，加入950ml添加了氨基酸組合的細(xì)胞維持液，33.5°C8r/h培養(yǎng)96h后收獲并混合，按小鼠腦內(nèi)接種法進(jìn)行病毒滴度為5.89kgLD5o/0.03ml，而維持液不另外添加氨基酸的對照組病毒滴度為5.63kgLD5o/0.03ml，與對照組相比病毒滴度提高值為0.26^LD50/0.03ml。附錄l氨基酸儲(chǔ)存溶液的配制方法(1)40mmol/L亮氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.524g亮氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(2)60mmol/L精氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和1.046g精氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一20'C冷凍保存。(3)36mmol/L絲氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.378g絲氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(4)24mmol/L谷氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.3528g谷氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(5)36mmol/L甘氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.524g甘氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(6)20mmol/L天冬氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.2672g天冬氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一20'C冷凍保存。(7)40mmol/L蘇氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.476g蘇氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(8)40mmol/L賴氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.73g賴氨酸HCL，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(9)16mmol/L脯氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.184g脯氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一20"C冷凍保存。(10)20mmol/L組氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.524g組氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(11)10mmol/L半胱氨酸儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和0.121g半胱氨酸，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(12)200mmol/L谷氨酰胺儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和2.92g谷氨酰胺，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(13)lOOmmol/L丙酮酸鈉儲(chǔ)存溶液稱取0.96gMEM粉劑和1.10g谷氨酰胺，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一20'C冷凍保存。以上各種氨基酸及丙酮酸鈉等均為細(xì)胞培養(yǎng)級試劑，純度》99.99%，均購自Applichem公司。MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司。附錄2狂犬病病毒病毒滴度的測定方法(1)小鼠腦內(nèi)接種法(MIT):將合并后病毒收獲液用pH7.2的PBS作10倍系列稀釋，取10—4、10—5和1(T3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種6只小鼠，每只小鼠腦內(nèi)接種0.03ml。接種所用各稀釋度病毒液需冰浴放置。接種后連續(xù)觀察14天，記錄小鼠死亡數(shù)量，前3天死亡小鼠不計(jì)算在內(nèi)。按Reed-Muench氏法計(jì)算半數(shù)致死量(LD5。)。(2)狂犬病病毒核蛋白快速酶聯(lián)免疫法(核蛋白ELISA):將合并后病毒收獲液用pH7.2PBS作10倍系列稀釋，取10—2和10"2個(gè)稀釋度，用狂犬病病毒抗原酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒對病毒含量進(jìn)行檢測，各稀釋度均設(shè)雙孔測定。具體操作見狂犬病病毒核蛋白檢測試劑盒(購自武漢生物制品研究所)說明書。(3)狂犬病病毒糖蛋白快速酶聯(lián)免疫法(糖蛋白ELISA):將合并后病毒收獲液用pH7.2PBS作10倍稀釋(即10—。，用狂犬病效力檢測試劑盒對病毒含量進(jìn)行檢測，檢測樣品設(shè)雙孔重復(fù)。具體操作見狂犬病疫苗效力檢測試劑盒(購自武漢生物制品研究所)說明書。附錄3細(xì)胞培養(yǎng)液的配制(1)10xMEM儲(chǔ)存液稱取480gMEM粉劑，完全溶解于5000ml去離子水中，過濾除菌，一20。C冷凍保存。(2)7.5%碳酸氫鈉溶液稱取7.5g碳酸氫鈉，溶于100ml去離子水中，過濾除菌，一2(TC冷凍保存。(3)雙抗溶液400萬單位青霉素和400萬單位鏈霉素溶于80ml去離子水中，過濾除菌，一20。C冷凍保存。(4)細(xì)胞生長液的配制分別量取578ml去離子水、75ml10xMEM儲(chǔ)存液、1.5ml雙抗溶液、lml5.5X丙酮酸鈉、20ml7.5X碳酸氫鈉溶液和75ml血清，裝于1000ml滅菌玻璃瓶中，4'C避光保存。(5)細(xì)胞維持液的配制分別量取594.1ml去離子水、70mll0xMEM儲(chǔ)存液、1.4ml雙抗溶液、lml5.5X丙酮酸鈉、15ml7.5X碳酸氫鈉溶液和14ml血清，裝于1000ml滅菌玻璃瓶中，4'C避光保存。權(quán)利要求1.一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，其特征在于在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)維持液中添加最終濃度為0.6～2.4mmol/L的精氨酸能夠顯著提高細(xì)胞培養(yǎng)的狂犬病病毒滴度。2.如權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，其特征在于在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)維持液中添加最終濃度為0.40.8mmol/L的亮氨酸。3.如權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，其特征在于在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)維持液中添加最終濃度為0.16mmol/L的脯氨酸。4.如權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，其特征在于在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)維持液中添加最終濃度為0.lmmol/L的半胱氨酸。5.如權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，其特征在于在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)維持液中添加最終濃度分別為0.6mmol/L、0.8mmol/L、0.16mmol/L和0.1mmol/L的精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸組合。6.如權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，其特征在于在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)維持液中添加最終濃度分別為0.6mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和0.2mmol/L的精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸組合。7.如權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法，其特征在于在狂犬病病毒細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，在細(xì)胞培養(yǎng)維持液中添加最終濃度分別為2.4mmol/L、1.6mmol/L、0.32mmol/L和0.05mmol/L的精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸組合。全文摘要本發(fā)明涉及一種促進(jìn)狂犬病病毒增殖的方法。在狂犬病病毒培養(yǎng)的細(xì)胞維持液中單一添加精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸分別可提高狂犬病病毒滴度0.68logLD₅₀/0.03ml～0.24logLD₅₀/0.03ml。精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和半胱氨酸的氨基酸組合也可提高狂犬病病毒滴度。經(jīng)多克隆熒光抗體染色結(jié)果表明，與對照組比較，精氨酸和亮氨酸組病毒吸附由60min縮短為30min，病毒穿膜由90min縮短為60min；經(jīng)核蛋白單克隆熒光抗體染色結(jié)果表明，病毒核蛋白合成由21h縮短為18h；經(jīng)狂犬病病毒抗原檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液，病毒陽性檢出由54h提前到42h。該方法簡便有效，在狂犬病疫苗生產(chǎn)中有其實(shí)用性。文檔編號C12N5/06GK101407788SQ20081022722公開日2009年4月15日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日發(fā)明者曄孫,雷岳,棟王,建陳,君馬申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司