專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
腺苷蛋氨酸(SAM)是存在于人體所有組織和體液中的一種生理活性分子。SAM主 要用于治療肝硬化前和肝硬化所致肝內(nèi)膽汁郁積，妊娠期肝內(nèi)膽汁郁積，在抗炎止痛、抗精 神抑郁、去屑、止癢、減皺、抗衰老等方面也有重要應(yīng)用。腺苷蛋氨酸在常溫條件下的吸濕 性和不穩(wěn)定性以及生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性嚴(yán)重限制了腺苷蛋氨酸在醫(yī)療保健領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。 因此，歐美科技界在腺苷蛋氨酸的穩(wěn)定成鹽和生產(chǎn)工藝方面申報(bào)了多項(xiàng)專(zhuān)利。藥物原料市
場(chǎng)上具有代表性的一些專(zhuān)利有如美國(guó)專(zhuān)利6635615， 5102791、4028183、4369177、4764603等。 SAM的全國(guó)年需求量至少在10噸以上，全球的需求每年為50噸。SAM在我國(guó)還沒(méi) 有實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化，全部依賴(lài)進(jìn)口。 SAM主要生產(chǎn)廠商集中在德國(guó)和意大利，藥用原料每千克約 8000元人民幣。國(guó)內(nèi)已有開(kāi)發(fā)研究工作，因發(fā)酵法的表達(dá)水平低，酶促轉(zhuǎn)化法的酶和ATP的 成本很高，所以原料生產(chǎn)至今未能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，主要由雅培公司進(jìn)口中國(guó)。
目前腺苷蛋氨酸工業(yè)化生產(chǎn)工藝主要有酵母發(fā)酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)和酶促轉(zhuǎn)化法 (胞外酶促法)兩種，這兩種方法都存在著不同的技術(shù)難點(diǎn) 酵母發(fā)酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)國(guó)外多采用特殊培育的表達(dá)SAM的釀酒酵母菌株通 過(guò)胞內(nèi)表達(dá)制備SAM。國(guó)內(nèi)有人研究出基因工程改構(gòu)的釀酒酵母，發(fā)酵表達(dá)SAM，但目前表 達(dá)最高的也只達(dá)到8g/L發(fā)酵液，而且大多只完成發(fā)酵工藝的探索，用此法生產(chǎn)是在胞內(nèi)表 達(dá)，由于SAM的前體L 一蛋氨酸需透過(guò)胞壁，且受胞內(nèi)空間的限制所以表達(dá)產(chǎn)量很難提高， 收率低，成本高，不適合大規(guī)模制備。 酶促法(胞外酶促法)酶促法多以從啤酒酵母或其他工程菌中提取純化腺苷蛋 氨酸合成酶，然后通過(guò)優(yōu)化酶促反應(yīng)條件來(lái)轉(zhuǎn)化制備SAM，該法原料轉(zhuǎn)化率高，SAM易于提 取純化，但是該法中酶的提取純化工序復(fù)雜在酵母菌的破碎、離心、過(guò)濾、濃縮上清液及上 清液上柱純化中會(huì)有酶的損失，同時(shí)影響酶活性的不確定因素較多，純化酶的周期較長(zhǎng)，致 使酶的活性受到了影響，同時(shí)該法獲得的純化酶量較少，導(dǎo)致酶的成本很高，也不適合大規(guī) 模制備SAM。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種胞內(nèi)表達(dá)加胞外酶促合成生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的方法。以解決酵母發(fā) 酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)表達(dá)產(chǎn)量低，收率低，成本高，和胞外酶促法酶的成本高，不適合大規(guī)模 制備SAM的問(wèn)題。本發(fā)明集中了發(fā)酵法(胞內(nèi)表達(dá)法)和胞外酶促法的優(yōu)點(diǎn)，利用一次發(fā) 酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)表達(dá)和胞外酶促兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液SAM的產(chǎn)量，低 了生產(chǎn)成本，使SAM實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)制備。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
3
首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌 SAM合成酶基因SAM2的核苷酸編碼序列長(zhǎng)1152bp，編碼含384氨基酸殘基的亞 基，分子量為42300。 SAM1和SAM2編碼序列的同源性為83% ，所編碼的多肽氨基酸序列的 同源性高達(dá)92%，說(shuō)明SAM1和SAM2為復(fù)制基因。將SAM2基因整合至基因工程菌株中。將 帶有強(qiáng)啟動(dòng)子、SAM2基因和終止子序列的基因片段依靠SAM2兩端的同源序列臂整合在原 基因組SAM2位點(diǎn)處，依靠強(qiáng)啟動(dòng)子作用實(shí)現(xiàn)SAM2的高表達(dá)。 接著利用發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵，在工程菌中表達(dá)SAM，通過(guò)破胞提取胞內(nèi)的SAM合成酶和 SAM。 然后利用胞內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM，這樣 利用一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)的表達(dá)SAM和SAM合成酶，SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶 促合成反應(yīng)，又生產(chǎn)一部分SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提 高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，使SAM實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)制備。
其中獲得的胞內(nèi)表達(dá)部分達(dá)到每升發(fā)酵液中為20.6g，生物量110g/L。胞外酶促 生產(chǎn)部分達(dá)到重組腺苷蛋氨酸合成酶純酶比活性高達(dá)10-501U/毫克。酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá) 95%以上。每升酶促反應(yīng)液中SAM濃度達(dá)為12.8g。 本發(fā)明中的啤酒酵母基因重組工程菌，該菌種由我公司通過(guò)基因重組工程技術(shù)構(gòu) 建選育，由我公司技術(shù)中心保藏，保藏日期2008年3月18日，本基因重組啤酒酵母菌攜帶 化學(xué)合成腺苷蛋氨酸合成酶基因。合成酶的表達(dá)受啟動(dòng)子TAC調(diào)控。 本發(fā)明中的工程菌破碎工藝是采用物理方法破碎的細(xì)胞破碎儀、高效勻質(zhì)機(jī)等。
本發(fā)明中的腺苷蛋氨酸合成酶是通過(guò)截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾 濃縮提取的，收率達(dá)到90 %以上。腺苷蛋氨酸合成酶是可以回收多次重復(fù)利用的。
本發(fā)明中的腺苷蛋氨酸合成條件是磷酸二氫鉀、氯化鎂、葡萄糖、ATP、無(wú)機(jī)焦 磷酸酶使終濃度為K+濃度100-30mmol/L， Mg2+濃度5-30mmol/L，蛋氨酸為5mmol/L——
65mmol/L， ATP為5mmol/L-80mmol/L，無(wú)機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L， pH值為6. 0-7. 5，將
反應(yīng)缸升溫至20°C——39。C，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右。 本發(fā)明中的腺苷蛋氨酸的提取純化是利用弱酸性大孔丙烯酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂
(D113)離子交換完成的。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果 本發(fā)明首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌，利用發(fā)酵技術(shù)發(fā) 酵，在工程菌中表達(dá)SAM和SAM合成酶，通過(guò)破胞提取胞內(nèi)的SAM和SAM合成酶，然后利用胞 內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞 內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量，工藝簡(jiǎn)單，降低了生產(chǎn)成本，使SAM 實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)制備，使SAM能得到普遍實(shí)際應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料和方法 1、工程菌和試劑 啤酒酵母基因重組工程菌，該菌種由我公司通過(guò)基因重組工程技術(shù)構(gòu)建選育，由 我公司技術(shù)中心保藏，保藏日期2008年3月18日，本基因重組啤酒酵母菌攜帶化學(xué)合成腺
4苷蛋氨酸合成酶基因。 試劑主要有三磷酸腺苷ATP AR ;L_蛋氨酸；99% p-巰基乙醇；1，4_ 丁烷二磺酸 鈉；四乙二胺四乙酸EDTA ;無(wú)機(jī)焦磷酸酶，弱酸性大孔丙烯酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(D113)。除去 離子水和對(duì)l，4-丁烷二磺酸鈉(含量95%以上)為本公司自制外，其他全部為國(guó)產(chǎn)分析純 級(jí)。 2、發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵基石出鹽培養(yǎng)基(Fermentation Basal Salts Medium, BSM): 85%磷酸200. 25mL， CaS04 2H20 6. 975g， K2S04136. 5g， MgS04 7H20 111. 75g， KOH 30. 9g， 甘油300g， 補(bǔ)料培養(yǎng)基 補(bǔ)料1 :25 % -28 %氨水，發(fā)酵罐自動(dòng)控制其補(bǔ)加速度，使pH值控制在一定數(shù)值。
補(bǔ)料2 :L-Met 75g，蒸餾水定容至1.25L，115。C滅菌30min。再加入PTM115mL。
補(bǔ)料3 :PTM148mL補(bǔ)料4 :不含甘油的BSM培養(yǎng)基1. 25L，加入300g L-Met， 115。C滅菌30min。
3發(fā)酵工藝 3. 1發(fā)酵第一階段——適應(yīng)生長(zhǎng)階段 3、加入發(fā)酵培養(yǎng)基后，加水至75L，發(fā)酵罐中12rC滅菌30min。降溫至37。C接種， 攪拌3h，轉(zhuǎn)速500rpm，8h后600rpm，15h后650rpm，通氣逐漸加大至1 : 1。此階段DO和 pH持續(xù)下降，發(fā)酵罐自動(dòng)補(bǔ)加氨水控制pH5. 0 ;通過(guò)提高轉(zhuǎn)速和通氣量來(lái)提高DO，使其不低 于20%。 此階段維持18-25h，時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)接種量不同而有所區(qū)別。此階段生物量達(dá)
100g/L左右，HPLC檢測(cè)SAM 0. 7g/L。 3. 2發(fā)酵第二階段——急劇生長(zhǎng)階段 當(dāng)DO突然急劇上升，由20%上升至70% _90 %時(shí)，進(jìn)入第二階段，開(kāi)始補(bǔ)加補(bǔ)料
2。 補(bǔ)料速度126mL/h。轉(zhuǎn)速提高到700rpm。補(bǔ)料2加入DO即會(huì)迅速下降。該階段補(bǔ)加氨 水控制pH5. 0。 此階段菌體急劇生長(zhǎng)，此階段時(shí)長(zhǎng)10h，此時(shí)生物量達(dá)210-240g/L， HPLC檢測(cè)SAM
3. 22g/L。 3. 3發(fā)酵第三階段——碳源饑餓階段 當(dāng)補(bǔ)料2補(bǔ)完后，DO又會(huì)急劇上升，此時(shí)進(jìn)入第3階段。碳源饑餓1. 5h，因?yàn)楹竺?要改變碳源，為了讓菌體更好的適應(yīng)新的碳源。在此階段，D0維持在70X以上的高水平，pH
會(huì)有一定的上升。 3. 4發(fā)酵第四階段——誘導(dǎo)表達(dá)階段 碳源饑餓l. 5h后，進(jìn)入第四階段，同時(shí)補(bǔ)加補(bǔ)料3和補(bǔ)料4。補(bǔ)料3流速?gòu)?0. 5mL/ h開(kāi)始，每15min增加2. lmL/h，直至25. 2mL/h， D0下降到20以下。后面根據(jù)DO值，調(diào)整
5補(bǔ)料3的速度， 一般為25. 2mL/h-40mL/h，使DO在20-30之間至發(fā)酵結(jié)束。補(bǔ)料4流速為 12.65mL/h，恒速補(bǔ)加。甲醇的濃度太高了細(xì)胞會(huì)中毒。pH提升至6.0。 DO不低于15X，當(dāng) DO太低時(shí)，降低補(bǔ)料3的速度，提高溶氧。 誘導(dǎo)表達(dá)階段持續(xù)100h左右表達(dá)量達(dá)到最高，發(fā)酵結(jié)束，下罐。此階段結(jié)束時(shí)，生
物量達(dá)290-340g/L， SAM產(chǎn)量21. 11g/L左右。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程130h左右。 將發(fā)酵后收集的菌液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4000Pm，離心10分鐘，棄去上清液，收集沉
淀的菌體，-4(TC凍存。 4、腺苷蛋氨酸合成酶的提取制備 將凍存十天以上的菌體，用20mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮，每克細(xì)胞泥用2毫升 緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎，操做的壓力為60MPa，溫度控制在15t:以下， 循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心后收集含有SAM合成酶和SAM的上 清液。然后用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾濃縮，腺苷蛋氨酸合成酶被截留超 濾濃縮液中，腺苷蛋氨酸(SAM)則在濾過(guò)液中。濃縮液作為下一步酶促反應(yīng)的酶液，濾過(guò)液 移交純化工序提取純化其中的SAM。
5、酶促合成 取上步濃縮液即粗酶液，加入反應(yīng)缸，加入適量純化水，依次加入磷酸二氫鉀、氯 化鎂、葡萄糖、ATP無(wú)機(jī)焦磷酸酶使終濃度為K+濃度250mmol/L， Mg2+濃度30mmol/L，蛋氨 酸為5mmol/L 65mmol/L， ATP無(wú)機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L為5mmol/L 80mmol/L， pH值為 6. 0 7. 5，將反應(yīng)缸升溫至24°C 31°C ，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右，在反應(yīng)過(guò)程中 根據(jù)反應(yīng)的進(jìn)程相應(yīng)地補(bǔ)加蛋氨酸與ATP，以維持最大的酶促反應(yīng)速度。隨時(shí)做液相檢測(cè)， 直至蛋氨酸大部分轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率90%以上)，轉(zhuǎn)化液中SAM含量達(dá)到15g/L轉(zhuǎn)化液時(shí)，即可 加硫酸調(diào)pH3. 0終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 轉(zhuǎn)化終止后，用反應(yīng)體積與硅藻土的比為1 : 0.005的量，加入硅藻土入反應(yīng)缸， 攪拌20分鐘，板框過(guò)濾，以去掉蛋白質(zhì)。過(guò)濾得濾液，濾液再加入強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交 換樹(shù)脂(201x7)攪拌吸附15分鐘，使pH為4. 5，靜置20-30分鐘，真空抽濾，過(guò)濾。
6 、腺苷蛋氨酸合成酶的回收 濾液用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱，超濾濃縮回收腺苷蛋氨酸合成酶。 腺苷蛋氨酸合成酶可重復(fù)利用。
7、纟屯4t 取破菌后的濾過(guò)液和酶促后的濾過(guò)液上弱酸性大孔丙烯酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 (D113)分離柱離子交換柱進(jìn)行層析提取。 將上工序?yàn)V液加水溶解成稀釋成電導(dǎo)小于5，調(diào)pH為5. 0-5. 5后緩慢地加入經(jīng)酸 堿處理后處理好的弱酸性大孔丙烯酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(D113)分離柱。每30分鐘檢測(cè)洗脫 液，測(cè)定其0D值，在波長(zhǎng)254nm處溶液吸收大于0. 4時(shí)改用pH2. 0的硫酸水溶液洗滌4小 時(shí)，同時(shí)每30分鐘水洗液做液相檢測(cè)。當(dāng)流出液中只含腺苷蛋氨酸時(shí)，即可停止水洗。接著 用注射用水配制0. 3M 1 ，4- 丁二磺酸溶液，將分離柱內(nèi)的腺苷蛋氨酸洗脫下來(lái)，在洗脫的 過(guò)程中，H+置換SAM+，置換下來(lái)的SAM+與1 ， 4- 丁二磺酸根結(jié)合，生成1 ， 4- 丁二磺酸腺苷蛋 氨酸成品，洗脫液用弱堿性大孔丙烯酸陰離子交換樹(shù)脂脫除多余的1，4-丁二磺酸根使5八1+ 與1，4-丁二磺酸根的比例符合要求。洗脫液移交下一步精制工序。
8、精制 在洗脫液中，加入lg/L藥用活性炭，攪拌40分鐘脫色，過(guò)濾，收集濾液放在塑料桶 內(nèi)，按l : 6比例加入藥用酒精，放置48小時(shí)后，將藥用酒精倒出，加入用注射用水溶解沉 淀，用微孔濾膜過(guò)濾，即得腺苷蛋氨酸純品溶液。 把純品溶液冷凍干燥。即得白色粉狀的腺苷蛋氨酸(SAM)干粉成品。
實(shí)施例一
1、發(fā)酵工藝 利用100升發(fā)酵罐發(fā)酵，BSM培養(yǎng)基加發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基 85%磷酸200. 25mL， CaS04 2H20 6. 975g， K2S04136. 5g， MgS04 7H20 111. 75g， K0H 30. 9g， 甘油300g， 加入發(fā)酵培養(yǎng)基后，加水至75L，發(fā)酵罐中12rC滅菌30min。降溫至37。C接種，攪 拌3h，轉(zhuǎn)速500rpm， 8h后600rpm， 15h后650rpm，通氣逐漸加大至1:1。此階段DO和pH 持續(xù)下降，發(fā)酵罐自動(dòng)補(bǔ)加氨水控制PH5. 0 ;通過(guò)提高轉(zhuǎn)速和通氣量來(lái)提高DO，使其不低于 20%。 當(dāng)DO突然急劇上升，由20%上升至70% _90 %時(shí)，進(jìn)入第二階段，開(kāi)始補(bǔ)加補(bǔ)料 2。補(bǔ)料速度126mL/h。轉(zhuǎn)速提高到700rpm。補(bǔ)料2加入DO即會(huì)迅速下降。該階段補(bǔ)加氨 水控制pH5. 0。 當(dāng)補(bǔ)料2補(bǔ)完后，DO又會(huì)急劇上升，此時(shí)進(jìn)入第3階段。碳源饑餓1. 5h，同時(shí)補(bǔ)加 補(bǔ)料3和補(bǔ)料4。補(bǔ)料3流速?gòu)?0. 5mL/h開(kāi)始，每15min增加2. lmL/h，直至25. 2mL/h，D0 下降到20以下。 誘導(dǎo)表達(dá)階段持續(xù)100h左右表達(dá)量達(dá)到最高，發(fā)酵結(jié)束，下罐。此階段結(jié)束時(shí)，生 物量達(dá)290-340g/L， SAM產(chǎn)量21. 11g/L左右。 將發(fā)酵后收集的菌液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為4000Pm，離心10分鐘，棄去上清液，收集沉
淀的菌體，-4(TC凍存。 2、腺苷蛋氨酸合成酶的提取制備 將凍存十天以上的菌體，用20mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮，每克細(xì)胞泥用2毫升 緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎，操做的壓力為60MPa，溫度控制在15t:以下， 循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心后收集含有SAM合成酶和SAM的上 清液。然后用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾濃縮，腺苷蛋氨酸合成酶被截留超 濾濃縮液中，腺苷蛋氨酸(SAM)則在濾過(guò)液中。濃縮液作為下一步酶促反應(yīng)的酶液，濾過(guò)液 移交純化工序提取純化其中的SAM。
3、酶促合成 取上步濃縮液即粗酶液，加入反應(yīng)缸，加入適量純化水，依次加入磷酸二氫鉀、氯 化鎂、葡萄糖、ATP無(wú)機(jī)焦磷酸酶使終濃度為K+濃度250mmol/L， Mg2+濃度30mmol/L，蛋氨 酸為5mmol/L 65mmol/L， ATP無(wú)機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L為5mmol/L 80mmol/L， pH值為
76. 0 7. 5，將反應(yīng)缸升溫至24°C 31°C ，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右，在反應(yīng)過(guò)程中 根據(jù)反應(yīng)的進(jìn)程相應(yīng)地補(bǔ)加蛋氨酸與ATP，以維持最大的酶促反應(yīng)速度。隨時(shí)做液相檢測(cè)， 直至蛋氨酸大部分轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率90%以上)，轉(zhuǎn)化液中SAM含量達(dá)到15g/L轉(zhuǎn)化液時(shí)，即可 加硫酸調(diào)pH3. 0終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 轉(zhuǎn)化終止后，用反應(yīng)體積與硅藻土的比為1 : 0.005的量，加入硅藻土入反應(yīng)缸， 攪拌20分鐘，板框過(guò)濾，以去掉蛋白質(zhì)。過(guò)濾得濾液，濾液再加入強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交 換樹(shù)脂(201x7)攪拌吸附15分鐘，使pH為4. 5，靜置20-30分鐘，真空抽濾，過(guò)濾。
4、純化 取破菌后的濾過(guò)液和酶促后的濾過(guò)液上弱酸性大孔丙烯酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 (D113)分離柱離子交換柱進(jìn)行層析提取。 將上工序?yàn)V液加水溶解成稀釋成電導(dǎo)小于5，調(diào)pH為5. 0-5. 5后緩慢地加入經(jīng)酸 堿處理后處理好的弱酸性大孔丙烯酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(D113)分離柱內(nèi)進(jìn)行吸附。每30分 鐘檢測(cè)洗脫液，測(cè)定其OD值，在波長(zhǎng)254nm處溶液吸收大于0. 4時(shí)改用pH2. 0的硫酸水溶液 洗滌4小時(shí)，當(dāng)流出液中只含SAM時(shí)，即可停止水洗。然后用注射用水配制0. 3M 1，4- 丁 二磺酸溶液，將分離柱內(nèi)的腺苷蛋氨酸洗脫下來(lái)，在洗脫的過(guò)程中，^置換SAM+，置換下來(lái) 的SAM+與1，4- 丁二磺酸根結(jié)合，生成1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品，洗脫液用弱堿性大 孔丙烯酸陰離子交換樹(shù)脂脫除多余的1，4- 丁二磺酸根使SAM+與1，4- 丁二磺酸根的比例 符合要求，用潔凈的塑料桶盛裝洗脫液移交下一步精制工序。
5、精制 在洗脫液中，加入lg/L藥用活性炭，攪拌40分鐘脫色，過(guò)濾，收集濾液放在塑料桶 內(nèi)，按l : 6比例加入藥用酒精，放置48小時(shí)后，將藥用酒精倒出，加入用注射用水溶解沉 淀，用微孔濾膜過(guò)濾，即得腺苷蛋氨酸純品溶液。 把腺苷蛋氨酸純品溶液進(jìn)行冷凍干燥。即得白色粉狀的腺苷蛋氨酸成品。
實(shí)施例二酶催化腺苷蛋氨酸合成反應(yīng)及純化精制。
以10升的反應(yīng)體系為例， 將凍存十天以上的菌體，用20mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮，每克細(xì)胞泥用2毫升 緩沖液，懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎，操做的壓力為60MPa，溫度控制在15t:以下， 循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為15000rpm，離心后收集含有SAM合成酶和SAM的上 清液。然后用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾濃縮，腺苷蛋氨酸合成酶被截留超 濾濃縮液中，腺苷蛋氨酸(SAM)則在濾過(guò)液中。濃縮液作為下一步酶促反應(yīng)的酶液，濾過(guò)液 移交純化工序提取純化其中的SAM。 取含有SAM合成酶超濾濃縮液，加入反應(yīng)缸，加入適量純化水，依次加入磷酸二氫 鉀、氯化鎂、葡萄糖、ATP、無(wú)機(jī)焦磷酸酶使終濃度為K+濃度250mmol/L，Mg"濃度30mmol/L， 蛋氨酸為35mmol/L， ATP為60mmol/L，無(wú)機(jī)焦磷酸酶0. 02mg/L， pH值為6. 5，將反應(yīng)缸升溫 至3rC，攪拌下酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)，10小時(shí)左右，直至蛋氨酸大部分轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率90%以上)， 轉(zhuǎn)化液中SAM含量達(dá)到15g/L轉(zhuǎn)化液時(shí)，即可加硫酸調(diào)pH3. 0終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
轉(zhuǎn)化終止后，用反應(yīng)體積與硅藻土的比為1 : 0.005的量，加入硅藻土入反應(yīng)缸， 攪拌20分鐘，板框過(guò)濾，以去掉蛋白質(zhì)。過(guò)濾得濾液，濾液再加入強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交 換樹(shù)脂(201x7)攪拌吸附15分鐘，使pH為4.5，靜置20-30分鐘，真空抽濾，過(guò)濾。濾液用截留分子量為3000的中空纖維超濾柱，超濾，得濾過(guò)液。 取破菌后的濾過(guò)液和酶促后的濾過(guò)液上弱酸性大孔丙烯酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 (D113)分離柱。每30分鐘檢測(cè)洗脫液，測(cè)定其0D值，在波長(zhǎng)254nm處溶液吸收大于0.4時(shí) 改用pH2. 0的硫酸水溶液洗滌4小時(shí)，停止水洗。 水洗停止后，用注射用水配制0. 3M 1 ， 4- 丁二磺酸溶液，將分離柱內(nèi)的腺苷蛋氨 酸洗脫下來(lái)，即得1，4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸成品。在洗脫液中，加入lg/L藥用活性炭，攪 拌40分鐘脫色，過(guò)濾，收集濾液，按1 : 6比例加入藥用酒精，放置48小時(shí)后，將藥用酒精 倒出，加入用注射用水溶解沉淀，用微孔濾膜過(guò)濾，即得腺苷蛋氨酸純品溶液。
把腺苷蛋氨酸純品溶液放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。即得白色粉狀的腺苷蛋氨 酸(SAM)干粉成品。
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權(quán)利要求
一種生產(chǎn)腺苷蛋氨酸(SAM)的方法。其特征在于首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌，利用發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵，在工程菌中表達(dá)SAM和SAM合成酶，通過(guò)破胞提取胞內(nèi)的SAM和SAM合成酶，然后利用胞內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)腺苷蛋氨酸(SAM)的方法，屬于腺苷蛋氨酸的生產(chǎn)方法。其特征在于首先利用基因工程技術(shù)獲得表達(dá)SAM的高效基因工程菌，利用發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵，在工程菌中表達(dá)SAM和SAM合成酶，通過(guò)破胞提取胞內(nèi)的SAM和SAM合成酶，然后利用胞內(nèi)提取的SAM合成酶再在胞外進(jìn)行胞外酶促合成反應(yīng)生產(chǎn)SAM。即一次發(fā)酵可同時(shí)獲得胞內(nèi)胞外兩部分SAM產(chǎn)物，大大提高了單位發(fā)酵液的產(chǎn)量。即本發(fā)明為低成本大規(guī)模生產(chǎn)藥用腺苷蛋氨酸提供一種新方法。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101736048SQ20081022588
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日
發(fā)明者劉迎, 吳彥卓, 徐明波, 秦富景, 趙晶晶, 陳獻(xiàn)華 申請(qǐng)人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司