專利名稱：小干擾rna及篩選方法及制備治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)性疼痛藥物的制備技術(shù)，尤其涉及一種小干擾RNA及篩選方 法及制備治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
N型電壓依賴性鈣通道(VDCCs)在疼痛的傳遞與調(diào)控中具有重要作用。它們密集分布于 脊髓背角傷害感受性神經(jīng)元突觸前末梢，參與主要疼痛介質(zhì)如谷氨酸和P物質(zhì)等釋放的調(diào) 節(jié)。
RNA干擾(RNA interference, RNAi)現(xiàn)象是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (dsRNA)介導(dǎo)細(xì) 胞內(nèi)的mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，屬于轉(zhuǎn) 錄后的基因沉默機(jī)制。近年，隨著對(duì)RNA干擾現(xiàn)象機(jī)制的深入研究，RNAi已經(jīng)成為一種功能 基因組研究的有效工具。
在N型VDCCs的Cav2.2 mRNA中存在兩種外顯因子， 一種是e37a;另一種是e37b。 e37a 和e37b為人、大鼠、小鼠共有的保守基因序列，均為97個(gè)核苷酸。其中，外顯子e37a特異 地表達(dá)于背根節(jié)神經(jīng)元，而不表達(dá)于脊髓、延髓、中腦、小腦、丘腦、海馬及大腦皮層； 另一種外顯子e37b在上述所有組織中均表達(dá)。
現(xiàn)有技術(shù)中，由于e37a與e37b兩個(gè)外顯子的序列之間具有同源性，僅存在微小差距， 此兩個(gè)外顯子編碼的氨基酸僅相差14個(gè)，因此，臨床應(yīng)用的N型VDCCs阻斷劑，如"一Ctx 等，在治療疼痛時(shí)，對(duì)e37a和e37b均能產(chǎn)生沉默效應(yīng)。
上述現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下缺點(diǎn)
副作用較大，如容易抑制交感神經(jīng)緊張性，引起體位性低血壓、心率減慢等；抑制中 樞突觸傳遞(包括興奮性和抑制性突觸傳遞)，引起共濟(jì)失調(diào)、眩暈、幻覺、精神錯(cuò)亂、惡 心、嘔吐、眼球震顫等癥狀。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種副作用較小的小干擾RNA及篩選方法及制備治療神經(jīng)性疼痛 藥物的應(yīng)用。
4本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的小干擾RNA，該小干擾RNA的序列為CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。 本發(fā)明的上述的小干擾RNA的篩選方法，包括步驟
A、 對(duì)照EGFP報(bào)道基因和Cav2.2 e37a基因序列設(shè)計(jì)EGFP-e37a引物，并通過該引物構(gòu) 建EGFP-e37a融合基因；
所述EGFP-e37a引物包括
L 5' GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3';
Rl 5， AGC CAA CGG GTG GCG CAA TAC AAC GCA ACA AAC TGT ACA TAT CCT TAT AAT GAA TCC GGC AAC TTG TAC AGC TCG TC 3';
R2 5' AGA TCT TTA CTT GTA GGC CAA CCT ACG AGG GCA GTT CTT CCC TAA GCC AAC GGG TGG CG 3，；
所述EGFP-e37a融合基因包括
5， GAATTC—EGFP報(bào)道基因一Cav2.2 e37a基因一AGATCT 3，；
B、 設(shè)計(jì)多對(duì)小干擾RNA，分別用所述多對(duì)小干擾RNA與所述EGFP-e37a融合基因進(jìn)行 RNA干擾試驗(yàn)；
C、 檢測(cè)所述RNA干擾試驗(yàn)效果，選擇使所述EGFP-e37a融合基因受到干擾的程度符合 設(shè)計(jì)要求的小干擾RNA。
本發(fā)明的上述的小干擾RNA制備治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用，該小干擾脂A用于制備治 療神經(jīng)性疼痛的藥物。
由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所述的小干擾RNA及篩選方法及制備 治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用，由于首先對(duì)照EGFP報(bào)道基因和Cav2.2 e37a基因序列設(shè)計(jì) EGFP-e37a引物，并通過PCR、酶切的方法構(gòu)建EGFP-e37a融合基因，然后通過干擾試驗(yàn)篩選 出序列為CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC的小干擾RNA，該小干擾RNA僅對(duì)外顯子e37a產(chǎn)生沉默效 應(yīng)，用該小干擾RNA制備的治療神經(jīng)性疼痛的藥物，副作用小。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的小干擾RNA (siRNA)，其較佳的具體實(shí)施方式
是，該siRNA的序列為 CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC 。
本發(fā)明的上述的小干擾RNA的篩選方法，其較佳的具體實(shí)施方式
是，包括步驟 步驟A、首先，對(duì)照EGFP報(bào)道基因和Cav2.2 e37a基因序列設(shè)計(jì)EGFP-e37a引物，并通 過該引物構(gòu)建EGFP-e37a融合基因；所述EGFP-e37a引物包括
L 5， GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3，；
Rl 5' AGC CAA CGG GTG GCG CAA TAC AAC GCA ACA AAC TGT ACA TAT CCT TAT AAT GAA TCC GGC AAC TTG TAC AGC TCG TC 3';
R2 5' AGA TCT TTA CTT GTA GGC CAA CCT ACG AGG GCA GTT CTT CCC TAA GCC AAC GGG TGG CG 3，；
所述EGFP-e37a融合基因包括
5， GAATTC — EGFP報(bào)道基因一Cav2. 2 e37a基因—AGATCT 3，；
步驟B、然后，設(shè)計(jì)多對(duì)siRNA，分別用多對(duì)siRNA與EGFP-e37a融合基因進(jìn)行RNA干擾 (RNAi)試驗(yàn)；
步驟C、檢測(cè)RNA干擾試驗(yàn)效果，選擇使EGFP-e37a融合基因受到干擾的程度符合設(shè)計(jì) 要求的小干擾RNA。設(shè)計(jì)要求可以為，小干擾RNA對(duì)所述EGFP-e37a融合基因的干擾效率大于 或等于70%，也可以選用其它的設(shè)計(jì)要求。
在上述的RNA干擾試驗(yàn)，還可以對(duì)比小干擾RNA對(duì)Cav2.2 e37b基因的干擾效果，具體 包括步驟
步驟D、對(duì)照EGFP報(bào)道基因和Cav2.2 e37b基因序列設(shè)計(jì)EGFP-e37b引物，并通過該引 物構(gòu)建EGFP-e37b融合基因； 所述EGFP-e37b引物包括
L 5， GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3，；
Rl 5' AAC CCA GAG GTG GGG ACA TGT GTT TCA GCA TCT CAA ACA TGT CAT TGT AAC TGA TGC GCC CAC TTG TAC AGC TCG TC 3，；
R2 5， AGA TCT TTA GTT GTA TGC AAC TCG AGC CGG GCA TTT CTT CCC CAA ACC CAG AGG TGG GG 3'。
所述EGFP-e37b融合基因包括
5， GAATTC—EGFP報(bào)道基因—Cav2.2 e37b基因一AGATCT3，。
步驟E、用上述步驟C中選擇的小干擾RNA與EGFP-e37b融合基因進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)；
步驟F、檢測(cè)RNA干擾試驗(yàn)效果，選擇對(duì)EGFP-e37b融合基因無干擾的小干擾RNA。
上述的RNA干擾試驗(yàn)可以采用以下兩種方法
一種是首先，將融合基因和小干擾RNA分別放入表達(dá)載體質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)；然后， 用小干擾RNA的表達(dá)載體質(zhì)粒與融合基因的表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)； 另一種是首先，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將融合基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞，并挑選
6有綠色熒光的細(xì)胞建立單克隆細(xì)胞株；然后，用小千擾RNA，以單克隆細(xì)胞株為靶細(xì)胞進(jìn)行 RNA干擾試驗(yàn)。
上述的融合基因可以通過PCR和酶切的方法構(gòu)建，構(gòu)建完成后，還可以通過PCR方法、 酶切方法、測(cè)序方法等一種或多種方法鑒定所構(gòu)建的融合基因序列是否正確。
本發(fā)明的上述的小干擾RNA制備治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用，其較佳的具體實(shí)施方式
是，該siRNA用于制備治療神經(jīng)性疼痛的藥物。這里的神經(jīng)性疼痛可以是神經(jīng)性頭痛、三叉 神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、肋間神經(jīng)痛、癌痛、幻肢痛等一種或多種，還可以是其它的神經(jīng)性 疼痛。
具體實(shí)施例，包括
步驟l、對(duì)照EGFP和Cav2.2 e37a/37b的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR和酶切的方法構(gòu) 建了EGFP-37a/37b融合基因，通過PCR、酶切、測(cè)序等方法鑒定序列為正確。
步驟2、按照siRNA的設(shè)計(jì)原則(如遵循Tuschl規(guī)則等)設(shè)計(jì)四對(duì)siRNA，分別編碼為I 號(hào)、II號(hào)、III號(hào)、IV號(hào)
siRNA I : AAGGATATGTACAGTTTGTTG; s i RNAII: CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC; siRNAIII: AAGAACTGCCCTCGTAGGTTG; siRNAlV: AACTGCCCTCGTAGGTTGGCC。 步驟3、將這四對(duì)si脂A分別與EGFP-37a/37b融合基因進(jìn)行RNAi試驗(yàn)。
步驟4、用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)RNAi效果在熒光顯微鏡下可見 siRNAII使細(xì)胞的熒光效率明顯受到抑制，流式細(xì)胞術(shù)可見siRNAII的RNAi效率在48小時(shí)達(dá) 到了80%以上，其余三條siRNA抑制作用不明顯。并且，siRNAII僅對(duì)EGFP-37a產(chǎn)生特異性的 沉默效應(yīng)；
步驟5、將得到的有效且特異性干擾外顯子e37a mRNA的表達(dá)水平的siRNA序列，用 western blot的方法檢測(cè)融合基因的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果可見對(duì)應(yīng)蛋白條帶明顯減弱。
步驟6、以Cav2.2的全基因表達(dá)質(zhì)粒在293FT細(xì)胞系中進(jìn)行表達(dá)，并共轉(zhuǎn)染siRNAII表 達(dá)質(zhì)粒，用Western blot的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，得到與步驟5—致的結(jié)果，從而驗(yàn)證了 si腦AII的有效性和特異性。
本發(fā)明通過構(gòu)建EGFP報(bào)道基因和37a/37b的融合基因，遵循Tuschl規(guī)則設(shè)計(jì)siRNA,利 用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀的方法檢測(cè)出起作用的siRNA序列，并用western blot的方法驗(yàn) 證，即對(duì)融合基因和全基因的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，得到有效且特異性干擾外顯子e37amRNA的表達(dá)水平的s i RNA序列。
該siRNA序列可以對(duì)疼痛耙點(diǎn)N型鈣通道a l亞基進(jìn)行干擾，并特異性干擾外顯子e37a mRNA的表達(dá)水平，不僅是對(duì)e37a能產(chǎn)生沉默效應(yīng)，而且對(duì)e37b不起作用，即對(duì)e37a有特異 性沉默效應(yīng)。
在人、鼠的背根節(jié)神經(jīng)元中，外顯子e37a的表達(dá)水平為外顯子e37b的1/10 ， e37a具 有不同于e37b的生物物理特性，激活電壓低且鈣電流密度大，因此雖然表達(dá)較低但具有更 高的生物學(xué)效能，這為疼痛治療提供了一個(gè)非常有意義的新靶標(biāo)。本發(fā)明針對(duì)該靶標(biāo)篩選 的siRNA，可以為神經(jīng)性疼痛治療提供新的可行性方法和藥物。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任 何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都 應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種小干擾RNA，其特征在于，該小干擾RNA的序列為CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。
2、 一種權(quán)利要求1所述的小干擾RNA的篩選方法，其特征在于，包括步驟A、 對(duì)照EGFP報(bào)道基因和Cav2.2 e37a基因序列設(shè)計(jì)EGFP-e37a引物，并通過該引物構(gòu) 建EGFP-e37a融合基因；所述EGFP-e37a引物包括L 5， GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3';Rl 5' AGC CAA CGG GTG GCG CAA TAC AAC GCA ACA AAC TGT ACA TAT CCT TAT AAT GAA TCC GGC AAC TTG TAC AGC TCG TC 3，；R2 5' AGA TCT TTA CTT GTA GGC CAA CCT ACG AGG GCA GTT CTT CCC TAA GCC AAC GGG TGG CG 3，；所述EGFP-e37a融合基因包括5， GAATTC — EGFP報(bào)道基因一Cav2. 2 e37a基因一AGATCT 3，；B、 設(shè)計(jì)多對(duì)小干擾RNA，分別用所述多對(duì)小干擾RNA與所述EGFP-e37a融合基因進(jìn)行 RNA干擾試驗(yàn)；C、 檢測(cè)所述RNA干擾試驗(yàn)效果，選擇使所述EGFP-e37a融合基因受到干擾的程度符合 設(shè)計(jì)要求的小干擾RNA。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小干擾RNA的篩選方法，其特征在于，所述RNA干擾試驗(yàn)的設(shè) 計(jì)要求為所述小干擾RNA對(duì)所述EGFP-e37a融合基因的干擾效率大于或等于70X。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小干擾RNA的篩選方法，其特征在于，還包括步驟D、 對(duì)照EGFP報(bào)道基因和Cav2.2 e37b基因序列設(shè)計(jì)EGFP-37b引物，并通過該引物構(gòu)建 EGFP-e37b融合基因；所述EGFP-e37b引物包括L 5' GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3';Rl 5， AAC CCA GAG GTG GGG ACA TGT GTT TCA GCA TCT CAA ACA TGT CAT TGT AAC TGA TGC GCC CAC TTG TAC AGC TCG TC 3，；R2 5' AGA TCT TTA GTT GTA TGC AAC TCG AGC CGG GCA TTT CTT CCC CAA ACC CAG AGG TGG GG 3';所述EGFP-e37b融合基因包括5， GAATTC—EGFP報(bào)道基因一Cav2.2 e37b基因一AGATCT3，；E、 用所述步驟C中選擇的小干擾RNA與所述EGFP-e37b融合基因進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)；F、檢測(cè)所述步驟E中RNA干擾試驗(yàn)效果，選擇對(duì)所述EGFP-e37b融合基因無干擾的小干 擾RNA。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的小干擾RNA的篩選方法，其特征在于，所述RNA干擾試驗(yàn) 包括首先，將所述融合基因和所述小干擾RNA分別放入表達(dá)載體質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)； 然后，用所述小干擾RNA的表達(dá)載體質(zhì)粒與所述融合基因的表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn) 染，進(jìn)行所述RNA干擾試驗(yàn)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的小干擾RNA的篩選方法，其特征在于，所述RNA干擾試驗(yàn) 包括首先，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將所述融合基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞，并挑選有綠色 熒光的細(xì)胞建立單克隆細(xì)胞株；然后，用所述小干擾RNA，以所述單克隆細(xì)胞株為靶細(xì)胞進(jìn)行所述RNA干擾試驗(yàn)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的小干擾RNA的篩選方法，其特征在于，所述融合基因通過 PCR和酶切的方法構(gòu)建，構(gòu)建完成后，還通過以下至少一種方法鑒定所述融合基因序列是否 正確PCR方法、酶切方法、測(cè)序方法。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小干擾RNA的篩選方法，其特征在于，所述多對(duì)小干擾RNA遵 循Tuschl規(guī)則設(shè)計(jì)，所述多對(duì)小干擾RNA包括以下4對(duì)小干擾RNA:siRNA I : AAGGATATGTACAGTTTGTTG; s i RNAII: CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC; si畫II: AAGAACTGCCCTCGTAGGTTG; siRNAIV: AACTGCCCTCGTAGGTTGGCC。
9、 一種權(quán)利要求1所述的小干擾RNA制備治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用，其特征在于， 該小干擾RNA用于制備治療神經(jīng)性疼痛的藥物。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的小干擾RNA制備治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用，其特征在于， 所述神經(jīng)性疼痛包括以下一種或多種神經(jīng)性頭痛、三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、肋間神經(jīng) 痛、癌痛、幻肢痛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小干擾RNA及篩選方法及制備治療神經(jīng)性疼痛藥物的應(yīng)用，首先對(duì)照EGFP和Cav2.2 e37a/37b的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法構(gòu)建EGFP-e37a/37b融合基因，然后通過干擾試驗(yàn)篩選出序列為CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC的小干擾RNA，該小干擾RNA可以對(duì)疼痛靶點(diǎn)N型鈣通道α1亞基進(jìn)行干擾，并特異性干擾外顯子e37a mRNA的表達(dá)水平，僅是對(duì)e37a能產(chǎn)生沉默效應(yīng)，對(duì)e37b不起作用。用該小干擾RNA制備的治療神經(jīng)性疼痛藥物，副作用小?？梢杂糜谥苽渲委熒窠?jīng)性疼痛(例如神經(jīng)性頭痛、三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、肋間神經(jīng)痛、癌痛、幻肢痛等)方面的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101555476SQ20081022575
公開日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2008年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者馮澤國(guó), 吳小兵, 砡 張, 李冠華, 維 王, 娜 陳 申請(qǐng)人:馮澤國(guó);吳小兵;陳 娜