專利名稱：：尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種絲氨酸蛋白酶，具體地說(shuō)是一種蛇毒血凝酶，本發(fā)明還涉及其分離純化方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)，在蝮亞科(Crotalinae)蛇毒中多存在一類與血液凝固相關(guān)的蛋白酶，通常稱之為"類凝血酶"(thrombin-likeenzyme,簡(jiǎn)稱TLC)。類凝血酶與凝血酶(thrombin)的作用相似，可以使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而"凝固"?，F(xiàn)已在30多種蝮科蛇毒中發(fā)現(xiàn)并分離純化出20余種TLC。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的TLC分子量多在30,000左右，大多數(shù)為酸性糖蛋白。在以往已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛇毒TLC中，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)多為單鏈，其代表產(chǎn)品"立止血"是由巴西矛頭蝮蛇蛇毒中分離出的凝血酶，但在蝮亞科蛇毒TLC中也存在雙鏈分子結(jié)構(gòu)，鏈間由二硫鍵連接。XinCheng等(中國(guó)科技大學(xué))1999年報(bào)導(dǎo):從五步蛇ac^w)中分離到一種"類凝血酶"，命名為"Agkisacutacin"。該蛋白由兩條肽鏈構(gòu)成，a-亞基分子量15kDa,P-亞基分子量14kDa。Agkisacutacin能夠水解纖維蛋白原中的oc鏈。肖昌華(中科院昆明動(dòng)物研究所)2004年從五步蛇"g/b'WraA"acW附)中分離到兩種"類凝血酶"，均為雙鏈分子結(jié)構(gòu)。凝血酶I的A亞基含有132個(gè)氨基酸，分子量16,000Da;B亞基含有123個(gè)氨基酸，分子量14，000Da，酶比活性為160U/mg。凝血酶II的A亞基含有122個(gè)氨基酸，分子量15，000Da;B亞基含有120個(gè)氨基酸，分子量13,000Da，酶比活性為70U/mg。該兩種TLC經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明均具有止血功效。我國(guó)具有豐富的蛇毒研究資源，本發(fā)明人從我國(guó)的尖吻蝮蛇C4g^^O^)W"CW/M,俗稱五步蛇)的蛇毒中分離得到一種高活性血凝酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種蛇毒血凝酶，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離得到的一種類凝血酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種分離純化上述血凝酶的方法。本發(fā)明血凝酶是從中國(guó)尖吻蝮蛇(JgA^rocfo"acw^s)蛇毒中分離得到的高活性血凝酶。該酶具有如下特征①酶蛋白分子量為29，800Dalton。②由a、(3兩個(gè)亞基構(gòu)成，亞基鏈間由二硫鍵連接。③a亞基含129個(gè)氨基酸，分子量為15，500Dalton,其氨基酸序列如SEQIDNo.l所示;(3亞基含123個(gè)氨基酸，分子量為14,300Dalton,其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一種絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明還提供上述蛇毒血凝酶的純化方法，其包括如下步驟1)、蛇毒預(yù)處理；2)、將預(yù)處理后的蛇毒溶液上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE-SephroseFF層析柱，用0.01MpH7.4PBS洗柱，再用含0lMNaCl的0.01MpH7.4PBS分步洗脫，收集0.06MNaCl溶液的洗脫液；3)、將上述洗脫液適當(dāng)濃縮后透析或多次稀釋超濾去除NaCl;4)、將透析后的溶液再次上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE_SephroseFF層析柱，用0.01MpH7.4PBS洗柱，再用含0lMNaCl的0.01MpH7.4PBS分步洗脫，收集0.06MNaCl溶液洗脫液的最后洗脫峰；5)、將上述洗脫液適當(dāng)濃縮后透析或多次稀釋超濾去除NaCl。其中，步驟1)蛇毒預(yù)處理的方法是將蛇毒用適量預(yù)冷的0.01MpH7.4PBS溶解，離心取上清液進(jìn)行透析或超濾(可用分子截留量為5000D的膜進(jìn)行切向流超濾)，通過(guò)預(yù)處理可以去除不容的雜質(zhì)以及小分子多肽，并降低溶液離子強(qiáng)度。具體地說(shuō)可通過(guò)如下步驟進(jìn)行蛇毒的預(yù)處理稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量20倍體積預(yù)冷的0.01MpH7.4PBS于4-8°C的層析柜中攪拌溶解30分鐘，于4。C、10000g離心IO分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉淀用PBS攪拌懸浮，再次離心。合并兩次離心上清液于透析袋中，在層析柜中對(duì)0.01MpH7.4PBS透析24小時(shí)，中間換液3次，以去除小分子多肽和降低溶液離子強(qiáng)度。如上所述，各透析步驟均可采用切向流超濾(選用截止值5000分子量膜)方法代替，通過(guò)稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強(qiáng)度。其中，步驟2)和步驟4)可釆用0.01MpH7.4PBS預(yù)平衡DEAE-SephroseFF層析柱，然后上樣。其中，步驟3)和步驟5)的目的均是去除溶液中存在的NaCl。洗脫液濃縮的方法可釆用硫酸銨沉淀后溶解，然后進(jìn)行透析，或反復(fù)采用稀釋和超濾濃縮的方法去除硫酸銨。具體可釆用如下方法在攪拌條件下逐步添加粉末固體硫酸銨，使硫酸銨飽和度達(dá)到80%,4'C、10，000g離心10分鐘，收集沉淀蛋白，沉淀蛋白用適量的0.01MpH7.4PBS溶解，裝入一透析袋中，對(duì)0.01MpH7.4PBS進(jìn)行透析，共透析24小時(shí)。期間換液三次。如上所述，也可不經(jīng)硫酸銨沉淀，而使用切向流超濾(選用截止值5000分子量膜)通過(guò)稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以濃縮蛋白，脫去NaCl。經(jīng)本發(fā)明方法純化的血凝酶比活為800-1200u/mg蛋白(活性隨不同批次蛇毒原料而有所變化)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)—條帶，HPLC分析純度可達(dá)95%以上。以蛇毒原料重量計(jì)，本法純化收得率為0.3%-0.5%。本發(fā)明血凝酶具有良好的凝集活性，可制成各種止血藥物，例如經(jīng)適當(dāng)稀釋到規(guī)定酶活濃度，再添加凍干保護(hù)劑(低分子右旋糖酐20或人血白蛋白)，病毒膜過(guò)濾，分裝西林瓶，冷凍干燥制成醫(yī)用注射凍干粉劑。用于外科手術(shù)中止血，以及各種臨床出血癥狀。圖1顯示的是本發(fā)明血凝酶對(duì)人纖維蛋白原的水解作用，4h、2h、、lh、0.5h:分別代表血凝酶水解人纖維蛋白原的時(shí)間；F:人纖維蛋白原對(duì)照；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1蛇毒血凝酶的純化取10g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批號(hào)20061001,廣西蛇毒研究所)，用200ml預(yù)冷的0.01MpH7.4PBS于4-8°C的層析柜中攪拌溶解30分鐘，4"C8000g離心IO分鐘，將離心上清液傾入一個(gè)3000ml燒杯中，釆用MilliporePellicon2切向流超濾器(0.1M2cutoff5k膜)超濾濃縮至100ml,再加入300mlO.OIMpH7.4的PBS,再超濾至lOOml。該超濾濃縮過(guò)程循環(huán)3次。向100ml超濾濃縮液中加入100mlO.OIMpH7.4的PBS，按30ml/min流速上樣到經(jīng)O.OIMpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)預(yù)平衡的DEAE-SephroseFF柱。上樣后，按以下方法進(jìn)行洗脫，洗脫速度50ml/min:a.用5升0.01MpH7.4PBS淋洗柱子;b.用2升0.01MpH7.4PBS內(nèi)含0.02MNaCl的溶液洗脫；c.用2升O.OIMpH7.4PBS內(nèi)含0.06MNaCl的溶液洗脫；d.用4升O.OIMpH7.4PBS內(nèi)含lMNaCl的溶液洗脫，以除去強(qiáng)吸附蛋白；e.用20升O.OIMpH7.4PBS平衡層析柱，備用。經(jīng)電泳分析目的物出現(xiàn)在0.06MNaCl的洗脫液的前3瓶中，合并此3瓶洗脫液，共得587ml,在攪拌條件下往此溶液中逐步添加329.3克固體硫酸銨粉末，使硫酸銨飽和度達(dá)到80%以沉淀目的蛋白。沉淀靜置過(guò)夜后10000g離心10min，傾去上清液，沉淀物用15mlO.01MpH7.4PBS溶解，待攪拌溶解后裝入一只容量約50ml的透析袋中，再用適量的0.01MpH7.4PBS洗滌離心管兩次，洗滌液也倒入透析袋中，使袋中溶液體積為30ml。對(duì)0.01MpH7.4PBS進(jìn)行，共透析三次，每次用液l升，共透析24小時(shí)。透析結(jié)束后，將透析液倒入50ml離心管中，用10ml0.01MpH7.4PBS洗透析袋，洗滌液也倒入離心管中，10000g離心10min，小心傾出上清液于另一50ml離心管，加0.01MpH7.4PBS以補(bǔ)足溶液量為50ml。上樣至DEAE-SephroseFF柱中，按上述方法進(jìn)行第二次層析，0.01MpH7.4PBS淋洗后，依次用含0.02M、0.04M、0.06M以及1MNaCl的0.01MpH7.4PBS進(jìn)行洗脫。血凝酶出現(xiàn)在0.06MNaCl洗脫液的最后一個(gè)峰中，收集該峰洗脫液得352ml。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查為一條帶，說(shuō)明已經(jīng)得到純化。該收集液在攪拌條件下逐步添加195克固體硫酸銨粉末，使蛋白沉淀下來(lái)，過(guò)夜后誦0g離心10min收集沉淀蛋白用15ml0.01MpH7.4PBS溶解后轉(zhuǎn)移至一支50ml離心管中，10000g離心10min后，上清液小心地吸出裝入一只容量約為30ml的透析袋中，對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析，共透析3次，每次1.5升。透析后測(cè)定酶活性為1203u/mg蛋白，收獲蛋白32.1mg。最終收率0.32%。HPLC分析純度98.1%，SDS-PAGE(非還原)為一條帶，還原SDS-PAGE(還原)為兩條帶，其分子量大致為16KD和14KD。實(shí)施例2蛇毒血凝酶的純化取10g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批號(hào)20061001，廣西蛇毒研究所)，按上述工藝進(jìn)行第一次DEAE-SephroseFF層析，經(jīng)電泳分析目的物出現(xiàn)在0.06MNaCl的洗脫液的前3瓶中，合并此3瓶洗脫液，共得595ml，在撹拌條件下往此溶液中逐步添加334克固體硫酸銨粉末，使硫酸銨飽和度達(dá)到80%以沉淀目的蛋白。沉淀靜置過(guò)夜后10000g離心10min,傾去上清液，沉淀物用15ml0.01MpH7.4PBS溶解,待攪拌溶解后裝入一只容量約50ml的透析袋中，再用適量的0.01MpH7.4PBS洗滌離心管兩次，洗滌液也倒入透析袋中，使袋中溶液體積為32ml。對(duì)0.01MpH7.4PBS進(jìn)行，共透析三次，每次用液1升，共透析24小時(shí)。透析結(jié)束后，將透析液倒入50ml離心管中，用10ml0.01MpH7.4PBS洗脫透析袋，洗滌液也倒入離心管中，10000g離心10min，小心傾出上清液于另一50ml離心管，加0.01MpH7.4PBS以補(bǔ)足溶液量為50ml。上樣至DEAE-SephroseFF柱中，進(jìn)行第二次層析。血凝酶出現(xiàn)在0.06MNaCl洗脫液的最后一個(gè)峰中，收集該峰洗脫液得364ml。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查為一條帶，說(shuō)明已經(jīng)得到純化。該收集液在攪拌條件下逐步添加202克固體硫酸銨粉末，使蛋白沉淀下來(lái)，過(guò)夜后10000g離心10min收集沉淀蛋白用15ml0.01MpH7.4PBS溶解后轉(zhuǎn)移至一支50ml離心管中，10000g離心10min后，上清液小心地吸出裝入一只容量約為30ml的透析袋中，對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析，共透析3次，每次1.5升。透析后測(cè)定酶活性為1190u/mg蛋白，收獲蛋白33.4mg。最終收率0.33%。HPLC分析純度97.8%,SDS-PAGE(非還原)為一條帶，還原SDS-PAGE(還原)為兩條帶，其分子量大致為16KD和14KD。'實(shí)施例3蛇毒血凝酶的純化取IO克尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批號(hào)20061102廣西蛇毒研究所)，按上述工藝進(jìn)行第一次DEAE-SephroseFF層析，經(jīng)電泳分析目的物出現(xiàn)在0.06MNaCl的洗脫液的前3瓶中，合并此3瓶洗脫液，共得622ml，在撹拌條件下往此溶液中逐步添加349克固體硫酸銨粉末，使硫酸銨飽和度達(dá)到80%以沉淀目的蛋白。沉淀靜置過(guò)夜后10000g離心10min，傾去上清液，沉淀物用15mlO.01MpH7.4PBS溶解，待攪拌溶解后裝入一只容量約50ml的透析袋中，再用適量的0.01MpH7.4PBS洗滌離心管兩次，洗滌液也倒入透析袋中，使袋中溶液體積約為30ml。對(duì)0.01MpH7.4PBS進(jìn)行，共透析三次，每次用液1升，共透析24小時(shí)。透析結(jié)束后，將透析液倒入50ml離心管中，用10ml0.01MpH7.4PBS洗脫透析袋，洗滌液也倒入離心管中，10000g離心10min，小心傾出上清液于另一50ml離心管，加0.01MpH7.4PBS以補(bǔ)足溶液量為50ml。上樣至DEAE-SephroseFF柱中，進(jìn)行第二次層析。血凝酶出現(xiàn)在0.06MNaCl洗脫液的最后一個(gè)峰中，收集該峰洗脫液得354ml。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查為一條帶，說(shuō)明已經(jīng)得到純化。該收集液在攪拌條件下逐步添加211.5克固體硫酸銨粉末，使蛋白沉淀下來(lái)，過(guò)夜后10000g離心10min收集沉淀蛋白用15ml0.01MpH7.4PBS溶解后轉(zhuǎn)移至一支50ml離心管中，10000g離心10min后，上清液小心地吸出裝入一只容量約為30ml的透析袋中，對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析，共透析3次，每次1.5升。透析后測(cè)定酶活性為803u/mg蛋白，收獲蛋白49.9mg。最終收率0.50%。HPLC純度96.80/。，SDS-PAGE(非還原)為一條帶，還原SDS-PAGE(還原)為兩條帶，其分子量大致為16KD和14KD。實(shí)施例4蛇毒血凝酶的純化1、裝柱在一根7cmx30cm的柱中裝入柱床體積約為1000mlDEAE-SephroseFF(DEAESepharoseFastFlowcolumn,GEHealthcare公司)柱料，并用15升0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行充分平衡。2、稱取50克尖吻蝮蛇蛇毒干粉(批號(hào)20061102，廣西蛇毒研究所)用1000ml預(yù)冷的0.01MpH7.4PBS于4-8°C的層析柜中攪拌溶解30分鐘，4。C8000g離心IO分鐘，將離心上清液傾入一個(gè)3000ml燒杯中，釆用MilliporePellicon2切向流超濾器(0.1M2cutoff5k膜)超濾濃縮至500ml,再加入1500ml0.01MpH7.4的PBS,再超濾至500ml。該超濾濃縮過(guò)程循環(huán)3次。3、向500ml超濾濃縮液中加入500ml0.01MpH7.4的PBS,按30ml/min流速上樣到DEAE-SephroseFF柱。4、上樣后，按以下方法進(jìn)行洗脫，洗脫速度50ml/min:a.用12升O.OIMpH7.4PBS淋洗柱子b.用5升O.OIMpH7.4PBS內(nèi)含0.02MNaCl的溶液洗脫；c.用5升0.01MpH7.4PBS內(nèi)含0.06MNaCl的溶液洗脫；d.用10升O.OIMpH7.4PBS內(nèi)含lMNaCl的溶液洗脫,以除去強(qiáng)吸附蛋白；e.用20升O.OIMpH7.4PBS平衡層析柱，備用。5、收集的目的蛋白出現(xiàn)在0.06MNaCl溶液洗脫液中，洗脫峰共收集2620ml。6、將收集液超濾濃縮至500ml。7、向500ml超濾濃縮液中加入1500mlO.OIMpH7.4的PBS，再超濾至500ml。該超濾濃縮過(guò)程循環(huán)3次。8、向500ml超濾濃縮液中加入500mlO.OIMpH7.4的PBS，按30ml/min流速上樣至DEAE-SephroseFF柱。9、上樣后，按以下方法進(jìn)行洗脫，洗脫速度為50ml/min:a.用5升O.OIMpH7.4PBS淋洗柱子；b.用5升0.01MpH7.4PBS內(nèi)含0.02MNaCl的溶液洗脫；c.用5升0.01MpH7.4PBS內(nèi)含0.04MNaC的溶液洗脫；d.用5升O.OIMpH7.4PBS內(nèi)含0.06MNaCl的溶液洗脫；e.用IO升1MpH7.4PBS內(nèi)含lMNaCl的溶液洗脫，以除去強(qiáng)吸附蛋白；f.用20升O.OIMpH7.4PBS平衡層析柱，備用。10、目的蛋白出現(xiàn)在0.06MNaCl洗脫液中，按紫外檢測(cè)收集各峰，最后一峰有很好的分離度，該洗脫峰共收集1530ml。11、將1530ml收集液進(jìn)行15倍超濾濃縮。再加入1000ml預(yù)冷的無(wú)離子水繼續(xù)進(jìn)行10倍超濾濃縮。該稀釋、超濾濃縮過(guò)程循環(huán)3次。測(cè)量最終超濾濃縮液體積為110ml,測(cè)定蛋白濃度為2.2mg/ml。共收獲蛋白242mg。12、用MilliporeVi扁lveNFPFiltersOptiScale_25病毒膜過(guò)濾，分裝西林瓶，冷凍干燥。13、凍干粉經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢查為一條帶，HPLC純度達(dá)97.2%。比活為812u/mg蛋白。收獲總酶活185,586單位(蛋白228.5mg)。最終收率0.46%。SDS-PAGE(非還原)為一條帶，還原SDS-PAGE(還原)為兩條帶，其分子量大致為16KD和14KD。實(shí)施例5尖吻蝮蛇血凝酶的絲氨酸蛋白屬性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例3中分離的血凝酶(純度96.8%)再經(jīng)HPLC純化制備，獲得蛋白純度為100%的尖吻蝮蛇血凝酶溶液，酶活性為14U/ml。用生理鹽水配制1%的牛纖維蛋白原(Sigma公司)溶液。用異丙醇溶解苯甲基磺酰氟(PMSF,Merck公司產(chǎn)品)，溶液濃度為4mg/ml。。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下(1)取2ml1%牛纖維蛋白原溶液，37r下恒溫5分鐘。(2)取三支小試管，分別標(biāo)注1#、2#、3#,每管加入20(Hd經(jīng)蒸餾水稀釋一倍的血凝酶溶液(7U/ml)。(3)分別向1#試管加入10pl蒸餾水，2#試管加入10|il異丙醇，3#試管加入10|ilPMSF，于37。C水浴保溫5分鐘。(4)按試管編號(hào)順序分別單獨(dú)進(jìn)行凝集試驗(yàn)觀察。向試管中加入恒溫好的r/。牛纖維蛋白原溶液200ul，立即計(jì)時(shí)，同時(shí)輕輕搖動(dòng)混句，于37r水洛中靜置，觀察試管中凝集反應(yīng)的情況。以溶液呈現(xiàn)完全凝固狀態(tài)時(shí)終止計(jì)時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表一表一、PMSF對(duì)凝集時(shí)間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>根據(jù)表一中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論①100ppm濃度的PMSF完全抑制了該血凝酶活性，證明尖吻蝮蛇血凝酶為絲氨酸蛋白酶。②微量異丙醇對(duì)本凝集反應(yīng)無(wú)影響。實(shí)施例6尖吻蝮蛇血凝酶水解人纖維蛋白原實(shí)驗(yàn)用50mMTris-HCl(pH7.4)緩沖液配制4mg/ml的人纖維蛋白原溶液。分別向5支小試管中各加入0.5ml人纖維蛋白原溶液，分別按4個(gè)不同水解保溫時(shí)間順序間隔向其中4管中加入經(jīng)提取純化的1個(gè)活性單位的血凝酶。37。C水洛保溫4、2、l和0.5小時(shí)，保溫后立即進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察人纖維蛋白原的水解程度。另一支0.5ml纖維蛋白原對(duì)照管同時(shí)于37'C水洛保溫4小時(shí)。如圖1結(jié)果所示未經(jīng)血凝酶水解的纖維蛋白原對(duì)照的電泳圖呈現(xiàn)出三條帶，圖中F列從上至下分別為ct、P、Y亞基。纖維蛋白原在血凝酶(1單位)作用0.5小時(shí)和1小時(shí)后，cc亞基帶逐漸變淺，作用于2小時(shí)和4小時(shí)后，a亞基帶完全消失。該結(jié)果證實(shí)血凝酶有水解纖維蛋白原a亞基的作用。序列表<110>康辰醫(yī)藥股份有限公司<120>尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶<130><160>2<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>129<212>PRT<213>Agkis加donacutus<400>1AspCysSerSerGlyTrpSerSerTyrGluGlyHisCysTyrLys151015ValPheLysGinSerLysThrTrpAlaAspAlaGluSerPheCys202530ThrLysGinValAsnGlyGlyHisLeuValSerLeuGluSerSer354045GlyGluAlaAspPheValGlyGinLeuLeuAlaGinLysLeuLys505560SerAlaLysLeuHisValTrpLeuGlyLeuArgAlaGinAsnLys657075GluLysGinCysSerLeuGinTrpSerAspGlySerSerLeuSer808590TyrGluAsnTrpLeuGluGluGluSerLysLysCysLeuGlyVal95100105HisLeuGluThrGlyPheHisLysTrpGluAsnPheTyrCysGlu110115120GinGinAspProPheValCysGluAla<210>2<211〉123〈212>PRT<213>Agkistrodonacutus14<400〉2AspCysPro1ProPheAsnThrLysGinGluGluAlaTyrGlyLeuAsnTrpGinSerGluHisAspPheTrpAlaGluGluSerTrpArgSerLeuPheGinAlaAspTrpSerSer5ProLysAsnTrp20ThrGlyGlyHis35PheValValLys50TrpPheGlyLeu65SerAsnAlaAla80TyrCysValTyr95ThrCysArgMet110TyrGluGlyHisCysTyrLys1015AlaAspAlaGluAsnPheCys2530LeuValSerPheGinSerThr4045LeuAlaPheGinThrPheAsp5560SerLysLeuTrpAsnGinCys7075Met二euLysTyrThrAspTrp8590PheLysSerThrAsnAsnLys100105AlaAsnPheValCysGlu115120權(quán)利要求1、尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶，其由α、β兩個(gè)亞基構(gòu)成，亞基鏈間由二硫鍵連接，其中α亞基具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，β亞基具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。2、如權(quán)利要求1所述的蛇毒血凝酶，其特征在于該酶是一種絲氨酸蛋白酶，能夠水解人纖維蛋白原oc鏈。3、含有權(quán)利要求1或2所述蛇毒血凝酶的藥物。4、如權(quán)利要求3所述的藥物，其為凍干粉。5、權(quán)利要求l或2所述血凝酶的純化方法，其包括如下步驟1)、蛇毒預(yù)處理；2)、將預(yù)處理后的蛇毒溶液上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE-SephroseFF層析柱，用0.01MpH7.4PBS洗柱，再用含0lMNaCl的0.01MpH7.4PBS分步洗脫，收集0.06MNaCl溶液的洗脫液；3)、將上述洗脫液適當(dāng)濃縮后透析去除NaCl;4)、將透析后的溶液再次上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE-SephroseFF層析柱，用O.OIMpH7.4PBS洗柱，再用含0lMNaCl的0.01MpH7.4PBS分步洗脫，收集0.06MNaCl溶液洗脫液的最后洗脫峰；5)、將上述洗脫液適當(dāng)濃縮后透析去除NaCl。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟1)蛇毒預(yù)處理的方法是將蛇毒用適量預(yù)冷的0.01MpH7.4PBS溶解，離心取上清液進(jìn)行透析或超濾。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于其中步驟1)蛇毒預(yù)處理的方法是稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量20倍體積預(yù)冷的0.01MpH7.4PBS于4-8。C的層析柜中撹拌溶解30分鐘，于4。C、10000g離心IO分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉淀用PBS攪拌懸浮，再次離心，合并兩次離心上清液于透析袋中，在層析柜中對(duì)0.01MpH7.4PBS透析24小時(shí)，中間換液3次；或?qū)⑸叨救芙夂笥梅肿咏亓袅繛?000D的超濾膜進(jìn)行超濾。8、如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟2)和步驟4)釆用0.01MpH7.4PBS預(yù)平衡DEAE-SephroseFF層析柱，然后上樣。9、如權(quán)利要求58任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于其中步驟2)和步驟4)在攪拌條件下向洗脫液中逐步添加粉末固體硫酸銨，使硫酸銨飽和度達(dá)到80%,4°C、10,000g離心IO分鐘，收集沉淀蛋白，沉淀蛋白用適量的0.01MpH7.4PBS溶解，裝入一透析袋中，對(duì)0.01MpH7.4PBS進(jìn)行透析，共透析24小時(shí)，期間換液三次；或釆用分子截留量為5000D的超濾膜將洗脫液經(jīng)反復(fù)稀釋超濾除鹽以濃縮蛋白。全文摘要本發(fā)明提供了一種尖吻蝮蛇血凝酶，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離得到的一種高活性血凝酶，由α、β兩個(gè)亞基構(gòu)成，亞基鏈間由二硫鍵連接，其中α亞基具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，β亞基具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明尖吻蝮蛇血凝酶為絲氨酸蛋白酶，能夠水解人纖維蛋白原α鏈。本發(fā)明還提供了該酶的純化方法，包括通過(guò)預(yù)處理去除不容物和小分子多肽，并降低溶液離子強(qiáng)度，在通過(guò)兩次DEAE-SephroseFF柱層析，收集活性洗脫峰，經(jīng)透析或超濾除鹽后即得高純度蛇毒血凝酶，其比活為800-1200u/mg蛋白，HPLC分析純度可達(dá)95％以上，純化收得率為0.3％-0.5％。文檔編號(hào)C12N9/64GK101358184SQ20081022343公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者王錫娟申請(qǐng)人:康辰醫(yī)藥股份有限公司