專利名稱：：德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鯉魚雜交優(yōu)勢種群的篩選方法。
背景技術(shù)：
：德國鏡鯉(C>/n>msc^p/oL.mirror)是歐洲野鯉家養(yǎng)后因鱗被基因突變而分離出來的，再經(jīng)人工培育形成的鯉魚品種。1984年由聯(lián)邦德國引入我國，并由中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所多年選育到F4代，已經(jīng)適應了我國的養(yǎng)殖條件，并繼續(xù)表現(xiàn)其生長快的特性，已成為適合我國北方養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，被國家原種和良種審定委員會認定為國家級良種。但由于德國鏡鯉選育系(F4)是早在1995年選育完成的，且只選育到了第4代，所以某些遺傳性狀還不夠穩(wěn)定(如體形、鱗被和抗病力等)；加之20多年來德國鏡鯉選育系(F4)在全國各地養(yǎng)殖，已各自形成了獨立的繁殖群體，其群體種質(zhì)、遺傳結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)性能等與F4代相比可能有不同程度的改變；所以，現(xiàn)有不同德國鏡鯉種群間的差異性難以衡量。遺傳多樣性是每種生物所固有的特性，它是長期適應環(huán)境與進化的產(chǎn)物，遺傳多樣性越高則意味著適應生存能力越強，所蘊涵的育種和遺傳改良能力也就越強，也就是說差別越大的群體間雜交所產(chǎn)生的雜種優(yōu)勢越大。選用種群差異性大的群體進行雜交可以減少工作量、縮短育種年限、降低育種成本和提高選育成功率；但是，如何從眾多的德國鏡鯉種群中篩選出雜交優(yōu)勢種群、確保其雜種的遺傳多樣性，目前尚沒有行之有效的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了提供一種行之有效的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，以確保其雜種的遺傳多樣性，從而可以減少工作量、縮短育種年限、降低育種成本和提高選育成功率。德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群按以下步驟進行篩選a、形態(tài)標記對各種群隨機選出的德國鏡鯉的可量性狀和可數(shù)形狀進行標記；b、再進行微衛(wèi)星分子標記(l)DNA的提取與純化；(2)RCR擴增；(3)產(chǎn)物檢測；(4)數(shù)據(jù)處理；c、數(shù)據(jù)分析，選擇種群差異性大的作為德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群。本發(fā)明步驟a中可量性狀包括體重、全長、體長、體高、頭長、頭高、尾柄長、尾柄高、吻長、眼徑和眼間距。步驟a中可數(shù)形狀包括左側(cè)線上鱗、左側(cè)線側(cè)鱗、左側(cè)線下鱗、右側(cè)線上鱗、右側(cè)線側(cè)鱗和右側(cè)線下鱗。本發(fā)明步驟b(2)中RCR擴增反應體系為25pL:水14jiL、10xPCRbuffer2.5pL、10mmol/L4xdNTPs2pL、2.0mmol/LMgCl21.5pL、lOpmol/pL上下游引物各lpL、T^DNA聚合酶1U和50ng/piLDNA模板lpL;RCR擴增引物為MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序歹U為GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列為GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、63.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列為CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游引物MFW2R的序列為GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反應條件為95'C預變性5min，94'C變性30s、60。C退火30s、72"C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW3中上游引物MFW3F的序列為GATCAGAAGGTACAGAGAAG,下游引物MFW3R的序列為CCTTACAGAAAACCTGTTTGC，PCR反應條件為95""C預變性5min，94°C變性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序列為TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列為GGGAAGCGTTGACAACAAGC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94。C變性30s、60.5。C退火30s、72X:延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW5中上游引物MFW5F的序列為GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列為AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG,PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、62.9退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列為TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列為ATCACCTGCACATGGCCACTC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、61.5退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72'C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序列為GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列為ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、58。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列為GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列為TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC,PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72*€延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序列為CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG,下游引物MFW14R的序列為GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反應條件為95°C預變性5min,94"C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列為GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列為TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG,PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列為CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列為GCACAAACTCCACATTGTGCC,PCR反應條件為95'C預變性5min，94"C變性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序列為CAGTGAGACGATTACCTTGG，下游引物MFW20R的序列為GTGAGCAGCCCACATTGAAC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94。C變性30s、56t:退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列為GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列為CTACACACACGCAGAGCCTTTC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;弓|物MFW29中上游引物MFW29F的序列為CTACACACACGCAGAGCCTTTC，下游引物MFW29R的序列為GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，'PCR反應條件為95°C預變性5min，94°C變性30s、61.6退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序列為GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列為CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min。本發(fā)明將形態(tài)標記與微衛(wèi)星分子標記相結(jié)合篩選德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群，種群伺遺傳差異性雙重驗證，篩選結(jié)果更準確。圖1是具體實施方式十中德國鏡鯉三個種群外部形態(tài)特征量度指標的Cluster聚類圖；圖2是具體實施方式十中引物MFW7的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果圖；圖3是具體實施方式十中引物MFW24的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果圖；圖4是具體實施方式十中德國鏡鯉三個種群遺傳指標的UPGMA法聚類結(jié)果圖。具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。具體實施方式一本實施方式德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群按以下步驟進行篩選a、形態(tài)標記對各種群隨機選出的德國鏡鯉的可量性狀和可數(shù)形狀進行標記；b、再進行微衛(wèi)星分子標記(l)DNA的提取與純化；(2)RCR擴增；(3)產(chǎn)物檢測；(4)數(shù)據(jù)處理；c、數(shù)據(jù)分析，選擇種群差異性大的作為德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟a中可量性狀包括體重、全長、體長、體高、頭長、頭高、尾柄長、尾柄高、吻長、眼徑和眼間距。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟a中可數(shù)形狀包括左側(cè)線上鱗、左側(cè)線側(cè)鱗、左側(cè)線下鱗、右側(cè)線上鱗、右側(cè)線側(cè)鱗和右側(cè)線下鱗。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟b(l)中采用酚/氯仿法提取鰭條基因組DNA，純化后定量至DNA濃度為50ng/nL。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一或四的不同點是步驟b(2)中RCR擴增反應體系為25mL:水14pL、10xPCRbuffer2.5pL、1Ommol/L4xdNTPs2pL、2.0mmol/LMgCl21.5pL、1Opmol/VL上下游引物各lpL、7Z^DNA聚合酶1U(2iliL)和50ng/VLDNA模板lpL;RCR擴增引物為MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序列為GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列為GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、63.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列為CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游引物MFW2R的序列為GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94'C變性30s、6(TC退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW3中上游引物MFW3F的序歹lj為GATCAGAAGGTACAGAGAAG，下游引物MFW3R的序列為CCTTACAGAAAACCTGTTTGC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序列為TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列為GGGAAGCGTTGACAACAAGC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、60.5。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW5中上游弓l物MFW5F的序列為GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列為AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、62.9退火30s、72'C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列為TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列為ATCACCTGCACATGGCCACTC,PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、61.5退火30s、72t:延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序列為GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列為ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反應條件為95""C預變性5min，94。C變性30s、58。C退火30s、72-C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列為GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列為TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、58.7退火30s、72'C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序列為CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG，下游引物MFW14R的序列為GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94。C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列為GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列為TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72X:延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列為CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列為GCACAAACTCCACATTGTGCC，PCR反應條件為95。C預變性5min,94。C變性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序列為CAGTGAGACGATTACCTTGG，下游引物MFW20R的序列為GTGAGCAGCCCACATTGAAC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94'C變性30s、56。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列為GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列為CTACACACACGCAGAGCCTTTC，PCR反應條件為95'C預變性5min，94。C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72"C延伸5min;引物MFW29中上游引物MFW29F的序歹lj為CTACACACACGCAGAGCCTTTC,下游引物MFW29R的序列為GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、61.6退火30s、72'C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序列為GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列為CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反應條件為95""C預變性5min，94°C變性30s、58.7退火30s、72'C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一或四相同。本實施方式從鯉魚29個微衛(wèi)星位點中選擇了15個表現(xiàn)多態(tài)性的微衛(wèi)星位占。乂、、、o具體實施方式六:本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟b(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，再甩Gel-proanalyzer4.5軟件分析電泳圖譜，并結(jié)合PCR產(chǎn)物長度及雙核苷酸重復確認片段大小并判定基因型。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟b(4)利用MicrosoftExcel2003、SPSS13.0統(tǒng)計軟件、PopGene(Version3.2)軟件和ezAuctionlmage4.0圖形處理軟體進行數(shù)據(jù)處理；再根據(jù)公式PIC=l-|^2g^2P,2p/和A^(l-Kt)/4Fst進行計算；其中尸/C為多態(tài)信息含量，尸i'頭第'不尊位基因的頻率，尸j為第j個等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)，^n為群體間每代遷移數(shù)，Kt為群體間遺傳分化指數(shù)。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式y(tǒng)、本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟C對步驟a得出的各形態(tài)標記間的比值進行分層聚類分析，并對步驟b計算出的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式九本實施方式與具體實施方式八的不同點是步驟C分層聚類分析中不同種群間距離的測量選用組間連接法。其它步驟及參數(shù)與實施方式八相同。具體實施方式十本實施方式德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群按以下步驟進行篩選a、形態(tài)標記對各種群隨機選出的德國鏡鯉的可量性狀和可數(shù)形狀進行標記，可量性狀為體重、全長、體長、體高、頭長、頭高、尾柄長、尾柄高、吻長、眼徑和眼間距，可數(shù)形狀為左側(cè)線上鱗、左側(cè)線側(cè)鱗、左側(cè)線下鱗、右側(cè)線上鱗、右側(cè)線側(cè)鱗和右側(cè)線下鱗；b、再進行微衛(wèi)星分子標記:(1)DNA的提取與純化采用酚/氯仿法提取鰭條基因組DNA，純化后定量'至DNA濃度為50ng/^iL;(2)RCR擴增RCR擴增反應體系為25jxL:水14pL、10xPCRbuffer2.5pL、10mmol/L4xdNTPs2nL、2.0mmol/LMgCl21.5pL、lOpmol/pL上下游引物各lpL、r"《DNA聚合酶1U(2|iiL)和50ng/nLDNA模板lpL;RCR擴增引物為MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序歹U為GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列為GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反應條件為95'C預變性5min，94°C變性30s、63.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列為CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游引物MFW2R的序列為GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反應條件為95"C預變性5min，94。C變性30s、6(TC退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW3中上游弓l物MFW3F的序列為GATCAGAAGGTACAGAGAAG，下游引物MFW3R的序列為CCTTACAGAAAACCTGTTTGC,PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72-C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序列為TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列為GGGAAGCGTTGACAACAAGC,PCR反應條件為95。C預變性5min，94"C變性30s、60.5。C退火30s、72"C延伸50s、30個循環(huán)，72T:延伸5min;引物MFW5中上游引物MFW5F的序列為GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列為AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG，PCR反應條件為95'C預變性5min，94。C變性30s、62.9退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列為TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列為ATCACCTGCACATGGCCACTC，PCR反應條件為95'C預變性5min，94°C變性30s、61.5退火30s、72X:延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序列為GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列為ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反應條件為95""C預變性5min，94。C變性30s、58。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列為GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列為TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、58.7退火30s、72'C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序歹lj為CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG，下游引物MFW14R的序列為GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94。C變性30s、60.1退火30s、72""C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列為GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列為TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、60.1退火30s、72"C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列為CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列為GCACAAACTCCACATTGTGCC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序列為CAGTGAGACGATTACCTTGG,下游引物MFW20R的序列為GTGAGCAGCCCACATTGAAC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94。C變性30s、56。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列為GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列為CTACACACACGCAGAGCCTTTC，PCR反應條件為95°C預變性5min，94。C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW29中上游引物MFW29F的序歹!j為CTACACACACGCAGAGCCTTTC，下游引物MFW29R的序列為GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、61.6退火30s、72X:延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序歹!j為GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列為CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min。(3)產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，再用Gel-proanalyzer4.5軟件分析電泳圖譜，并結(jié)合PCR產(chǎn)物長度及雙核苷酸重復確認片段大小并判定基因型；(4)數(shù)據(jù)處理步驟b(4)利用MicrosoftExcel2003、SPSS13.0統(tǒng)計軟件、PopGene(Version3.2)軟件和ezAuctionlmage4.0圖形處理軟體進行數(shù)據(jù)處理；再根據(jù)公式PICH-tifli力2PfP/和A^(1-Fst)/4&進行計算；其中尸/C/=1i=lj=i+l為多態(tài)信息含量，A為第i個等位基因的頻率，戶j為第j個等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)，A^為群體間每代遷移數(shù)，^t為群體間遺傳分化指數(shù)；c、數(shù)據(jù)分析對步驟a得出的各形態(tài)標記間的比值進行分層聚類分析，并對步驟b計算出的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；根據(jù)分析結(jié)果選擇種群差異性大的作為德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群。本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細胞和質(zhì)粒等均容易購得，若無注明則濃度為產(chǎn)品標注濃度。本實施方式中的操作步驟參見試劑或試劑盒使用操作手冊或說明。本實施方式選擇德國鏡鯉保種群體(BZ)、北林群體(BL)和松浦群體(SP)進行雜交優(yōu)勢種群篩選。德國鏡鯉保種群體(BZ)為黑龍江水產(chǎn)研究所保存德國鏡鯉選育系(F4)群體進一步選育得到的；北林群體(BL)為黑龍江省綏化清濤漁場生產(chǎn)繁育群體經(jīng)黑龍江水產(chǎn)研究所進一步選育得到的；松浦群體(SP)為黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實驗場生產(chǎn)群體，是在無選擇壓力下得到的。每個種群隨機采12尾。本實施方式從步驟a形態(tài)標記的9組可量性狀組成的比例變量(全長/體長、體長/體高、體長/頭長、體長/尾柄長、尾柄長/尾柄高、頭長/吻長、頭長/眼徑、頭長/眼間距、頭長/頭高)中得出頭長/頭高在三個種群中有差異；由步驟a形態(tài)標記的17組可量性狀和可數(shù)性狀結(jié)果中得出9組數(shù)據(jù)在三個種群中有差異。三個種群中有差異的指標如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注同一行右上角標有不同英文字母表示有差異顯著(p《0.05)(由a，b標注)；極顯著(p<0.01)(由c，d標注)。從表1中可知SP在全長、體高和頭長/頭高上與BZ和BL差異顯著；在鱗被上SP與BZ和BL差異極顯著;SP在頭長和頭長/頭高上與BZ差異顯著，與BL差異不顯著。說明SP與BZ和BL在外部形態(tài)上有顯著差異，其三個德國鏡鯉種群間的差異主要為鱗被和頭部形態(tài)。.對三個德國鏡鯉種群的量度指標進行分層聚類分析，分析中不同類之間距離的測量選用組間連接法。德國鏡鯉三個種群間歐氏距離比較結(jié)果如表2所示，德國鏡鯉三個種群間歐氏距離在3.22~6.28之間，其中最大的歐氏距離出現(xiàn)在SP與BL之間。并由此作出Cluster聚類圖(圖1)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本實施方式所選用的引物在德國鏡鯉群體基因組中表現(xiàn)多態(tài)性。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離PCR產(chǎn)物，均獲得了清晰的電泳圖譜。其中引物MFW7的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示，引物MFW24的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示。本實施方式15個微衛(wèi)星位點在3個德國鏡鯉種群中的等位基因數(shù)、遺傳雜合度和多態(tài)信息含量統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。從位點來看，最高尸/C為BL的MFW16位點(0.9009)，最低的SP的MFW30位點(0.2961);從種群來看3個鏡鯉種群在15個微衛(wèi)星位點上的平均尸/C為0.7181，其中BZ平均尸/C為0.7556，高度多態(tài)性位點占總位點的93.33%;BL平均戶/C為0.7964,高度多態(tài)性位點占總位點的93.33%;SP平均P/C為0.6023，高度多態(tài)性位點占總位點的73.33%。[表3中Mr為微衛(wèi)星基因座的等位基因數(shù)(Allelenumber)、//e為其月望雜合度(Expectedheterozygosity)]表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>德國鏡鯉的等位基因數(shù)在2至15之間，平均等位基因數(shù)在5.611.3,其中平均等位基因數(shù)最高的是BL(10.3)，其次是BZ(9.0)和SP(5.6)。本實施方式中3個德國鏡鯉種群的期望雜合度在0.2111至0.8874之間，平均期望雜合度值在0.37130.9111，其中平均期望雜合度最高的是BL(0.8146)，其次是BZ(0.7556)和SP(0.6638)。3個德國鏡鯉種群的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離進行分析結(jié)果見表4。3個德國鏡鯉種群中BL和SP間的遺傳相似性指數(shù)最小(0.5220)，遺傳距離值最大(0.6500)，說明這兩個群體間遺傳變異程度最高，親緣關(guān)系最遠；BZ與BL間遺傳相似性指數(shù)最大(0.7378)，遺傳距離值最小(0.3040)。UPGMA法聚類結(jié)果如圖4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本實施方式中的3個德國鏡鯉種群可分為2支，BZ和BL為一支，而SP為另一支。各位點上群體間的變異(Fst)為0.0324-0.0887，3個群體在15個位點的平均^為0.0813，表明有8.13%的變異是由群體分化導致的，而91.87%的變異來源于群體內(nèi)。群體間每代遷移數(shù)(Wm)均較高，均值為4.4674，以BZ與BL間最高(7.4660)。根據(jù)形態(tài)標記與微衛(wèi)星分子標記的分析結(jié)果，本實施方式選定德國鏡鯉保種群體(BZ)和松浦群體(SP)雜交優(yōu)勢種群。序列表〈110〉中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所〈120〉德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法<160〉30〈210〉1〈211>20〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉<223>引物MFW1中的上游引物MFW1F?！?00〉1gtccagactgtcatcaggag20〈210〉2<211>21〈212〉DNA〈213>人工序列<220>〈223〉引物MFW1中的下游引物MFW1R。<400>2gaggtgtacactgagtcacgc21〈210〉3<211>20<212>DNA<213>人工序列〈220><223>引物MFW2中的上游引物MFW2F?！?00〉3cacaccgggctactgcagag20〈210〉4〈211〉20<212>腿〈213〉人工序列〈223〉引物MFW2中的下游引物MFW2R?！?00〉4gtgcagtgcaggcagtttgc20〈210〉5〈211〉20<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物MFW3中的上游引物MFW3F。〈400〉5gatc3gaaggtacagagaag20<210〉6〈211〉21<212>腿<213〉人工序列〈220>〈223〉引物MFW3中的下游引物MFW3R。<400>6ccttacagaaaacctgtttgc21<210〉7<211>21<212>腿〈213〉人工序列<220>〈223>引物MFW4中的上游引物MFW4F。<400〉7tccaagtcagtttaatcaccg21<210>8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223〉引物MFW4中的下游引物MFW4R?！?00〉8gggaagcgttgacaacaagc20〈210〉9<211〉20<212>DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉引物MFW5中的上游引物MFW5F。<400>9g卿tgcctggggaagtcac20<210>10<211〉21<212>腿〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物MFW5中的下游引物MFW5R?！?00〉10aa卿gagcggggtaaaggag21<210〉11〈211>21<212>■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物MFW7中的上游引物MFW7F?！?00>11tactttgctcaggacggatgc21<210>12〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈220><223〉引物MFW7中的下游引物MFW7R?！?00〉12atcacctgcacatggccactc21<210>13〈211〉21〈212〉■〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物MFW9中的上游引物MFW9F?！?00>13gatctgcaagcatatctgtcg21〈210〉14〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>引物MFW9中的下游引物MFW9R?！?00>14atctgaacctgcagctcctc20<210〉15<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉引物MFWll中的上游引物MFWllF。<400〉15gcatttgccttgatggttgtg21<210>16〈211〉21<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉引物MFWll中的下游引物MFWllR。<400〉16tcgtctggtttagagtgctgc21<210〉17〈211〉22<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223>引物MFW14中的上游引物MFW14F。<400〉17cagsagcttctggasatctgag22<210〉18〈211>21〈212〉薩〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物MFW14中的下游引物MFW14R。<400〉18gcgagaagattgatggacaac21<210>19〈211〉21<212〉腿—<213>人工序列<220><223>引物MFW16中的上游引物MFW16F。<400>19gtccattgtgtcaagatagag21〈210〉20〈211〉21<212>DNA〈213>人工序列<220>〈223〉引物MFW16中的下游引物MFW16R?！?00〉20tcttcatttcaggctgcaaag21<210>21〈211〉20<212>■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物MFW19中的上游引物MFW19F?！?00〉21caatcctccatcatgcaaac20〈210>22〈211〉21<212〉■<213〉人工序列〈220〉<223>引物MFW19中的下游引物MFW19R?！?00〉22gcacaaactccacattgtgcc21〈210〉23〈211〉20<212>腿〈213〉人工序列<220>〈223〉引物MFW20中的上游引物MFW20F。<400>23cagtgagacg.attaccttgg20〈210〉24〈211〉20〈212>薩〈213〉人工序列〈220>〈223>引物MFW20中的下游引物MFW20R?！?00〉24gtgagcagcccacattgaac20〈210〉25〈211〉21〈212〉腿〈213>人工序列〈220〉〈223〉引物MFW24中的上游引物MFW24F?！?00〉25gctccagattgcacattatag21〈210〉26〈211〉22<212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉引物MFW24中的下游引物MFW24R?！?00〉26ctacacacacgcagagcctttc22〈210〉27〈211〉22〈212>DNA<213〉人工序列〈220〉〈223>引物MFW29中的上游引物MFW29F。<400〉27ctacacacacgcagagcctttc2<210〉28〈211>21<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物MFW29中的下游引物MFW29R?！?00〉28gaagctttgctctaatccacg21〈210>29<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>引物MFW30中的上游引物MFW30F?！?00〉29ggtcaacaagtagttgtgcag21〈210〉30<211>21〈212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>引物MFW30中的下游引物MFW30R?！?00〉30ccatctctgtcattgcaacag2權(quán)利要求1、德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群按以下步驟進行篩選a、形態(tài)標記對各種群隨機選出的德國鏡鯉的可量性狀和可數(shù)形狀進行標記；b、再進行微衛(wèi)星分子標記(1)DNA的提取與純化；(2)RCR擴增；(3)產(chǎn)物檢測；(4)數(shù)據(jù)處理；c、數(shù)據(jù)分析，選擇種群差異性大的作為德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟a中可量性狀包括體重、全長、體長、體高、頭長、頭高、尾柄長、尾柄高、吻長、眼徑和眼間距。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟a中可數(shù)形狀包括左側(cè)線上鱗、左側(cè)線側(cè)鱗、左側(cè)線下鱗、右側(cè)線上鱗、右側(cè)線側(cè)鱗和右側(cè)線下鱗。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟b(l)中釆用酚/氯仿法提取鰭條基因組DNA，純化后定量至DNA濃度為50ng/joL。5、根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟b(2)中RCR擴增反應體系為25^L:水14pL、10xPCRbuffer2.5^L、10mmol/L4xdNTPs2jiL、2.0mmol/LMgCl21.5jiL、10pmolL上下游引物各1pL、7b《DNA聚合酶1U和50ng/|aLDNA模板1|aL;RCR擴增弓I物為MFW1、MFW2、MFW3、MFW4、MFW5、MFW9、MFW7、MFWll、MFW14、MFW16、MFW19、MFW20MFW24、MFW29和MFW30;引物MFW1中上游引物MFW1F的序列為GTCCAGACTGTCATCAGGAG，下游引物MFW1R的序列為GAGGTGTACACTGAGTCACGC，PCR反應條件為95'C預變性5min，94°C變性30s、63.7退火30s、72'C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW2中上游引物MFW2F的序列為CACACCGGGCTACTGCAGAG,下游弓i物MFW2R的序歹U為GTGCAGTGCAGGCAGTTTGC，PCR反應條件為95'C預變性5min，94。C變性30s、6(TC退火30s、72"C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW3中上游引物MFW3F的序列為GATCAGAAGGTACAGAGAAG，下游引物MFW3R的序列為CCTTACAGAAAACCTGTTTGC,PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、53。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW4中上游引物MFW4F的序歹U為TCCAAGTCAGTTTAATCACCG,下游引物MFW4R的序列為GGGAAGCGTTGACAACAAGC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94i:變性30s、60.5。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW5中上游引物MFW5F的序列為GAGATGCCTGGGGAAGTCAC，下游引物MFW5R的序列為AAAGAGAGCGGGGTAAAGGAG,PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、62.9退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72"C延伸5min;引物MFW7中上游引物MFW7F的序列為TACTTTGCTCAGGACGGATGC，下游引物MFW7R的序列為ATCACCTGCACATGGCCACTC,PCR反應條件為95""C預變性5min，94°C變性30s、61.5退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，，72。C延伸5min;引物MFW9中上游引物MFW9F的序歹U為GATCTGCAAGCATATCTGTCG,下游引物MFW9R的序列為ATCTGAACCTGCAGCTCCTC，PCR反應條件為95'C預變性5min，94。C變性30s、58。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW11中上游引物MFW11F的序列為GCATTTGCCTTGATGGTTGTG，下游引物MFW11R的序列為TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC，PCR反應條件為95。C預變性5min,94。C變性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW14中上游引物MFW14F的序列為CAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG，下游引物MFW14R的序列為GCGAGAAGATTGATGGACAAC，PCR反應條件為95°C預變性5min,94。C變性30s、60.1退火30s、72t:延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW16中上游引物MFW16F的序列為GTCCATTGTGTCAAGATAGAG，下游引物MFW16R的序列為TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、60.1退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW19中上游引物MFW19F的序列為CAATCCTCCATCATGCAAAC,下游引物MFW19R的序列為GCACAAACTCCACATTGTGCC，PCR反應條件為95。C預變性5min，94。C變性30s、58.4。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW20中上游引物MFW20F的序歹U為CAGTGAGACGATTACCTTGG，下游引物MFW20R的序列為GTGAGCAGCCCACATTGAAC,PCR反應條件為95°C預變性5min，94'C變性30s、56。C退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72t:延伸5min;引物MFW24中上游引物MFW24F的序列為GCTCCAGATTGCACATTATAG，下游引物MFW24R的序列為CTACACACACGCAGAGCCTTTC,PCR反應條件為95。C預變性5min，94t:變性30s、60.1退火30s、72"C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW29中上游引物MFW29F的序列為CTACACACACGCAGAGCCTTTC，下游引物MFW29R的序列為GAAGCTTTGCTCTAATCCACG，PCR反應條件為95i:預變性5min，94°C變性30s、61.6退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min;引物MFW30中上游引物MFW30F的序歹U為GGTCAACAAGTAGTTGTGCAG，下游引物MFW30R的序列為CCATCTCTGTCATTGCAACAG，PCR反應條件為95。C預變性5min，94°C變性30s、58.7退火30s、72。C延伸50s、30個循環(huán)，72。C延伸5min。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟b(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用10。/。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，再用Gel-proanalyzer4.5軟件分析電泳圖譜，并結(jié)合PCR產(chǎn)物長度及雙核苷酸重復確認片段大小并判定基因型。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟b(4)利用MicrosoftExcel2003、SPSS13.0統(tǒng)計軟件、PopGene(Version3.2)軟件和ezAuctionlmage4.0圖形處理軟體進行數(shù)據(jù)處理；再根據(jù)公式PIC=l-|^2|i》2P,2p/和A^(lU/4&進行計算；其中尸/C為多態(tài)信息含量，A'i第'？羊，位基因的頻率，A為第j個等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)，A^m為群體間每代遷移數(shù)，^t為群體間遺傳分化指數(shù)。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟c對步驟a得出的各形態(tài)標記間的比值進行分層聚類分析，并對步驟b計算出的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，其特征在于步驟c分層聚類分析中不同種群間距離的測量選用組間連接法。全文摘要德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，它一種鯉魚雜交優(yōu)勢種群的篩選方法。本發(fā)明提供了一種行之有效的德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群的篩選方法，以確保其雜種的遺傳多樣性，從而可以減少工作量、縮短育種年限、降低育種成本和提高選育成功率。篩選方法a.形態(tài)標記；b.再進行微衛(wèi)星分子標記；c.數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明將形態(tài)標記與微衛(wèi)星分子標記相結(jié)合篩選德國鏡鯉雜交優(yōu)勢種群，種群間遺傳差異性雙重驗證，篩選結(jié)果更準確。文檔編號C12Q1/68GK101403006SQ200810209540公開日2009年4月8日申請日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者李池陶,石連玉,胡雪松,賈智英,趙海燕申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所