專利名稱：樹舌種菌株或子實體特異性分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬靈芝菌株鑒別領(lǐng)域，特別是涉及一種樹舌種菌株或子實體特異性分子標(biāo) 記及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在我國和日本民間樹舌作為藥物，主治急慢性肝炎、早期肝硬化、食管癌、肺癌、肝 癌、鼻咽癌、胰腺癌、胃癌、乳房癌。明顯改善睡眠質(zhì)量，曾強(qiáng)免疫力。對便秘，尿急， 尿頻，美容，排腸毒等均有很好效果。還可以治療風(fēng)濕性肺結(jié)核，有止痛、清熱、化積、 止血、化痰之功效。該菌子實體熱水提取物對小白鼠肉瘤180的抑制率為64.9%。作為一種 藥用真菌，它為人類治療疾病發(fā)揮著重要作用。
隨著對靈芝的生物學(xué)功效的不斷了解，以其為原料開發(fā)的產(chǎn)品越來越多，銷售量也越 來越大，靈芝原料的質(zhì)量越來越受到重視。近年來，隨著靈芝各種產(chǎn)品的商品化，大大帶 動了中國靈芝栽培生產(chǎn)的迅速發(fā)展，同時靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴(kuò)大，但是由于我國食 藥用菌品種登記制度尚未完善，因此靈芝的生產(chǎn)用菌種比較混亂，同種異名和異名同種的 現(xiàn)象在栽培生產(chǎn)上非常普遍，這不僅給菌種的管理帶來了難度，也給以靈芝為原料的保健 品及藥品等的相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)在因為菌種問題常常造成我國靈芝產(chǎn)品 質(zhì)量難以穩(wěn)定的局面，也嚴(yán)重地制約了我國靈芝產(chǎn)品走出國門，走向國際市場的步伐。
傳統(tǒng)的分類鑒定主要依據(jù)子實體的形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行，包括擔(dān)孢子的大小和子實體真 皮菌絲的形態(tài)特征，但是子實體的許多形態(tài)學(xué)特征往往隨著生長條件的不同而發(fā)生變化， 而且許多鑒別性特征經(jīng)常是幾個種所共有的，這給傳統(tǒng)的分類學(xué)帶來了很大的困難，僅僅 依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定不是很可靠。因此，尋找可靠的鑒定手段，對靈芝產(chǎn)業(yè)的進(jìn) 一步發(fā)展尤為重要。
近年來，國內(nèi)對栽培靈芝菌株的分類研究也越來越多，主要是集中在應(yīng)用拮抗實驗、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)分析及同工酶分析 技術(shù)方面。
張松等(1995)通過對4株靈芝菌株的酯酶同工酶酶譜的分析發(fā)現(xiàn)，供試的四個菌株 存在5條相同的酶帶，說明它們具有靈芝的某些共同的遺傳特征，在其代謝過程中具有某 些相似的生理活動，但各菌株在酶帶數(shù)目、Rf值及含量百分比上存在差異，均具有自己的 特征酶帶，同時發(fā)現(xiàn)子實體形態(tài)學(xué)特征相似的，酯酶同工酶酶譜也相似，親緣關(guān)系比較近， 這些說酯酶同工酶分析對于靈芝的分類鑒定有一定的價值。趙明文等(2003)利用RAPD技術(shù)對生產(chǎn)中常用的靈芝屬8個菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行了 分析。根據(jù)UPGMA構(gòu)建的樹狀圖將8個菌株在較低的相似水平上分成3個明顯不同的組: 第1鄉(xiāng)且包,舌黑芝(Gawotfenwa fl^""w) 、 ；fe、杉靈芝(Gawode/7Wflf "wgae)、 圓芝(Ga"ocferwa raft/wcfc^w附)、靈芝0770 (Gflfwoc/enwfl /wc/c/ww 0770)禾口韓國靈芝(Gawo(/er附fl /wc/c ww HG); 第2組包括密紋靈芝(Gawoc/er附a or6raWn'a加附)禾口紫靈芝(Gawo^fe/vwa s/wem"e); 第3 組為樹舌靈芝(Ga oAwzaa;^/" fltoM)。這一結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果基本相符，表明RAPD 技術(shù)可以用來區(qū)分生產(chǎn)中一些常用的靈芝種，同時說明靈芝生產(chǎn)用種之間遺傳差異較大， 可能是造成靈芝產(chǎn)品研究比較混亂的重要原因。
1999年我國簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種 知識產(chǎn)權(quán)，同時也要加強(qiáng)保護(hù)我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記 制度來真正保護(hù)我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定基礎(chǔ)。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(S叫uence Characterized Amplified Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點，本 發(fā)明建立了樹舌種的SCAR分子標(biāo)記，能對樹舌種進(jìn)行快速鑒定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種樹舌種菌株或子實體的特異性分子標(biāo)記及 其獲得方法與應(yīng)用，通過該分子標(biāo)記能簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定和檢測樹舌菌種。
本發(fā)明的樹舌種菌株或子實體的特異性分子標(biāo)記，是一種基因SCAR分子標(biāo)記， 是PCR擴(kuò)增后為471bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為 5'cgtgaaacgggctcgtttat 3'禾卩5'ggtcataaaagttgtctctgtaac 3'。
本發(fā)明的樹舌種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，包括如下步驟 I.菌株或子實體基因組DNA的提取
(1) 菌株基因組DNA的提取
將4-6'C的菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28'C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培 養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;
(2) 子實體基因組DNA的提取
將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000nLpH8.0CNETS溶液分裝于2ml離心管中，60-7(TC保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS;
II. 密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段的獲得、測序及序列比對 用ITS-PCR法，其中ITS引物對為ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，；
ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或 子實體ITS片段；然后測序并比對各個靈芝屬種的代表性的序列。
III. 特異性PCR引物的獲得
根據(jù)ITS序列的比對結(jié)果，找到密紋薄芝的ITS序列上特異性的結(jié)合位點(見下面序 列的紅色加粗部分)，利用Primer Premier5.0并設(shè)計出特異性PCR引物對為 5 'cgtgaaacgggctcgtttat 3鄰5 'ggtcataaaagttgtctctgtaac 3';
IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對密紋薄芝種菌株或子實體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增
V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5^L加樣緩沖液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠 上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min， 凝膠成像儀上照相。
所述步驟I (l)中所述的LETS提取法
① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；
② 向每個管中加入600-800pL的苯酚:氯仿異:戊醇(縮寫為PCI)(比例為25:24:1)上下 顛倒，充分混勻，4-10。C 16000g離心8-15分鐘;
③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500nL的PCI， 4'C 16000g離心8-15分鐘；
④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；
⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-20匸預(yù)冷的無水乙醇或95%乙醇，輕輕混勻， 置于-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；
⑥ 取出，4'C16000g離心10-15分鐘；
⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL預(yù)冷的70。/。 (V/V)乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4'C16000g離心10分鐘；
⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；(D倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑩將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括
① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml己配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；
② 向每個離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；
④ 取上清，加入600-80(^L 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600nL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15 min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-3(HiL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0y。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
所述步驟II中，ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25y 1): 10XPCR buffer (Promega) 2. 5ul, 25鵬ol/LMgC12(Promega) 2. 1， 10mmol/L dNTPs 0. 5 u L，引物ITS1F/ITS4(10 u mol/L) 各lul， Taq酶(5U/ul) (Promega) 0. 25ul， DNA模板(10 ng/u L) 1 u L，加無菌雙蒸 水補(bǔ)足，PCR反應(yīng)條件為94。C 2 min; 94°C 15s， 62"30s, 72°C 1 min， 28個循環(huán)； 72°C 5min，密紋薄芝種菌株或子實體ITS序列，大小為632bp，具體如下AGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATGA 。
所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5pL， 25mmol/L MgCl22.0pL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， lOpmol/L特異引物對各lpL， 5U/^iL Taq 酶0.3(VL， 10-20ng4iLDNA模板l|aL，無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL; PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán);72°C 5min。
所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8^L，與0.5pL加樣緩沖 液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電 泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
本發(fā)明的樹舌種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測樹舌種菌 株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?本發(fā)明的有益效果
(1) 只有樹舌菌種能PCR擴(kuò)增出分子量為471bpDNA的專一擴(kuò)增條帶，而靈芝屬的其 它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷；
(2) 采用這種特異性分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比， 具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，該檢測所需時間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗所 需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要5-6個月的時間。
圖1是ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
圖2是樹舌特異引物對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。
其中，生產(chǎn)用種(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62, 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 來自ATCC (24支)121-126， 128-145;
標(biāo)號中間有斷開的，這是因為在菌種保藏過程中失去活力了，但并未因此改變其他菌株的編號。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實施例1
菌種收集到來自國內(nèi)的140支靈芝屬生產(chǎn)用菌種以及來自ATCC 24支共計164支菌 株，它們分屬于赤芝、紫芝、樹舌、松杉靈芝、樹舌、密紋薄芝、紫光靈芝、近擬鹿角靈 芝、黃靈芝以及無柄靈芝等IO余個種。對它們的基因組DNA和樹舌117的子實體基因組 (編號l卯)DNA共計165個樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
一、 基因組DNA的提取
1. 菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取
將4-6'C保藏的菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28'C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;
2. 子實體基因組DNA的提取
① 將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾；
② 過濾后用滅過菌的雙蒸水沖洗，放在滅過菌的研缽中用液氮處理并進(jìn)行研磨；
③ 向每個離心管中加入600-800nL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min; 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次
⑤ 取上清，加入600-800nL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-3(VL的TE緩沖液(pH8.0),按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑨ DNA稀釋至10-20 ng/pL， .20。C保存。
二、 特異性PCR擴(kuò)增
擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCRbuffer 2.5pL， MgCl2 (25mmol/L ) 2.0^L， dNTP (10腿ol/L) 0.5nL， 10,1/L特異引物對(5'cgtcgtaaagcgagtctcttc 3'禾口 5'ggtcataaagttgtcccagac 3')各l(xL， Taq酶(5U4iL) 0.30nL， DNA模板(10-20ng/^L) ltiL，無菌雙蒸水補(bǔ)足25^L。 PCR反應(yīng)條件為94°C 2min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72。C 5min。
三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測
取特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5pL加樣緩沖液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，于l.OXTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色 5-10min，自來水沖洗后在凝膠成像儀上照相。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些樣品中只有樹舌種能擴(kuò)增出大小為471bp的專一擴(kuò)增條帶，而靈芝 屬的其它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷。
權(quán)利要求
1.一種樹舌種菌株或子實體的特異性分子標(biāo)記，其特征在于該標(biāo)記是一種基因SCAR分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為471bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為5′cgtgaaacgggctcgtttat 3′和5′ggtcataaaagttgtctctgtaac 3′。
2. 樹舌種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，包括步驟I.菌株或子實體基因組DNA的提取(1) 菌株基因組DNA的提取將4-6'C的菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28'C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培 養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;(2) 子實體基因組DNA的提取將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000pL pH 8.0 CNETS溶 液分裝于2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段的獲得、測序及序列比對 用ITS-PCR法，其中ITS引物對為ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，；ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或 子實體ITS片段；然后測序并比對各個靈芝屬種的代表性的序列。III. 特異性PCR引物的獲得根據(jù)ITS序列的比對結(jié)果，找到密紋薄芝的ITS序列上特異性的結(jié)合位點，利用Primer Premier5.0 并設(shè)計出特異性 PCR 引物對為 5'cgtgaaacgggctcgtttat 3'禾口 5'ggtcataaaagttgtctctgtaac 3';IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對密紋薄芝種菌株或子實體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特 征在于所述步驟I(1)中所述的LETS提取法① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；② 向每個管中加入600-80(HiL的苯酚:氯仿異:戊醇PCI比例為25:24:1上下顛倒，充分混勻，4-10°C 16000g離心8-15分鐘；③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500|aL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-2(TC預(yù)冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；⑥ 取出，4。C16000g離心10-15分鐘；⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL預(yù)冷的70% V/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4。C16000g離心IO分鐘；⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0Q/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特 征在于所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；② 向每個離心管中加入600-800)xL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次； ' 取上清，加入600-80(VL 1:1 V/V苯酚氯仿混合物混勻，12000陽14000g離心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-600nL49:l V/V氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70o/。V/V的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15 min;⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的樹舌種菌株或子實體的特異性分子標(biāo)記的獲得方法，其特 征在于所述步驟II中，ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25u 1: 10XPCRbufferPromega2. 5u 1， 25mmol/LMgC12 Promega 2. 1， 10酬ol/L dNTPs 0. 5u L，引物ITS1F/ITS4 10nmol/L 各1 ii 1 ， Taq酶5U/ u 1 Promega 0. 25 u 1 ， DNA模板10 ng/ y L 1 " L，加無菌雙蒸水補(bǔ)足，PCR反應(yīng)條件為94°C 2min;94。C 15s， 62。C30s， 72°C 1 min， 28個循環(huán)；72°C 5min， 密紋薄芝種菌株或子實體ITS序列，大小為632bp，具體如下AGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATGA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的樹舌種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在 于所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCRbuffer2.5nL， 25mmol/L MgCl22.0nL， 10mmol/LdNTP0.5pL， lOpmol/L特異引物對各lpL， 5U LTaq酶0.30pL， 10-20ng4iL DNA模板lpL，無菌雙蒸水補(bǔ)足25^L;PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min;94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán);72°C 5min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的樹舌種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于 所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8nL，與0.5tiL加樣緩沖液混 勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié) 束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
8. —種樹舌種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測樹舌種菌株及市售 靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br>
全文摘要
本發(fā)明涉及一種樹舌種菌株或子實體特異性分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，該標(biāo)記是PCR擴(kuò)增后為471bp的特異DNA片斷，5′cgtgaaacgggctcgtttat 3′和5′ggtcataaaagttgtctctgtaac 3′；獲得方法1)菌株或子實體基因組DNA的提取；2)獲得特異DNA片段；3)獲得特異PCR擴(kuò)增引物；4)用特異PCR擴(kuò)增引物對對樹舌種菌株或子實體的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測；應(yīng)用用于快速鑒定和檢測樹舌種菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)?。本發(fā)明的方法常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101514368SQ20081020455
公開日2009年8月26日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者娜 馮, 方 劉, 劉艷芳, 帥 周, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 焱 楊, 蘇春麗, 薇 賈, 郝瑞霞 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院