專利名稱：赤芝種菌株或子實體特異性分子標記及其獲得方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬靈芝菌株鑒別領(lǐng)域，特別是涉及一種赤芝種菌株或子實體特異性分子標 記及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載，靈芝有益心氣、養(yǎng)心生血、助心充脈、安神、 益脾益肺、強筋骨、利關(guān)節(jié)、治耳聾等功效。近代研究發(fā)現(xiàn)靈芝不但對人類三大死因的癌 癥、腦溢血和心臟病有療效，還對胃腸、肝臟、腎臟、白血病、神經(jīng)衰弱、慢性支氣管炎、 哮喘、過敏等疾病有顯著療效。此外靈芝還有強精、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、解毒、利尿、 凈血等多種作用和功效。近年來，國際藥學界發(fā)現(xiàn)靈芝所含有機鍺是人參的4-5倍，鍺被認 為是"長壽元素"，能促進血液循環(huán)，增強血紅蛋白攜氧能力，提高代謝功能、延緩衰老。 因此，靈芝被譽為"健康食品之冠"(虞和澍，1994)。
在日前結(jié)束的第十五屆世界藥理學大會上，大會主席、中國藥理學會理事長林志彬教 授介紹了他領(lǐng)導的研究小組，利用殺傷細胞(CIK)為研究手段，研究靈芝多糖與細胞因 子協(xié)同作用的最新進展。這也是他們自1971年以來，系統(tǒng)研究靈芝藥理作用機制的又一新 成果。從中可以看出，我國在靈芝現(xiàn)代研究領(lǐng)域，處于國際領(lǐng)先水平。靈芝是擔子菌綱多 孔菌科靈芝屬真菌，作為藥物已有悠久歷史。靈芝的抗腫瘤作用，特別是其抗腫瘤作用的 機制，是目前國內(nèi)外研究者矚目的課題。
靈藝(GamKferma /Mc!Wwn)是重要的藥用真菌，《中國藥典》2000年版記載赤芝 (G. /wc/^wz)和紫芝(G力"^eO可作為藥用；衛(wèi)生部發(fā)布可用于保健食品的真菌菌種 名單目錄中，公布了靈芝3個種，即赤芝(G. ^"WzwO 、紫芝(G. Ww"wJ和松杉靈芝 (G,加gae^ 。
隨著對靈芝的生物學功效的不斷了解，以其為原料開發(fā)的產(chǎn)品越來越多，銷售量也越 來越大，靈芝原料的質(zhì)量越來越受到重視。近年來，隨著靈芝各種產(chǎn)品的商品化，大大帶 動了中國靈芝栽培生產(chǎn)的迅速發(fā)展，同時靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴大，但是由于我國食 藥用菌品種登記制度尚未完善，因此靈芝的生產(chǎn)用菌種比較混亂，同種異名和異名同種的 現(xiàn)象在栽培生產(chǎn)上非常普遍，這不僅給菌種的管理帶來了難度，也給以靈芝為原料的保健 品及藥品等的相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失。現(xiàn)在因為菌種問題常常造成我國靈芝產(chǎn)品 質(zhì)量難以穩(wěn)定的局面，也嚴重地制約了我國靈芝產(chǎn)品走出國門，走向國際市場的步伐。傳統(tǒng)的分類鑒定主要依據(jù)子實體的形態(tài)學特征來進行，包括擔孢子的大小和子實體真 皮菌絲的形態(tài)特征，但是子實體的許多形態(tài)學特征往往隨著生長條件的不同而發(fā)生變化， 而且許多鑒別性特征經(jīng)常是幾個種所共有的，這給傳統(tǒng)的分類學帶來了很大的困難，僅僅 依據(jù)形態(tài)學特征進行菌種鑒定不是很可靠。因此，尋找可靠的鑒定手段，對靈芝產(chǎn)業(yè)的進 一步發(fā)展尤為重要。
近年來，國內(nèi)對栽培靈芝菌株的分類研究也越來越多，主要是集中在應(yīng)用拮抗實驗、 RAPD分析及同工酶分析技術(shù)方面。
張松等(1995)通過對4株靈芝菌株的酯酶同工酶酶譜的分析發(fā)現(xiàn)，供試的四個菌株 存在5條相同的酶帶，說明它們具有靈芝的某些共同的遺傳特征，在其代謝過程中具有某 些相似的生理活動，但各菌株在酶帶數(shù)目、Rf值及含量百分比上存在差異，均具有自己的 特征酶帶，同時發(fā)現(xiàn)子實體形態(tài)學特征相似的，酯酶同工酶酶譜也相似，親緣關(guān)系比較近， 這些說酯酶同工酶分析對于靈芝的分類鑒定有一定的價值。
1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種 知識產(chǎn)權(quán)，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記 制度來真正保護我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定 基礎(chǔ)。
隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標記和基因標記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡便、快速、準確的鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標記是一種十分穩(wěn)定的分子標記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點。但 目前尚未有對赤芝種的SCAR分子標記，以快速鑒定赤芝種。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供赤芝種菌株或子實體特異性分子標記及其獲 得方法與應(yīng)用，通過赤芝菌種的特異性分子標記對赤芝菌種進行簡便、快速、準確的鑒定 和檢測。
本發(fā)明的赤芝菌種或子實體的特異性分子標記，是一種基因SCAR分子標記，是PCR 擴增后為268bp的特異DNA片斷，其特異性PCR擴增引物對序列為5'cccacgctgtttcctt 3' 禾口5'cctcgcctcctcttctac 3'。
本發(fā)明的赤芝種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，包括下列步驟-I.菌株或子實體基因組DNA的提取 (1)菌株基因組DNA的提取將4-6'C保藏的赤芝菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28"C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯 葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA; (2)子實體基因組DNA的提取
將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混 合物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000nL pH 8.0 CNETS 溶液分裝于2ml離心管中，60-7(TC保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB (十六 烷基三甲基溴化銨)、1 mol/L NaCl、 10 m mol/L EDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V) SDS;
II. 赤芝種菌株或子實體特異DNA片段的獲得
用ISSR-PCR法，其中ISSR引物為5'GAAGAAGAAGAAGAAGAA3'，得到赤芝種 菌株或子實體特異DNA片段；
III. 特異性PCR引物的獲得
以上述得到的特異性DNA片段的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴增引物對的序列為 5'cccacgctgtttcctt 3'禾口 5'cctcgcctcctcttctac 3';
IV. 用特異PCR擴增引物對對赤芝種菌株或子實體的基因組DNA進行PCR擴增
V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測
上述PCR擴增產(chǎn)物6-8pL，與0.5pL加樣緩沖液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝 膠成像儀上照相。
所述步驟I (1)中，LETS法
① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；
② 向每個管中加入600-800nL的苯酚:氯仿異:戊醇(縮寫為PCI)(比例為25:24:1 )，充分 混勻，4-10。C 16000g離心8-15分鐘；
③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500nL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；
④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；
⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-20'C預(yù)冷的無水乙醇或95X乙醇，輕輕混勻， 置于-20'C冰箱中靜置5-10分鐘；
⑥ 取出，4。C16000g離心10-15分鐘；
⑦ 倒去上清，再向管中加入500nL預(yù)冷的7QQ/。 (V/V)乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶解，靜置一會兒，4'C16000g離心IO分鐘； @重復(fù)步驟 1次；
(D倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑩將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴增后再通過1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定其
質(zhì)量是否滿足試驗需要。
所述步驟I (2)中，酚/氯仿法，步驟包括
① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；
② 向每個離心管中加入600-800nL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；
④ 取上清，加入600-80(VL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600^iL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30(aL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2jaL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴增后再通過1.0M瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定其 質(zhì)量是否滿足試驗需要。
所述步驟II中，ISSR-PCR法擴增反應(yīng)體系(25^1): 10XPCRbuffer (Promega) 2.5pL， 25mmol/LMgC12 (Promega) 2.0pL， 10mmol/L dNTPs 0.5(iL，引物(20pmoI/L) 2pL， Taq 酶(5U/^iL) (Promega) 0.25pL， DNA模板(10-20ng/pL)2.0pL,加無菌雙蒸水補足25pl， PCR 反應(yīng)條件94°C 3min; 94°C lmin， 48°C lmin， 72°C lmin， 40個循環(huán);72°C 5min，赤芝 種菌株或子實體特異DNA片段，大小為980bp，其序列所述步驟III中，特異PCR擴增引物通過下列方法獲得以得到的特異的DNA序列為 基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴增引物對，引物對的序列如下5'cccacgctgtttcctt3'和 5'cctcgcctcctcttctac 3'。
所述步驟iv中，PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5hL， 25mmol/L MgCl22.0pL， 10mmol/LdNTP0.5pL， 1Opimol/L特異引物對各lpL， 5U4iLTaq酶0.30pL， 10-20ng4iL DNA模板lpL，加無菌雙蒸水補足25^1; PCR反應(yīng)條件為94。C 2 min; 94 。C 15s， 56°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72°C 5min。
本發(fā)明的赤芝種菌株或子實體的特異分子標記應(yīng)用于快速鑒定和檢測赤芝種菌 株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?本發(fā)明的有益效果-
(1) 只有赤芝種能PCR擴增出分子量為268bp的專一擴增條帶，而靈芝屬的其它菌種均 未出現(xiàn)該特異性片斷；
(2) 采用這種特異性分子標記進行檢測，與常規(guī)形態(tài)學檢測、桔抗試驗、出燕試驗相比， 具有檢測時間短，準確性高的優(yōu)點，該檢測所需時間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗所 需時間至少需要兩周時間，出燕試驗則需要5-6個月的時間。
圖1是ITS-PCR (實施例中只有PCR，請明確PCR類別)擴增產(chǎn)物電泳圖譜； 圖2是赤芝特異引物對PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。
其中，生產(chǎn)用種(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62， 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 來自ATCC (24支)121-126， 128-145;標號中間有斷開的，這是因為在菌種保藏過程中失去活力了，但并未因此改變其他菌株的 編號。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
實施例1
菌種收集到來自國內(nèi)的1 40支靈芝屬生產(chǎn)用菌種以及來自ATCC24支共計164支菌 株，它們分屬于赤芝、紫芝、樹舌、松杉靈芝、樹舌、密紋薄芝、紫光靈芝、近擬鹿角靈 芝、黃靈芝以及無柄靈芝等10余個種。對它們的基因組DNA和109號的子實體基因組(編 號190) DNA共計165個樣品進行PCR擴增。 一、基因組DNA的提取
1. 菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取
將4-6'C保藏的赤芝菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-2纊C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯 葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA; DNA 稀釋至10-20 ng4iL， -2(TC保存。
2. 子實體基因組DNA的提取
① 將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾；
② 過濾后用滅過菌的雙蒸水沖洗，放在滅過菌的研缽中用液氮處理并進行研磨；
③ 向每個離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min; 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次
(D取上清，加入600-800pL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600nL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑨ DNA稀釋至10-20 ng&L， -20°C保存。二、 特異性PCR擴增
擴增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5pL， MgCl2 (25mmol/L ) 2.0pL， dNTP ( 10 mmol/L ) 0.5pL ， 特異引物對 (5'-CCCACGCTGTTTCCTT-3，和 5'-CCTCGCCTCCTCTTCTAC墨3，) (1。nmol/L)各lpL， Taq酶(5U/^iL) 0.30pL， DNA模 板(10-20ng/" L) lnL，無菌雙蒸水補足25至^L。
PCR反應(yīng)條件為94。C 2 min; 94°C 15s， 56。C 30s， 72。C 1 min， 30個循環(huán)；72。C 5min。
三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測
取特異性PCR擴增產(chǎn)物6-8nL，與0.5pL加樣緩沖液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖 凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色 5-10min，自來水沖洗后在凝膠成像儀上照相。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些樣品中只有赤芝種能擴增出大小為268bp的專一擴增條帶，而靈芝 屬的其它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷。
權(quán)利要求
1.一種赤芝菌種或子實體的特異性分子標記，其特征在于該標記是一種基因SCAR分子標記，是PCR擴增后為268bp的特異DNA片斷，其特異性PCR擴增引物對序列為5′cccacgctgtttcctt 3′和5′cctcgcctcctcttctac 3′。
2. 赤芝種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，包括下列步驟I. 菌株或子實體基因組DNA的提取(1) 菌株基因組DNA的提取將4-6i:的赤芝菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28"培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA， DNA稀釋至 10-20ng/nL，保存?zhèn)溆茫?2) 子實體基因組DNA的提取將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na;f混合 物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1 OOOjiL pH 8.0 CNETS C 液分裝于2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是1% m/V CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 赤芝種菌株或子實體特異DNA片段的獲得用ISSR-PCR法，其中ISSR引物為5'GAAGAAGAAGAAGAAGAA3'，得到赤芝種 菌株或子實體特異DNA片段；III. 特異性PCR引物的獲得以上述得到的特異性DNA片段的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴增引物對的序列為 5'cccacgctgtttcctt 3'禾口 5'cctcgcctcctcttctac 3';IV. 用特異PCR擴增引物對對赤芝種菌株或子實體的基因組DNA進行PCR擴增V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的赤芝種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，其特 征在于所述步驟I(1)中所述的LETS提取法① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；② 向每個管中加入600-800nL的苯酚:氯仿異:戊醇PCI比例為25:24:1上下 顛倒，充分混勻，4-10。C 16000g離心8-15分鐘；③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500pL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-2(TC預(yù)冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-20。C冰箱中靜置5-10分鐘；⑥ 取出，4。C16000g離心10-15分鐘；⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL預(yù)冷的70y。V/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4'C16000g離心10分鐘；⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37'C溫浴1-2個小時；⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴增后再通過1.0n/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定其 質(zhì)量是否滿足試驗需要。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的赤芝種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，其特 征在于所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括① 將己經(jīng)預(yù)處理過得子實體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；② 向每個離心管中加入600-800(xL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次； 取上清，加入600-800pL 1:1 V/V苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-600pL 49:1 V/V氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70。/。V/V的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴增后再通過1.0。/o瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定其 質(zhì)量是否滿足試驗需要。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的赤芝種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，其特征 在于所述步驟II中，ISSR-PCR法擴增反應(yīng)體系25pl: 10XPCRbufferPromega2.5pL， 25匪ol/LMgC12 Promega2.0(iL， 10mmol/L dNTPs 0.5pL，引物20nmol/L 2pL， Taq酶5U/nL Promega0.25pL， DNA模板10-20ng爾L 2.0pL，加無菌雙蒸水補足25pl， PCR反應(yīng)條件94 。C 3min; 94°C lmin， 48°C lmin， 72°C lmin， 40個循環(huán)；72°C 5min，赤芝種菌株或子 實體特異DNA片段，大小為980bp，其序列
6. 如權(quán)利要求2所述的赤芝種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，其特征在于: 所述步驟III中，特異PCR擴增引物通過下列方法獲得以得到的特異的DNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴增引物對，引物對的序列如下5'cccacgctgtttcctt3'和 5'cctcgcctcctcttctac 3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的赤芝種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，其特征 在于所述步驟IV中，PCR擴增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5pL， 25mmoI/LMgCl22.(HiL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， 1Opmol/L特異引物對各1^L， 5U爾LTaq 酶0.30nL， 10-20ng4iLDNA模板lpL，加無菌雙蒸水補足25|iL; PCR反應(yīng)條件為94°C 2min; 94°C 15s， 56°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72°C 5min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的赤芝種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，其特征 在于所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴增產(chǎn)物6-^L，與0.5pL加樣緩 沖液混勻，于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，在1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳后，用 溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
9. 赤芝種菌株或子實體的特異分子標記應(yīng)用于快速鑒定和檢測赤芝種菌株及市售靈芝 類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br>
全文摘要
本發(fā)明涉及一種赤芝種菌株或子實體特異性分子標記及其獲得方法與應(yīng)用，該標記是PCR擴增后為268bp的特異DNA片斷，其特異性PCR擴增引物對序列為5′cccacgctgtttcctt 3′和5′cctcgcctcctcttctac 3′；獲得方法1)菌株或子實體基因組DNA的提?。?)獲得特異DNA片段；3)獲得特異PCR擴增引物；4)用特異PCR擴增引物對對赤芝種菌株或子實體的基因組DNA進行擴增；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測；應(yīng)用應(yīng)用于快速鑒定和檢測赤芝種菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)?。本發(fā)明的方法與常規(guī)形態(tài)學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101514365SQ20081020455
公開日2009年8月26日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者娜 馮, 方 劉, 劉艷芳, 帥 周, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 焱 楊, 薇 賈, 郝瑞霞 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院