專利名稱：牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該技術(shù)屬于水生動(dòng)物病害診斷與檢測的發(fā)明，特別涉及牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病(i^ra/fc/^/z;^" o/z'vaceiw viral nervous necrosis ， PONNV )的檢領(lǐng)'j方法。
背景技術(shù)：
魚類病毒性神經(jīng)壞死病是近年來嚴(yán)重危害海淡水魚類，引起世界范圍內(nèi)暴發(fā)性流行的重大傳染病之一。目前，已知包括魚S鱺目、鱈形目、鱸形目、鰈形目和飩形目在內(nèi)的40多種魚類受神經(jīng)壞死病毒感染，病毒可通過垂直和水平兩種途徑傳播。仔魚和稚魚易受感染，病死率達(dá)90%以上，甚至100%，給海水工廠化養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該傳染病被國際獸疫局(0正)列為重要的魚類病害(0正，2000)?？股丶盎瘜W(xué)藥物等均對該病作用很小，目前尚無有效的治療方法。該病于本世紀(jì)初傳入我國南方，主要感染魚類為石斑魚，此次牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病為我國北方地區(qū)屬首次發(fā)現(xiàn)。
目前，應(yīng)用于魚類神經(jīng)壞死病毒檢測的方法主要有分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法。
分子生物學(xué)方法包括RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及NASBA(nucleic acid sequencebased amplification)等技術(shù)。
應(yīng)用RT-PCR方法檢測編碼NNV病毒核衣殼蛋白的RNA2特異性片段，可以檢測到組織中極微量的病毒RNA，是目前應(yīng)用最多的診斷方法。最早應(yīng)用PCR方法檢測NNV的魚類是日本的黃帶擬鯪，根據(jù)SJNNV的RNA2設(shè)計(jì)的一對引物，可以特異性地?cái)U(kuò)增一段427bp的核酸片段。后來的實(shí)驗(yàn)證明該對引物可以用于檢測多種魚類的諾達(dá)病毒，擴(kuò)增片段長約420-430bp。但是運(yùn)用同一種檢測方法對不同魚類神經(jīng)壞死病毒進(jìn)行檢測，其檢測的靈敏度也存在著不小的差異，甚至?xí)霈F(xiàn)漏檢的情況
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近幾年才發(fā)展起來的一種核酸定量檢測技術(shù)，該技術(shù)通過引入l種熒光化學(xué)物質(zhì)，使PCR擴(kuò)增反應(yīng)中循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度等比例增加，通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。因其具有比普通PCR技術(shù)更加準(zhǔn)確、靈敏和快速的特點(diǎn)，而且可以實(shí)現(xiàn)定量分析，所以被廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物的傳染病診斷以及其它基礎(chǔ)科學(xué)研究。傳統(tǒng)方法如EB染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)能夠?qū)ζ鹗寄０暹M(jìn)行定量，比傳統(tǒng)方法具有更大的優(yōu)勢。目前比較成熟的熒光定量PCR技術(shù)有TaqMan探針、Amplisensor復(fù)合探針、分子信標(biāo)(Molecularbeacon)等技術(shù)，尤其以TaqMan探針技術(shù)使用最為廣泛。近兩年發(fā)生的SARS、禽流感的快速檢測就是基于TaqMan探針技術(shù)。此外該技術(shù)還被用于霍亂、炭疽等烈性傳染病的檢測等。但TaqMan探針技術(shù)在水生動(dòng)物病害的檢測中的應(yīng)用還未見報(bào)道。
NASBA(nucleic acid sequence based amplification)技術(shù)是另一種核酸實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增的方法，近年來開始應(yīng)用于人和動(dòng)物傳染病病原的檢測中。該技術(shù)基于特異性的引物和探針，以及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、HRNase和T7RNA聚合酶3種酶的協(xié)同作用。Starkey等將NASBA技術(shù)用于檢測魚類諾達(dá)病毒，證明實(shí)時(shí)NASBA技術(shù)比單管RT-PCR檢測靈敏度高100倍。該技術(shù)雖然靈敏、特異性強(qiáng)，但因?yàn)樾枰禺愋缘拿福瑱z測成本較高。
免疫學(xué)方法主要是利用抗NNV的單克隆抗體或多克隆抗體檢測病毒抗原，包括用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接熒光抗體(IFAT)以及免疫組織化學(xué)(IHC)等方法，可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測。Arimoto等用SJNNV病魚組織中分離純化的病毒作為抗原，制備了抗血清，建立了 ELISA檢測SJNNV方法，檢測靈敏度達(dá)到每孔5ng。但該技術(shù)的靈敏度還不能對潛伏期感染或帶毒魚的抗體進(jìn)行檢測。因?yàn)槊庖邔W(xué)方法都需要制備抗NNV的單克隆或多克隆抗體，由于病毒純化難度大，可用于NNV細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞株還不理想，目前用于魚類病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系大部分運(yùn)用于淡水魚類病毒。能用于魚類NNV培養(yǎng)的細(xì)胞系主要有SSN-1細(xì)胞株、E-11細(xì)胞系和SB細(xì)胞系等。但其特異性和穩(wěn)定性等方面還遠(yuǎn)不能滿足實(shí)驗(yàn)的需求。要制備NNV病毒的抗體有一定困難。而且ELISA的特異性常常因?yàn)楦鞣N原因不夠穩(wěn)定，因此，這些方法較少在實(shí)際檢測中應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在PONNV衣殼蛋白高度保守區(qū)設(shè)計(jì)1套nested RT-PCR引物，通過特異性、靈敏性實(shí)驗(yàn)建立了 nested RT-PCR反應(yīng)體系并對其進(jìn)行了優(yōu)化。提供了一種牙鲆(i>flm//c/"/y^0/Zra"HS)病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法。該方法操作簡單、快速靈敏、特異性好，可運(yùn)用于牙鲆養(yǎng)殖過程中的病毒跟蹤監(jiān)測和水質(zhì)監(jiān)測，具有很高的實(shí)用價(jià)值。上述nested RT-PCR引物序列如下表:
引物 Primers引物序列(5 '-3 ') Sequences of primers引物長度(bp) Primer sizes產(chǎn)物長度(bp) Product sizes
M2ATGGTGGGAAAGCAGAAC18
L2TAACCCAACAGCCCAAAG18886
M5TGGTCGGCTGATACTCCT18
CAACGCCATCTGTGAACG18398
本發(fā)明的牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法步驟如下
1、 取病魚眼和腦組織約lOOmg于1.5 ml離心管中，加入1ml Ttizol提取液，迅速放在冰盒中用玻璃勻漿器勻漿(大約lmin);
2、 超靜臺(tái)中加入200ul氯仿，充分混勻，室溫5min;
3、 4°C， 12000 r/min離心lOrain;
4、 取上層水相400ul于新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后放置5min;
5、 4。C， 12000 r/min離心10min，棄上清。
6、 加入700ul預(yù)冷的70%酒精輕輕吹打，°C， 12000 r/min離心lOmin，棄上清；
7、 重復(fù)上一個(gè)步驟一次，超靜臺(tái)通風(fēng)吹干；
8、 加20ul DEPC滅菌雙蒸水溶解，得到PCR模板；
9、 將10ul PCR模板置于PCR管中，先9(TC預(yù)熱變性5min，立即冰浴(放入冰盒中)，并加入5ul
5 X逆轉(zhuǎn)錄酶buffer、 0. lul M-mLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ul) 、 0. 25ul RNA酶抑制劑(40U/ul)、2. 5ul L2(40 mol)、 2ul dNTP、 5ul (25mM) MgCL2，于42。C孵育30min;
10、 混合物在99。C加熱lOrain，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，立即冰浴(放入冰盒中)；
11、 混合液中再加入3. 5ul M2(40urao1)、 lul R3(40umo1) 、 lul Tag酶、lul dNTP、 lOul10XPCRbuffer 、 5ul 25腿olMgCL2、 50ul滅菌雙蒸水，50ul甘油，混勻后置于PCR儀；
12、 PCR程序設(shè)定為72°C 10min， 94°C 2min ，然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72。C 60s，循環(huán)35次，最后72。C延伸，10min,4i:保存；
13、 將PCR產(chǎn)物5ul作為模板，加入4ullOXPCR buffer、 2ul MgCU、 0. 4ul dNTP、 2ulM2(40umo1)、 2ul R3(40umo1)、 0.4ul Tag酶、20ul滅菌雙蒸水，15ul甘油，混勻后置于PCR儀；
14、 PCR程序設(shè)定為94°C 2min，然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72°C 60s ，循環(huán)35次'最后72。C延伸，10rain,4'C保存； .
15、 用0.5X TBE電泳緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠(0. 16g瓊脂糖加0. 5 TBE電泳緩沖液16ml)，冷卻至60。C加入EB 2ul，混勻倒入膠室。lul loading與3ul樣品混合
5加入，Marker 3ul。 90V電壓電泳50min; 16、電泳后在紫外檢測儀上觀察結(jié)果，在398bp DNA位置出現(xiàn)亮帶者為PONNV陽性，說明 待側(cè)樣品含有病毒性神經(jīng)壞死病毒，否則為陰性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
利用牙鲆神經(jīng)壞死病毒的衣殼蛋白高度保守區(qū)設(shè)計(jì)1套nested RT-PCR引物，通過優(yōu) 化PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，建立起針對牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法，檢測靈敏度 達(dá)到了6.7fg，是普通RT-PCR檢測靈敏度的106倍，可更加有效地運(yùn)用于牙鲆各養(yǎng)殖時(shí)期的 病毒跟蹤監(jiān)測及水質(zhì)監(jiān)測，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
圖1是感染牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的牙鲆樣品的nested RT-PCR檢測結(jié)果，其中M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； l禾口T: PONNV陽性對照；2禾Q2': PONNV陰性對照；3禾卩3':檢測樣品。
具體實(shí)施例方式
本牙鲆(i flni//c/^/i，o/Zvace s)病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法步驟如下
1、 取魚眼和腦組織約lOOmg于1.5 ml離心管中，加入1ml Ttizol提取液，迅速放在 冰盒中用玻璃勻漿器勻槳(大約lmin);
2、 靜臺(tái)中加入200ul氯仿，充分混勻，室溫5min;
3、 4°C， 12000 r/min離心lOmin;
4、 取上層水相400ul于新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后放置5min;
5、 4°C， 12000 r/min離心10rain，棄上清。
6、 加入700ul預(yù)冷的70%酒精輕輕吹打，°C， 12000 r/min離心10min，棄上清；
7、 重復(fù)上一個(gè)步驟一次，超靜臺(tái)通風(fēng)吹干；
8、 加20ul DEPC滅菌雙蒸水溶解，得到PCR模板；
9、 將10ul PCR模板置于PCR管中，先90。C預(yù)熱變性5min，立即冰浴(放入冰盒中)， 并加入5ul 5X逆轉(zhuǎn)錄酶buffer、 0. lul MiLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ul) 、 0. 25ul RNA 酶抑制劑(40U/u1)、2. 5ul L2(40mol)、2ul dNTP、 5ul (25raM)MgCL2，于42。C孵育30min;
10、 混合物在99t:加熱10min，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，立即冰浴(放入冰盒中)；
11、 混合液中再加入3. 5ul M2(40umo1) 、 lulR3(40畫l) 、 lul Tag酶、lul dNTP、 lOul lOXPCRbuffer 、 5ul 25腿olMgCL2、 50ul滅菌雙蒸水，50ul甘油，混勻后置于PCR 儀；
12、 PCR程序設(shè)定為72°C 10min， 94°C 2min ,然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72°C 60 s ，循環(huán)30次，最后72。C延伸，10min,4。C保存；
13、 將PCR產(chǎn)物5ul作為模板，加入4ullOXPCR buffer、 2ul MgCL2、 0. 4ul dNTP、 2ulM2(40umo1)、 2ul R3(40umo1)、 0.4ul Tag酶、20ul滅菌雙蒸水，15ul甘油，混勻后 置于PCR儀；
14、 PCR程序設(shè)定為94°C 2min，然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72°C 60s，循環(huán)30次， 最后72'C延伸，10min,4。C保存;
15、 用0.5X TBE電泳緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠(0. 16g瓊脂糖加0. 5 TBE電泳緩沖 液16ml)，冷卻至6CTC加入EB 2ul，混勻倒入膠室。lul loading與3ul樣品混合 加入，Marker 3ul。 90V電壓電泳50min;
16、 電泳后在紫外檢測儀上觀察結(jié)果，在398bp DNA位置出瑰亮帶者為PONNV陽性，說明 待側(cè)樣品含有病毒性神經(jīng)壞死病毒，否則為陰性。
權(quán)利要求
1、一種牙鲆病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法步驟如下1)病魚眼和腦組織約100mg于1.5ml離心管中，加入1ml Ttizol提取液，迅速放在冰盒中用玻璃勻漿器勻漿，大約1min；2)靜臺(tái)中加入200ul氯仿，充分混勻，室溫5min；3)4℃，12000r/min離心10min；4)取上層水相400ul于新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后放置5min；5)4℃，12000r/min離心10min，棄上清。6)加入700ul預(yù)冷的70％酒精輕輕吹打，℃，12000r/min離心10min，棄上清；7)重復(fù)上一個(gè)步驟一次，超靜臺(tái)通風(fēng)吹干；8)加20ul DEPC滅菌雙蒸水溶解，得到PCR模板；9)將10ul PCR模板置于PCR管中，先90℃預(yù)熱變性5min，立即冰浴，放入冰盒中，并加入5ul m5×逆轉(zhuǎn)錄酶buffer、0.1ul M-mLV逆轉(zhuǎn)錄酶“200U/ul”、0.25ul RNA酶抑制劑“40U/ul”、2.5ul L2“40mol”、2ul dNTP、5ul“25mM”MgCL2，于42℃孵育30min；10)混合物在99℃加熱10min，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，立即冰浴，放入冰盒中；11)混合液中再加入3.5ul M2“40umol”、1ul R3“40umol”、1ul Tag酶、1ul dNTP、10ul 10×PCRbuffer、5ul 25mmolMgCL2、50ul滅菌雙蒸水，50ul甘油，混勻后置于PCR儀；12)PCR程序設(shè)定為72℃ 10min，94℃ 2min，然后94℃ 30s、61℃ 40s、72℃ 60s，循環(huán)35次，最后72℃延伸，10min，4℃保存；13)、將PCR產(chǎn)物5ul作為模板，加入4ul10×PCR buffer、2ul MgCL2、0.4ul dNTP、2ulM2“40umol”、2ul R3“40umol”、0.4ul Tag酶、20ul滅菌雙蒸水，15ul甘油，混勻后置于PCR儀；14)、PCR程序設(shè)定為94℃ 2min，然后94℃ 30s、61℃ 40s、72℃ 60s，循環(huán)35次，最后72℃延伸，10min，4℃保存；15)、用0. 5×TBE電泳緩沖液配制1％的瓊脂糖凝膠--0.16g瓊脂糖加0.5TBE電泳緩沖液16ml，冷卻至60℃加入EB 2ul，混勻倒入膠室。1ul loading與3ul樣品混合加入，Marker 3ul。90V電壓電泳50min；16)、電泳后在紫外檢測儀上觀察結(jié)果，在398bp DNA位置出現(xiàn)亮帶者為PONNV陽性，說明待側(cè)樣品含有病毒性神經(jīng)壞死病毒，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法。在PONNV衣殼蛋白高度保守區(qū)設(shè)計(jì)1套nested RT-PCR引物，通過特異性、靈敏性實(shí)驗(yàn)建立了nestedRT-PCR反應(yīng)體系并對其進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性神經(jīng)壞死病的檢測方法提供了一種該方法操作簡單、快速靈敏、特異性好，可運(yùn)用于牙鲆養(yǎng)殖過程中的病毒跟蹤監(jiān)測和水質(zhì)監(jiān)測，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號C12Q1/70GK101463394SQ20081015367
公開日2009年6月24日 申請日期2008年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者爽 劉, 孫金生, 毛海濤, 白東清 申請人:天津農(nóng)學(xué)院