耐高溫木糖苷酶XynB2和編碼該酶的基因與應用的制作方法

專利名稱：：耐高溫木糖苷酶XynB2和編碼該酶的基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種木糖苷酶，特別涉及在嗜熱脫氮芽孢桿菌(&o力aci77^t力e/m^e"itJ"i/Yc朋s)NG80-2中對木糖苷酶XynB2基因進行克隆表達、功能鑒定以及構建大腸桿菌高效表達的耐高溫木糖苷酶和編碼該酶的基因與應用。
背景技術：
：隨著當今社會的飛速發(fā)展，人口增長和資源消耗使得可再生資源的開發(fā)與利用成為國際社會和學術界共同關注的問題。木聚糖是半纖維素的主要組成成份，廣泛分布于高等植物的細胞壁中，是自然界中一種巨大的可再生生物資源，也是最容易提取、降解和利用的一類半纖維素。木聚糖酶和e-木糖苷酶是降解木聚糖最主要的酶。在能源工業(yè)中，工農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被木聚糖酶和木糖苷酶轉化為木糖，而木糖又可被細菌及真菌轉化成酒精等有價值的燃料；在造紙工業(yè)的紙漿漂白中，0-木糖苷酶與木聚糖酶協(xié)同作用可以有效提高漂白性能；在醫(yī)藥行業(yè)中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可產(chǎn)生在醫(yī)藥行業(yè)具有重要應用價值的中間轉化產(chǎn)物。因此對于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有廣泛而重要的用途。半纖維素是僅次于纖維素含量第二豐富的可利用自然資源，半纖維素中的木聚糖(xylan)根據(jù)來源不同，分枝程度不同，其主鏈和支鏈帶有多種不同的取代基團。由于木聚糖結構的復雜性，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成。其中的e-l，4-內切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。該酶以內切方式作用于木聚糖主鏈內部的6-1，4-木糖苷鍵，使木聚糖降解為短鏈的寡聚木聚糖，并有少量木糖生成；而D-木糖苷酶(e-xylosidase，EC.3.2,1.37.)則作用于短鏈的寡聚木聚糖，通過催化寡聚木聚糖的末端來釋放木糖殘基。e-木糖苷酶可與木聚糖酶協(xié)同作用，將木聚糖徹底分解，是木聚糖降解的關鍵酶之一。木糖苷酶在自然界中分布非常廣泛，現(xiàn)已從細菌、放線菌和真菌(包括酵母)等微生物和高等植物中分離得到。e-木糖苷酶是一種外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式從非還原性末端水解木二糖及木二糖以上的寡聚木聚糖，水解產(chǎn)物為木糖。木聚糖類半纖維素酶解時一般由木聚糖酶從主鏈內部先作用于長鏈木聚糖的糖苷鍵上，將木聚糖隨機切成不同鏈長的寡聚木聚糖，再由e-木糖苷酶作用于寡聚木聚糖的末端，將這些短鏈寡聚木聚糖降解成木糖。在木糖苷酶研究方面，涉及的嗜熱菌種有蒼白芽孢桿菌(GeWa"W^pa7h'^^)、硫磺礦硫化葉菌(SW/b7otosso7/"an'c"sP2)、嗜熱脂肪芽孢桿菌("eoZ^c//7^"ear。t力er鵬油7w50、嗜熱革節(jié)孢(5"c7taWy〃/Bt力ei7Z7。沐7"/z)、海棲熱袍菌(7"力eiTnoto卵/27arWi!7a)■、嗜熱芽孢桿菌(fecj77^Ast力er鵬"tarc"ciA9)、嗜鹽古細菌(〃a7or力aZ^iAS"a力e"w^)、黑曲霉(^s;ei^777〃s/J'ger90196)、高溫厭氧芽孢桿菌(r力e層纖ero力acteri"歷sp.strainJW/SLYS485)、聚多曲霉(麵er^7k5^t/cw/iMG49)、嗜熱厭氧桿菌(77erH7oa/aeroAacterj.iM75acc力aro7ytj-ctM7B6A—RI)、嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌(r力er邁o朋aero力a"ei"e^a/wh'cys)、極端嗜熱厭氧菌(Ca7t/oceJ7tMsacc力aro7y"c柳Tp8T6.3.3.1)。關于木糖苷酶基因最新的專利報道。如江正強等人報道了嗜熱擬青霉(尸aecj7咖ycest力e/7Z70//^7a)J18木糖苷酶及其基因(第200710063139.0號，申請日期2007.01.29);倫德特'亨德里克，德格拉夫等人報道了黑曲霉木糖苷酶及其基因(第96194959.7號，申請日期1996.06.24)。盡管關于木糖苷酶基因的專利報道有多篇，但從嗜熱脫氮芽孢桿菌中獲得熱穩(wěn)定性木糖苷酶及其編碼的基因尚未見文獻報道。本發(fā)明人首次公開了在嗜熱石油降解細菌中，采用嗜熱脫氮芽孢桿菌("eo力ac/77^t力e77Z70^/e77J'Z^j'/yca/w)NG80-2對木糖苷酶基因進行克隆表達、功能鑒定以及構建大腸桿菌高效表達工程菌株。通過氨基酸序列比對和分析，證明本發(fā)明的木糖苷酶XynB2基因編碼的蛋白與已知的嗜熱脂肪芽孢桿菌(feo6acj'L^sWearoMer邁o;/L^ws)T6中的編碼木糖苷酶的基因(GenBankaccessionno.ABI49956)相似性最高(氨基酸序列一致性為92%)，與其它已知的木糖苷酶相似性小于74%。該酶屬于GH52族。本發(fā)明木糖苷酶XynB2的氨基酸序列第2位是脯氨酸，第3位、270位、591位、604位是天冬酰胺，第18位、53位、65位、290位是絲氨酸，第50位、369位、406位、418位、647位是亮氨酸，第58位、191位、194位、233位、254位是纈氨酸，第62位是色氨酸，第95位、117位、385位、598位是谷氨酸，第97位、216位、601位是谷氨酰胺，第101位、243位、410位、527位、646位是組氨酸，第114位是苯丙氨酸，第130位、261位是蘇氨酸，第131位、200位、555位是天冬氨酸，第157位、455位、605位、688位是丙氨酸，第183位是半胱氨酸，第282位、452位、592位、687位是賴氨酸，第379位、539位是甘氨酸，第478位是異亮氨酸，第552位是酪氨酸，第608位是精氨酸，這與《eo力aw77^"ear"力e/wo/Az7^T6編碼的木糖苷酶的氨基酸序列不同(見圖11)，因此表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性。因此對這個XynB2基因進行了進一步功能鑒定，并與Geotecj'""sWearo"erM^力W"sT-6中的木糖苷酶活性進行了比較，實驗結果表明本發(fā)明的木糖苷酶XynB2是一種新型的酶，這種酶不但耐高溫，而且熱穩(wěn)定性優(yōu)良，從而完成了本發(fā)明的工作。
發(fā)明內容本發(fā)明一個目的是公開了一種耐高溫重組木糖苷酶XynB2。本發(fā)明另一目的是公開了編碼本發(fā)明木糖苷酶XynB2的基因。本發(fā)明再一目的是公開了表達木糖苷酶的重組質粒，其中至少包括上述的木糖苷酶XynB2的編碼基因。本發(fā)明還一目的是公開了一種導入了上述的木糖苷酶XynB2編碼基因，產(chǎn)生木糖苷酶的重組菌，例如含有重組質粒的重組菌株H1860。本發(fā)明的技術方案如下一種編碼木糖苷酶XynB2的基因，該基因具有選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的木糖苷酶核苷酸序列。應當指出的是，上述提到的術語"嚴格條件"在本說明書中的含義是指在該條件下形成了所謂特異雜交而沒有形成非特異的雜交。例如，該嚴格條件可以是，相互之間的同源性不小于70%的DNA之間可以雜交而低于上述數(shù)值的DNA之間不能雜交，優(yōu)選的是同源性不少于90%的DNA之間可以雜交。相對于Southern雜交中普通洗滌條件而言，可以例如為如下的雜交條件將雜交膜置于預雜交液(O.25mol/L磷酸鈉緩沖液，PH7.0，7%SDS)中，50'C預雜交30min;棄預雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，PH7.0，7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，5(TC雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(2XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜30rain。本發(fā)明進一步公開了一種木糖苷酶XynB2，該酶具有核苷酸序列編碼的氨基酸序列。或者最好具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或上述中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后、并且具有所述木糖苷酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明再進一步公開了一種重組表達質粒及重組菌，它含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因。所述的重組質粒的載體為pET-28a(+)，重組質粒為pLW1466。含有重組質粒的重組菌株H1860,這些均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增木糖苷酶XynB2中任意片段的引物對，也在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的較佳實施例中，上述木糖苷酶XynB2的底物為對硝基苯酚木糖苷；本發(fā)明的較佳實施例中，上述木糖苷酶的反應溫度為25'C-10(TC，優(yōu)選65'C。本發(fā)明的較佳實施例中，上述木糖苷酶反應pH值為3.0-11.0，優(yōu)選最適反應pH值為6.0。本發(fā)明提供的表達木糖苷酶的重組質粒為pLW1466，至少包括上述的木糖苷酶XynB2的編碼基因。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的重組質粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明的較佳實施例中，木糖苷酶的重組菌內導入了木糖苷酶XynB2的編碼基因。所述的重組菌為大腸桿菌。優(yōu)選為大腸桿菌BL21菌株。所屬
技術領域：
的技術人員應該知道，本發(fā)明編碼木糖苷酶的DNA序列，還包括編碼對SEQIDNO:1所示核苷酸序列所表達的酶分子的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失并仍具有該酶活性的蛋白質的核苷酸序列。另外，對本發(fā)明的木糖苷酶基因所表達的酶分子的氨基酸進行一個或多個氨基酸替換、插入或缺失所得到的蛋白質，也能達到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明還包括與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，優(yōu)選具有至少90%的同源性，但同時具有木糖苷酶活性的蛋白質。上面使用的術語"多個"可以是小于100的數(shù)目，優(yōu)選為小于10的數(shù)目。本發(fā)明所述的XynB2基因，它是以從嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離的木糖苷酶XynB2(GTNG—1775基因編碼)基因組DNA為模板，根據(jù)XynB2基因全序列，設計兩對引物，有效地擴增出了XynB2基因片段并進行拓撲、克隆和DNA序列測定，進一步實驗顯示木糖苷酶XynB2將寡聚木聚糖徹底降解為木糖(如圖l)。本發(fā)明提出的XynB2和己知的木糖苷酶相比，本發(fā)明提出的XynB2木糖苷酶屬于新型酶，不但耐高溫，而且熱穩(wěn)定性優(yōu)良。目前已公開發(fā)表的文章介紹木糖苷酶熱穩(wěn)定性較長的有嗜熱革節(jié)孢菌"cWah'力'鵬t力e/7Z7o;^i7iw)中的木糖苷酶在60'C中能保存1小時(Zanoelo,F.'F.,etal,Purificationandbiochemicalpropertiesofathermostablexylose-tolerantP-D-xylosidasefrom5"cyz^7yci(/"yz7t力er/ZK!p/a.7咖，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2004.31:170-176);極端嗜熱海棲熱袍菌(7yer歷oto^a/Z7ar^力肪)中的木糖苷酶在85'C中能保存2小時，95'C中能保存22分鐘(Xue，Y.，■etal，ExpressionandcharacterizationofathermostableP—xyiosidasefromthehyperthermophile,7力e/vz7oto卵yzar/^z'鵬，Biotechnol.Lett.2004.26:1511-1515);嗜熱芽孢桿菌(腸/77""力er扁t群"纖)中的木糖苷酶在60。C中倉g保存l小時(X柳a，L，etal,PurificationandcharacterizationofthermostablexylanaseandP-xylosidasebythethermophilicbacterium5ac/7Jwst力e擺/7tarc"譜'Res.Microbiol.2004May.155(4):283-9);聚多曲霉(爿印ei"w'77zAssyfl^r/j')MG49中的木糖苷酶在85'C中能保存18.5分鐘(Ghosh,M.,etal,Arejoindertothecommentaryon'Thermostabilityof后-xylosidasefromAs^er^777"ssyo^"iMG49'，F(xiàn)EBSLett.1993.330:275-278);極端嗜熱菌(r力er尕"o卵sp.)FJSS3-B.1中的木糖苷酶在98'C中的半衰期為7小時(RuUersmith,L.D.，etal,ThermostableP-glucosidaseandP-xylosidasefrom7^ermoto卵sp.strainFjSS3-B.1，Biochim.Biophys.Acta.1993.1156:167-72);嗜熱脂肪芽孢桿菌(feo力ac/77zAs"ear"力e^zo;力j7"s)21中的木糖苷酶在60。C中能保存l小時(Na咖ori,T.，etal,PurificationandpropertiesofthermostablexylarmseandP-xyiosidaseproducedbyanewlyisolatedfecj'7Jt/51stearof力ervzo/j力j7iAS1Strain,J.Bacteriol.1990.172:6669-6672)。本發(fā)明的木糖苷酶XynB2與現(xiàn)有技術相比的有益效果在于與已知的木糖苷酶相比該酶的熱穩(wěn)定性高，且在65'C下孵育100小時、75'C下孵育45小時、85'C下孵育2小時后仍具有50%左右的酶活性。本發(fā)明的木糖苷酶性能不同于已報道的木糖苷酶，該木糖苷酶XynB2具有在高溫下保持高活性的特征。木糖苷酶XynB2最適反應溫度為65"C;最適反應pH6.0。在偏酸性中熱穩(wěn)定性好。適合分解低聚木糖產(chǎn)生木糖。圖1是本發(fā)明的木糖苷酶降解寡聚木聚糖作用示意圖；圖2為本發(fā)明實施例中的木糖苷酶基因重組質粒的構建模式圖圖3表示本發(fā)明木糖苷酶SDS-PAGE電泳圖。圖4表示本發(fā)明木糖苷酶在不同溫度下的相對活力。圖5表示本發(fā)明木糖苷酶在不同pH值下的相對活力。圖6表示本發(fā)明木糖苷酶的在65'C下的熱穩(wěn)定性。圖7表示本發(fā)明木糖苷酶的在75t:下的熱穩(wěn)定性。圖8表示本發(fā)明木糖苷酶的在85X:下的熱穩(wěn)定性。圖9表示本發(fā)明木糖苷酶SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。圖10表示本發(fā)明木糖苷酶SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。圖11表示本發(fā)明木糖苷酶XynB2與6"eoZacj'77"sWearoMer歷op/y7iA9T6中的木糖苷酶氨基酸序列的比較。具體實施例方式為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明。下面的具體實施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。實施例一1.嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA的提取嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA的提取研究證明由嗜熱脫氮芽孢桿菌("eo力acj77"sWe/7Z7oote/7J'tn'/ycs/^)NG80-2基因組能夠分離出編碼醇脫氫酶的基因。因此，在本買施例中，采用從中國天津大港油田官69-8區(qū)塊油井地層水分離獲得的嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.1228，保藏日期為2004年10月09日，已申請國內發(fā)明專利并獲得授權，發(fā)明名稱嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應用，專利號ZL200410072759.7)，取其過夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)物3ml，離心收集菌體，菌體懸于250u150raMTris緩沖液中(pH8.0),加入10ul0.4MEDTA(pH8.0)，混勻后37。C保溫20min，之后加入30u120mg/ml溶菌酶，混勻后37。C再保溫20min,再加入5u120mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻后，再加入20yll(^SDS，50'C保溫至溶液澄清，分別用等體積酚氯仿:異戊醇抽提兩次，氯仿:異戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，回收DNA,用70%乙醇洗，沉淀溶于100P1TE緩沖液(pH8.0,10mMTris，lraMEDTA)，加入10mg/mlRNase2lU,65。C保溫30min,分別用酚氯仿異戊醇、氯仿:異戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50UlTE緩沖液。DNA溶液的紫外分光光度計測定結果為A260/A280=1.95,A260=0.73。2.木糖苷酶基因XynB2的克隆和篩選取嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2(CGMCCNo.1228)總DNA溶液0.1(約10ng)作為模板，以下列寡核苷酸序列作為引物，進行PCR擴增。反應混合物(50ul)如下ddH20，34ul;10XPCRBuffer,5ul;MgCl2Buffer,5ul;dNTPMix,2ul;上游引物，lul;下游引物，lul;NG80-2基因組DNA,lul;TaqDNApolymerase,lul。引物序列如下上游引物為SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，下游引物為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列設定的PCR循環(huán)參數(shù)如下95°C，5min;95°C，30s;50°C，45s;72°C,2min;72°C，10min;4°C，2hr。按上述設定的PCR循環(huán)參數(shù)進行25個循環(huán)PCR。上述PCR產(chǎn)物用￡coM和Z力ol雙酶切，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切產(chǎn)物片斷。與經(jīng)同樣限制型內切酶酶解并切膠回收的質粒pET-28a(+)連接，轉化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5a后，涂于含50iag/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37。C培養(yǎng)12小時，挑取單克隆轉接到20mlLB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(50ug/mlKan)，37'C培養(yǎng)12小時后，提取質粒鑒定，插入有SEQIDNO:1的DNA序列的pET-28a(+)質粒為重組質粒pLW1466(見圖2)，將重組質粒pLW1466轉入表達宿主大腸桿菌BL21(該菌株可向天津開發(fā)區(qū)厚普生物技術開發(fā)有限公司訂購，貨號為69387-3)中，得到含有該重組質粒的重組菌株為H1860,此重組質粒pLW1466可高頻轉化大腸桿菌BL21表達木糖苷酶活性和抗卡那霉素性能。其中的酶切及連接反應均參照表1。表l酶切體系及連接體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.XynB2DNA片段的測定采用Sanger法對此DNA片段進行了測序，測序結果顯示pLW1466中的插入片段含有長2118bp(SEQIDNO:1)的開放閱讀框架，編碼由705(SEQIDNO:2)個氨基酸組成的蛋白質。實施例二重組木糖苷酶的表達純化和特性將上述重組菌H1860單克隆接入20ml含50ug/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180卬ra培養(yǎng)12小時，然后將培養(yǎng)物按1%(v/v)接種量接入200ml含50pg/mlKan的LB培養(yǎng)基，37°C，220rpm培養(yǎng)至OD600為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.ImM,在37。C、180rpm誘導3小時。5000rpm離心5min收集菌體，懸于含50mMTris-HC1(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細胞，14000g離心20min，上清液為醇脫氫酶的粗提液。此上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶(見圖3)。利用已知的蛋白質化學標準方法測定此酶系的基本特性。用SDS-PAGE測得的重組酶的分子量分別為80kDa，與理論上推算的分子量(79876Da)相似；等電點沉淀法測得的重組酶的等電點pl為4.98。實施例三1.測定本發(fā)明木糖苷酶在不同溫度下的比活力對上述實施例二中制得的木糖苷酶進行最適反應溫度的測定，具體方法為配制木糖苷酶XynB2反應體系(100ul)為加入底物對硝基苯酚木糖苷至終濃度10mM，一定濃度的木糖苷酶XynB2，用50mMp朋.O的citrate-sodiumcitrate緩沖液補至100u1?；靹?，分別于25100。C水浴中反應20分鐘，反應結束后，加入400ul頂?shù)幕?003終止反應，然后在405nm處測定光吸收。以對硝基苯酚為標準曲線，計算每分鐘生成lUmol對硝基苯酚所需酶量，定義為l個酶活力單位。測定結果參見圖4。從該圖中可以看出，木糖苷酶的最適反應溫度約為65'C。2.測定本發(fā)明木糖苷酶在不同pH下的比活力對上述實施例二中制得的木糖苷酶進行最適反應pH值的測定，具體方法為配制木糖苷酶XynB2反應體系(100ul)為加入底物對硝基苯酚木糖苷至終濃度10mM，一定濃度的木糖苷酶XynB2，分別用50mMPH3_11.9的緩沖液(配方見表2)補至100u1?；靹?，在65。C水浴中反應20分鐘，反應結束后，加入400ul1M的Na2C03終止反應，然后在405nm處測定光吸收。以對硝基苯酚為標準曲線，計算每分鐘生成1Umol對硝基苯酚所需酶量，定義為l個酶活力單位。測定結果參見圖5，從該圖中可以看出，木糖苷酶的pH值為3.0-11.0,優(yōu)選最適反應pH值為6.0。表2木糖苷酶活測定中所用的緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.測定本發(fā)明木糖苷酶的熱穩(wěn)定性對上述實施例二中制得的木糖苷酶進行熱穩(wěn)定性的測定，具體方法為將一定濃度的木糖苷酶XyriB2放入65、75和85'C水浴中溫浴，每隔一小時取出一部分酶做酶活反應。配制木糖苷酶XynB2反應體系(lOOu1)為加入底物對硝基苯酚木糖苷至終濃度lOraM，一定濃度的木糖苷酶XynB2，用50mMpH6.0的citrate-sodiumcitrate緩沖液補至100"1?；靹颍?(TC水浴中反應20分鐘，反應結束后，加入400ul1M的Na2C03終止反應，然后在405mn處測定光吸收。以對硝基苯酚為標準曲線，計算每分鐘生成lumol對硝基苯酚所需酶量，定義為l個酶活力單位。測定結果參見圖6、7、8。從圖中可以看出，木糖苷酶XynB2在65'C下孵育IOO小時、75'C下孵育45小時、85'C下孵育2小時仍保持約50%的酶活性。實施例四1.將本發(fā)明木糖苷酶XynB2的氨基酸序列與6"eo力aw'77zAs"ear"力eryz7c^力j7iAST6木糖苷酶的氨基酸序列進行比對，比對結果參見圖U。2.本發(fā)明木糖苷酶XynB2與feo&ci""sWear"力er歷o//u7fAST6中的木糖苷酶各項酶學參數(shù)均有不同，詳見表3。表3XynB2與feo/7aw77i/sWear"力e/7Bop/j7iA9T6中的木糖苷酶酶學參數(shù)的比較最適反應溫度rc)最適反應pH熱穩(wěn)定性比活力(U/mg)NG80-2T665656.05.6-6.35'C孵育100小時、75'C孵育45小時、未鑒定85'C孵育2小時后仍有5(m的酶活性6675.3從圖11和表3可以看出，由于氨基酸的變化，NG80-2中的木糖苷酶XynB2具有比《e(^sci77"sWear"力ezwo/7力2'7"sT6中的木糖苷酶活性更高，更具熱穩(wěn)定性。雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術領域：
的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍所做的更動與改進，都將落入本發(fā)明的保護范圍。序列表<110>南開大學<120>耐高溫木糖苷酶XynB2和編碼該酶的基因與應用<160>4<210>1<211>2118<212>DNA<213>嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geo6fld//Msrte/v/w/em'f/7yaww)NG80-2<220><221>gene<222>(1)"(2U8)<400>1atgccaaacastctattttttaacgcccaccattcaccggttggagcgttttccagcttc60acattagggtttccgggaaaaagcgggggattggatctcgaactcgcccgtccaccgcgg120caaaacgtatttattggcgtagaatcgttacatgaatcgggattatatcacgttctacca180ttttgggagacatcgggagaagatgaaagtaaacggtatgacattgaaaatcccgacccg240aatccgcaaaaaccgaac這ttttaatcccgtttgccaaagaggagattcaacgcgaattt300catgtggcaacagstsicatggaaggctggagatttaacgtttacgatttattctcctgta360aaagcggtgccagatccggsaaccacggacgaggaagaactc站gctggcgttggttcca420gctgtaatcgttgagatgacgattgataatcgagagcacggcgggcgttt480ttcgggttcgaaggcaccgatccgtatacttcgatgcggcgaatcgatgagacatgcccg540caactgtgcggagttgggcaagggcgaattgttggcatcgtttccaaagacgaggatgtt600cgctccgcgttgcattttagcatggaagatattttaacggcgcagctcgaagaaaattgg660acgttcgggcttggaaaagtcggtgcgttaattgtcgatgttccggcgggtgaaaagaaa7203cgc3tcsgtttgctgtttgtttttatcgtggcggttacgtgacagcgggaatggatact780tcttstttctatactcgtttctttsaitaatattgaggaagtcggcctttatgcgttagag840aaggcagaagtgctgaaggagcaatcgtttcgttcgaacgaactcattgaaaaagaatgg900ctctccgatgatcaaaagtttatgatggcgcatgccattcgcagttattacggcaataca960cagctgcttgagcatgaaggaaagccgatttgggttgtcaacg站ggcgagtaccgcatg1020atgaatacgtttgatttgaccgtcgaccaactgttttttgagttgaagatgaatccatgg1080acggtgaaaaatgtccttgacttatatgtcgaacgctatagttacgaggatggtgttcgt1140tttccgggagaagagacagaatatccgggtggcatcagttttactcatgacatgggagta1200gcgastacgttcttgcgcccgcaccactcgtcatacgagctatatggccttagcggttgc1260ttctcgcatatgacgcacgaacagctcgtcaactgggtgctttgcgctgcggtgtacatt1320aagactgggcatggcgcgacaagcggcttgccatcttagaacagtgtcta1380gaaagcatggttcgccgcgatcatcccgaitccggaaaaacggaatggcattatgggattg1440gatagtactcgcacgatgggcggagcggaaattacgacgtatgacagtttggacgtttcc1500ctcggccaagcccgcaeLcaLdLtttststttagcaggtaaatgttgggcagcctatgtagcg1560cttgag站attattccatgatgtcggcaaggaagaattggccgcgctggcgggagagcag1620gcagaaaaatgtgcggcgacaatcgtcagctatgtgactgatgatgggtacatcccggct168014gtcatgggagaaggaaacgactcc333atcatcccagctatcgaggggcttgtgttccct1740tatttcactaattgtcatgaggcgttaaacaaagacggccgcttcggaga1800gccttgaacgctcatttgcgttatgtgcttcgggaaggaatttgtttgttcccggatgga1860ggatggaagatttcctc站cgagcaacaactcgtggctgagcaaaatttacttatgccag1920tttatcgcccgccatctgttsggttgggsgtgggacgaacaaggcaaacgggccgatgct1980gcccatgttgcatggcttactcatcc站cgctttcgatttggagttggagtgaccaaatc2040atcgctggtgaaiattaaagccagcaaatattatccgcgcggcgtgacaagcattttatgg2100cttgaggagggggaatga2118<210><211><212><213><220><221><222><400>2705bpPRT嗜熱脫氮芽孢桿菌("eoZaw77"st力e7mK/e/n'ZLrz'/yc朋s)NG80-2CHAIN(1)..(705)2MetProAsnAsnLeu15PheSerSerPheThr20LeuGlulieuAlaArg35SerLeuHisGluSer50SerGly65AsnProGinArgThrPhe115ThrAspGlu130GluMet145PheGlyGluAspGlu70GinLysPro85GluPheHis100ThrlieTyrPheLeuProGly55SerAsnValSei:SerSer30PheThrPheGluThrCysGluGlulieAsp40lieuLyslieAlaPi:o120LysProGluAlaProVsl15GlyGlylieGlyPheTrpAsnPro80LysGlu95AlaGly110ProAspPi;oLeu135AsnThrlieVal195GluAsplie210GlyLysVal225ThrHisGinGlyMetAsp150GluGlyThrAsp165ProGinLeuCys180SerLysAspGluAsp200LeuThrAlaGin215GlyAlaLeulie230PheAlaValCys245ThrSerTyrPhe260PheAsnAlaHisHis10GlyPheProGlyLys25ProArgGinAsnVal45TyrHisValLeu60ArgTyrAsplie75LeulieProPhe90ThrAspThrTrp105ValLysAlaVal125LeuAlaLeuValProAlaVal140AsnGlyThrArgAlaArgArg155160ProTyxThrSerMetArgArg170175GlyValGlyGinGlyArglie185190ValArgSerAlaLeuHisPhe205LeuGluGluAsnTrpThrPhe220ValAspValProAlaGlyGlu235240PheTyrArgGlyGlyTyrVal250255TyrThrArgPhePheAsnAsn265270GlyLeuValGluAspGluAspGlulieAlalieValSei:GlyIiysThrlieAlaAspGluThrProlielieuThrValPheAspGlyMetLeuIiysAlaGluGluValGlyLeuTyrAlaLeu275280SerPheArgSerAsnGluLeu290295GinLysPheMetMetAlaHis305310GinlieuI>euGluHisGluGly325GluTyrArgMetMetAsnThr340PheGluLeuLysMetAsnPro360ArgTyrSerTyr375TyrProGlyGly390PheLeuArgPro405CysPheSerHis420CysAlaAlaValTyr440ArgLeuAlalie455HisProAspPro470ArgThrMetGly485SerlieuGlyGinGluLysAlaGluValLeu285lieGluLysGluTrplieu300AlalieArgSerTyrTyr315LysProlieTrp330PheAsp345TrpThrLeuThrValLysValVal335ValAsp350AsnVal355TyrValGlu370GluThr385AlaAsnlieuSerGluThrGly365GluAspGlyValArgPhe380PheThrHisAspValLeu435ArgAspLys450ArgArgAsp465AspSerThrlieSer395HisHisSer410MetThrHis425lieGluGinSerTyrGlu415GluGinLeu430ThrLysAsp445CysLeuGluLeuAspVal500LysCysTrpAla515GlyLysGluGluAlaTyrVal520LeuAlaAla530535AlaAlaThrlieValSerTyr545550ValMetGlyGluGlyAsnAsp565LeuValPheProTyrPheThr580GlyArgPheGlyGluTyrlie595600ValLeuArgGluGlylieCys610615SerSerThrSerAsnAsnSer625630PhelieAlaArgHisLeuLeu645ArgAlaAspAlaAlaHisVal660lieTrpSerTrpSerAspGin"5680LysTyrTyrProArgGlyVal690695Glu705LeuGluGin460GluLysArgAsnGlylie475GlyAlaGlulieThrThr490495AlaArgAsnAsnLeuTyr505510AlaLeuGluLysLeuPhe525LeuAlaGlyGluGinAla540ValThrAspAspGlyTyx555SerLyslielie570AsnCys585GinAlaLeuPheTrpLeuHisGluLsuAsnProAla575Alalieu590AlaHis605ProAspGlyGly620SerLyslieTyr635GlyTrpGlu650AlaTrpI*eu665lielieAlaThrSerlieTrpAspGlu655ThrHisPx:o670GlyGlulie685LeuTrpLeuLysSerGly320AsnGinLeuProMet400I>euValTrpSerMet480TyrLeuHisGlulie560lieAsnLeuTrpLeu640GinThr!LysGluGluAspAsnGlulieuAspGlyGlyTyrAsnAlaMetGlyAspAlaAspLysProGluLysArgLysCysGlyLeuAlaGluGinAspThrGlyPheLeuGluValGlyTrpTrpValLeuSerGlyValCysAlaGlyAspTyrlieGinLysSerSei:Gly700<210>3<211>32bp<212>DNA<213>人工序列<400>3acgagaattcatgccasacaatctatttttta32<210>4<211>32bp<212>DNA<213>人工序列<400>4tgcactcgagtcattccccctcctcaagccat3權利要求1、一種編碼木糖苷酶XynB2的基因，該基因具有選自下組的核苷酸序列a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO1但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在嚴格雜交條件下與所述的a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的木糖苷酶核苷酸序列。2、一種木糖苷酶XynB2，它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；3、一種重組表達質粒，它含有權利要求l所述的木糖苷酶XynB2編碼基因。4、權利要求3所述的重組表達質粒，所述的重組質粒的載體為pET-28a(+)。5、權利要求l所述的木糖苷酶XynB2編碼基因，其特征在于所述的木糖苷酶于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到。6、權利要求l所述的木糖苷酶XynB2編碼基因，其特征在于所述的木糖苷酶的底物為對硝基苯酚木糖苷；最適反應溫度均為65'C。7、權利要求1所述的木糖苷酶XynB2編碼基因，其特征在于所述的木糖苷酶pH值為6.08、一種產(chǎn)生木糖苷酶的重組菌，其特征在于它含有權利要求1所述的木糖苷酶XynB2編碼基因。9、權利要求8所述木糖苷酶XynB2的重組菌，其特征在于所述的重組菌為大腸桿菌BL21菌株。全文摘要本發(fā)明公開了由嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因組DNA借助PCR擴增而得到的木糖苷酶XynB2構建表達載體在大腸桿菌中表達出該基因編碼的重組木糖苷酶。該酶的最適反應溫度為65℃，最適反應pH為6.0，在偏酸性環(huán)境中熱穩(wěn)定性好。適合分解寡聚木聚糖產(chǎn)生木糖。文檔編號C12N9/42GK101429518SQ200810153079公開日2009年5月13日申請日期2008年11月14日優(yōu)先權日2008年11月14日發(fā)明者露馮,劉雪倩,磊王申請人:南開大學