專利名稱：銅綠假單胞菌蹭行運動相關基因pa0171及應用的制作方法
第l/9頁
銅綠假單胞菌蹭ffit動相關基因賴W7/鵬用
fe^領域本發(fā)明屬于微生物生t/^術領域，特別涉及一種銅綠假單胞菌蹭fi^動相關基因， 即IV型菌秘動相關基因層77。
背景^銅綠假單胞菌(/^"ab^朋s朋r收//70^)屬假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，它是一
種分布廣泛的剝4 菌，在臨床上它能引起菌血病、耳、眼、^!^:軟組織、骨及關節(jié)、心內 膜和呼吸系統(tǒng)等的感染,是人類的三大致病菌之一'是引越市炎的首要致病菌。由于其具有形成生 物鵬等多重耐藥機制，耐藥率高,常在臨床上引起頑固性、難治性感染,成為臨床治療的棘手問 題。
細菌生物MJ1或稱為菌膜，是細菌為適應不利的自然環(huán)境、維持自身生命而發(fā)生的,學變 化，形成一種有利于生存的棘的生命5嫁。當生物體內的細菌處于生長發(fā)育不利的環(huán)境時，菌 體周邊會分泌多糖復合物，使細菌相互粘連，附著于隋性物體如生物醫(yī)^t才料^f占膜表面并將其 自身包繞在其中而形成的J^t物，使細菌可以停留在一^S宜的微環(huán)境中而不會被沖散。生物被 膜的這種特殊結構可以作為一種屏障保護細菌抵御抗菌藥物的殺傷和^m宿主免疫系統(tǒng)的清除， 而成為潛在的感染源，導致難治性臨床生物M的相關感染。IV型菌毛介導的蹭動(twitching motility)參與了生tfW的早期形成。
對生物 形^^幾制的研究，國內尚未見相關報道。由于生物MJ1有非常錢的臨床意義， 就幾年，已弓胞國夕卜些科學家的重視，使他們涉;Sitb領鵬行研究。但其形淑幾制仍有許多 未知領域樂娥索。目前已知，生辦鵬的形成^t分為三步個體細胞的吸附；微M:的形成； 及成BW的發(fā)育。劍門對銅綠假單胞菌生#1 形細關基因尸^/77的研究可以i辯卜國內這一
領域的空白，并完善銅綠假單胞菌生tfMW成的禾腿。
發(fā)明內容l本發(fā)明目的是鵬銅綠假單胞菌生物凈鵬形淑目關基因、即IV型菌秘動相縫 因并用該基因為新藥耙點研偉 糊綠假單胞菌的新型藥物。
本發(fā)明鄉(xiāng)的銅綠假單胞菌IV型菌秘動相關基因層7人具有如序列親示核苷,列，
其基因長度為543bp。
上述的銅^fg單胞菌IV型菌秘動相關基因賴W7/可以用于以該基因為新藥耙點設計并制 Mt菌藥物；以及在食品衛(wèi)生和耐藥防^方面的自。
本發(fā)明基因的獲得方法^f頓A!Mu轉座技術(一種基于噬菌體Mu轉座子的轉座技術)， 誠銅綠假單胞菌基因突變，M:突變子文庫。篩遨曾動能力喪失的突變子，〗頓5^HI酶切基 因組DN入酶切片段與pUC18載體連接，fflil電轉化將連接，導入^^桿菌DH5ct，用卡那霉素 和氨節(jié)青霉素雙抗LB平板篩選陽性轉化子，測定轉化子中插入片段的核苷,列，發(fā)現(xiàn)Mu插入 的基因，確定此基因與銅綠假單胞菌IV型菌^S動有相關性。
本發(fā)明的有^^:
實驗發(fā)現(xiàn)本發(fā)明基因的缺失倉辦使IV型菌毛介導的蹭動能力喪失。
Mu插入失活基因使細菌蹭辦g力喪失，說明此基因與銅綠假單胞菌IV型菌毛的運動有關，這 對IV型菌^M動相關新基因的發(fā)現(xiàn)以及揭示新基因的功能都有指導意義。
fflil^發(fā)明，可以針對尸，"7基因設計藥物，限偉唭正常鋭，使得細菌無^ii^斷 M動 形成生物鵬，斷碟耐藥性，超鵬療銅綠假單胞菌弓胞的感染的目的。
1
圖1鵬動能力喪失的陽性轉化子的蹭動運動檢測圖
1 、野生型PA68作為陽性對照 2、賴0/7/::Mu PA68突變株 圖2是Mu克隆，切產物電泳圖
1、 DL15000 2、質粒3、質粒酶切 圖3是Mu轉座子PCR產物電泳圖(用PCR方法檢測轉化子的Mu轉座子)
1、 DL20002、 Mu克隆子PCR產物。 用Mul和Mu2作為引物，克隆子質粒DNA為豐嫩，可以擴增出700bp的特異性片段，說明所 檢測的克隆子質粒中攜,插入了 Mu轉座子的基因片段。
具^6^式
鄉(xiāng)例l:頓MU轉座技術進行突變子文庫的建立
(1) 將臨床分離株銅綠假單胞菌PA68接種于50mlL-broth培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g^酵 母粉，5g^LNaCl)中，37°C， 200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
(2) 次日按l: 100接種至200mlL—broth培養(yǎng)基中，200rpm， 37"培養(yǎng)至00540^0.5，終止培養(yǎng)。
(3) 于2。C 7000 g離心10 min，收集菌體。
(4) 依次用200ml、 100 ml 、 40 ml在冰浴中預冷的300 mM蔗糖溶Mf^浮、洗滌菌體，2 。C誦g離心10min，倒凈鰣。
(5) 根據(jù)菌體的多少用不同《斜只的300mM蔗糖溶液混勻，并fflii^ffl胞計數(shù)偉恪成濃度約為1011 個cells/ml的感受態(tài)細胞。
(6) 將感受態(tài)細胞條成100 yl滑，1分直接用于電轉化，1分在液氮中冷凍后，放—80 。CftKf昏中保存。另1分直接放一8(TC》條昏保^&用。
(7) 取感受態(tài)細胞100 li 1、質粒pSMC28和Mu轉座復合物約50ng，加入到在冰浴中預冷的0.2 cm 電轉化杯中(陰'斷照只加感受態(tài)細 加質粒)，在BioRad電穿孑L處設置電容25uF,電阻 200 S^P口誠的電壓誠電擊。
(8) 電擊后將轉化體系轉入予跣37。C溫浴的900ulL"broth培養(yǎng)基中。37°C， 225ipm， i歸lh 。
(9) 取100 y L菌液涂布于50 u g/ml Km抗性平肚，溫箱37°C過夜培養(yǎng)，24小時后即可觀察結 果。
(10) ^il夜培養(yǎng)的篩選平fei:挑取數(shù)個M^，分別接種到1 ml的L—broth中，37°C， 200 rpm 振蕩培養(yǎng)16—18 h。
(11) 取2iil菌液t^嫩，以AXMu轉座子上的特異序列Mul (5， -GCMCTGTCCATACTCTGA-3，) 和Mu2 (5， - CGCTGGGTTTATCGTCGA-3，)做引物，用PCR方feT增Mu轉座子片段。同時分別以 銅綠假單胞難株^M粒pHTH2做陰'極陽',照。擴增^j牛為，先在94。C1^性15min，然后， 94。C^fil min， 55。C退火l min， 72。C延伸1 min，共30個循環(huán)，雜72。C延伸10 min。
(12) PCR產tT&0.鄉(xiāng)瓊月識,中電泳檢測，EB染色后紫外燈下觀察結果并留照片，具有700bp 卡那霉素抗性基因的轉化子即為Mu轉座復合,化子。
鄉(xiāng)例2:突變子蹭動能力的檢測
(D在無菌塑料:t歸皿內鋪上一層蹭動能力檢測培養(yǎng)基[10g/L胰蛋白胨，5g/L酵娜，5g/LNaCl，
1% (W/V)顆粒狀瓊月謝]。
(2)從Mu轉座子突^t庫中活化突變菌株。
5
(3) 用滅菌的牙翻陬菌落，矛逾曾動培養(yǎng)基，將細菌接種到線基下面的塑料平皿上37'C培養(yǎng) 24小時。
(4) 細菌就會依賴IV型菌毛的收縮和伸展在培養(yǎng)基下面的塑料表面以接種點為圓心，向周圍蔓延生 長，產生圓形的菌暈。
(5) 將培養(yǎng)皿輕揭去，用考馬司^染色液(10%乙酸，0.06烤馬司亮蘭)染色塑料平皿20分 沐倒掉染液，用自來水沖群皿lmin，觀察細菌因蹭動而產生的環(huán)，篩淑曾動能力喪失或織g 的突變子(圖1)。
^BI例3:銅綠假單胞菌蹭動能力相關基因的克隆 1 Mu轉座復合tl^化子基因組DNA的提取
(1) 將銅綠假單胞菌Mu轉座復合物轉化子針5mL LB液體培養(yǎng)基中，3CTC 200rpm過夜培養(yǎng)。
(2) 4。C 5000 ipm離心10，，棄上清，菌體重舒200&裂解緩沖液。
(3) 加入4^L 10 m&tol的RNase， 37。C水浴30，。
(4) 加入8^L 20 mg/mL的蛋白酶K， 20% SDS 5&，于56。CtK浴30分鐘。
(5) 分別用等^IH苯酚，苯船:氯仿(1:1)和氯仿^4提1次，12000rpm離心10糊。
(6) 加入2倍#|只冷凍的5￡7夂乙醇，^"20。C體30，。
(7) 挑出DNA， 7(m乙,滌2次，真空干燥。
(8) 溶于50^iL TE， -20。C保存。 2大量提取鄉(xiāng)桿菌質粒p固
(1) 25raL液體LB培養(yǎng)基，接入攜帶質粒pUC18的鄉(xiāng)桿菌單M， 3CTC、 200rpm培^il夜。
(2) 菌液的OD6oo駄于1.0后，4°C 6000rpm離心10，，棄上清。
(3) 加STE溶液(100 mM NaCl， 10 mM Tris. Cl pH8. 0， 1 mM EDTA) 12. 5mL洗細胞，4°C 6000rpm 離心10佛棄上清。
(4) 加溶液I (50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25mM Tris. Cl, pH8. 0) 0. 5mL再向各管中加入溶 菌酶(反應濃度20ng/mL)，輕微混，37。C7jC浴15-30rain。
(5) 加溶液II (0.2 M NaOH， 1% SDS) lmL輕輕混勻MM明，冰浴10，。
(6) 加入溶液in (3 M KAc， 5 M乙酸，pH4. 8) 0.75mL劇烈振蕩后，冰浴30^H41。
(7) 4°C體Orpm離心5 ，，社清。
(8) 加入0.7^狩只的異丙醇，室^Cgl5，。
(9) 4°C 12000rpm離心10 ，，棄上清。
(10) 加入100pL TE溶液溶自酸。
(11) 加入RNase (反應濃度為100^g/mL) 37。C7jC浴30 ，。
(12) 苯酚:氯仿(1:1)抽提，振蕩均勻，4°C 12000rpn離心15 ^Ht， ^Lh清。
(13) 加入2 f&i^f只的^7jC乙醇和1/10 {斜只的3mol/L NaAc (pH4. 8)， -20°C 20 ^#沉淀DNA。
(14) 4°C腦0 ，離心10頒，棄上清。
(15) 加入lmL7(^的冷乙麟DNA沉淀兩次，千燥。
(16) 加入50MLTE溶解質粒，-20。C保存。
3基因組DNA和質粒pUC18的酶切(50pL體系) 10 X buffer 5uL
腸HI 2"
DNA 10 yL
ddH20 33uL
混勻，30。C水浴過夜。 4酶的滅活與純化
(1) 酶切體系置于65。C^浴15恤之后降至室溫。
(2) TE補足至400nL，苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(3) 加入2倍^!R的^7jC乙醇和1/10 4狩只的3mol/LNaAc (pH4. 8)， _20°C 20 ^H4^沉淀DNA。
(4) 4°C 12000rpm離心10^K棄上清。
(5) 加入lraL7(m的冷乙gDNA沉淀兩次，真空千燥。
(6) pUC18溶于88nL lm mol/L Tris"Cl，基因組DNA溶于1mL TE。 5 pUC18去磷酸化
pUC18 88nL 10 X buffer 10pL CIAP (堿性磷,) 2& 置于37。C水浴30，。 6去磷酸化酶的除去
(1) TE補足至200^iL，加入2^L 0.5 mol/L EDTA。
(2) 75。C水浴10^m，使酶失活，并降至室溫。
(3) 苯酚:氯仿(1:1)抽提一次。
(4) 力口入2倍f斜只的^7jC乙醇和1/10 4狩只的3mol/L NaAc (pH4. 8)， —20。C腿20 ^Ht^沉淀DNA。
(5) 4°C 12000rpm離心10 ，，棄上清。
(6) 加入lmL7(^的冷乙,DNA沉淀兩次，真空千燥。
(7) 沉淀溶于5pL鵬O中。
7基因組DNA和質粒pUC18的連接(15^1體系) DNA 1-d, 攀 pUC18 I-
混勻，45。C7jC浴5溯后，ifiit冰浴，再加T4連,1.5nL， 10 Xbuffer 1.5^， 14-16°C 水浴過夜。 8連接產物的處理
(1) TE樸超200mL。
(2) 加入2倍I^R的^7jC乙醇和1/10 #|只的3mol/LNaAc (pH4. 8)， -20。C體20 ^Ht沉淀DNA。
(3) 4°C 12000rpm離心10^Ht，棄上清。
(4) 加入lmL7TO的冷乙^DNA沉淀兩次，真空千燥。
(5) 沉淀溶于5nLddH20中。
9 ^桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備(1) 將娥桿菌單麟接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C、 200轉腦過夜培養(yǎng)。
(2) 過夜培養(yǎng)的菌液按l: 100接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、 220 rpm振蕩培養(yǎng)。
(3) 菌液ODeoo在0. 5-0. 6之間時終止i歸并置于冰上。
(4) 轉移至250mL離心中，4°C、 6000rpm離心10min，收集菌體。
(5) 100mL預冷的ddH2O懸浮洗滌細胞，4°C 6000rpm離心10糊，收集菌體。
(6) 50mL預冷的lCT6甘油懸浮洗滌細胞，4°C 6000rpm離心10洲，收集菌體。
(7) 用2mL預冷的l戰(zhàn)甘油懸浮洗滌細胞，4'C 6000rpm離心10溯，棄上清，盡量吸干管赴 的殘留液體。
(8) 用200^L預冷的10%甘油培養(yǎng)基1懸細胞。
(9) 100倍稀釋后測菌液OD60Q，用預冷的10%甘油培 將菌液稀釋至濃度為2xlO氣3xl()W個 細SI/mL (10D6oo約相當于2.5xl(^個細ffi/na)。
(10) 將菌液分裝，每管95^L。用于電轉化或-7(TC保存。 10大腸桿菌DH5a的電轉化方法
(1) 5^L DNA連接產物與95ML^lf桿菌感受態(tài)細胞混勻，冰浴5—10，。
(2) 混合 移至豫令的0.2011電轉化杯中(陰' 照不加混^/，只力口感受態(tài)細胞)，在Bicr"Rad 電轉化處設置2.50kv，進行電擊。
(3) 從電轉化杯中吸出電轉化體系，并用lmL 37。C預熱的SOC液《雜養(yǎng)基(20 g/L胰蛋白胨，5g/L 酵 ， 0.5g/LNaC120mM葡繊，lOmM氯化鎂)稀釋后，37°C， 150轉/^H4"i歸1小時。
(4) 菌液^^布"f^ 20mraol/L MgS04 50嗎/mL卡那霉素和IOO昭/mL氨節(jié)青霉素的LB固體 培養(yǎng)基上，37。C倒數(shù)夜培養(yǎng)。
11克隆子的 、鑒定
(1) 從過夜培養(yǎng)的雙抗平肚挑取轉化子，小量提取質粒，用限制性內切酶扁I酶切，并以 p固扁I酶切產物為對照。
(2) 以DL15000為DNA標準，在O. 8%瓊月識M^中電泳檢測鑒定，衫隨同時具有pUC18載體帶 和夕卜源目的基因帶的克隆子(圖2)。
(3) 同時以從轉化子中提取的質粒為模板，用Mu轉座子DNA片段的Mu轉座子檢測弓嫩Mul和Mu2 進行PCR。電泳檢測PCR產物，以DL2000為DNA標準，以質粒pHTH2為正對照，若能擴增出700bp 的特異性帶，貝頓明轉化子質粒中含有AXMu轉座子DNA片段，克隆成功(圖3)。
(4) 對成功克隆的轉化子質豐她行測序。 12克隆子質粒的DNA領,
將用15%甘油管保存的轉化子菌液，用以Mu轉座子兩端的反向序列為依據(jù)設計的AM42P2作為 引物進行測序。^Lt海英俊公司進行DNA湖,，測定轉座子插入位點側翼的核苷,列。 13.基因推斷
測序結果在銅綠假單胞菌的基因組數(shù)據(jù)庫(http〃www.pseudomonas.com)或GenBank (http:〃雨.ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST中進行序列比對最終發(fā)JMf需基因。
序列表
<110>南開大學
<120>銅綠假單胞菌蹭ffig動相關基因賴W7/鵬用
<160> 1
<210>1
<211〉543
<212>DNA
<213〉銅綠假單胞菌(/tezAi9附omy "e/-wg^osa) <400>1
atggaaacgc tagacctgct ggccatgcgt gaaagctaca cccgccaacg catcctgctc 60 tgcttcaacg gaccgatctc gcgcagcctg atcgaggaga taggccacgc gctgcgcaac 120 tacctgcacg ccgaacaggc caagccgagc gaagcgatgg acgtcttcgc ggtgtacatc 180 gagatgaccc agaacatccg ccactgcgcc aatctcaagg gctacggcga acacgaggcg 240 gcggccacgg tagccatcgc ccgcaacgag gacggccact acgtggtgtc cgccggcaac 300 ctggtggaaa gcgacgacgg ccagagcctg gtgcgcagca tccaggccat cgccaacctc 360 gacaaggccg ccctcaaggc cgcctacaag gagcagctgc gccgcccgcg cgacagcggc 420 agcgccagcg gagccggtct cggcctgctg gacatcgccc gcaagtccag cgaaccactg 480 gccgcatcgc tgaaggaaca gcccgacggg cgcgcgttct tcagcctgcg cgccgtgatc 540 tga 54權利要求
1、一種銅綠假單胞菌蹭行運動相關基因PA0171，其核苷酸序列如序列表所示，其基因長度為543bp。
2、 權利要求l阮悉的銅，單胞菌蹭fi^動相關基因i^777的應用，用于以該基因為新藥 靶點設計并制MCMH物。
全文摘要
本發(fā)明公開了銅綠假單胞菌蹭行運動相關基因PA0171。屬于微生物生物技術領域。本發(fā)明與銅綠假單胞菌致病性的研究息息相關，此基因大小為543bp，國際上對該基因的功能沒有報道。實驗發(fā)現(xiàn)該基因的缺失能夠使IV型菌毛介導的蹭動能力喪失。蹭動能力在銅綠假單胞菌生物被膜形成的早期起著必不可少的作用。生物被膜的形成提高了銅綠假單胞菌的耐藥性，常在臨床上引起頑固性、難治性感染，成為臨床治療的棘手問題。用銅綠假單胞菌生物被膜形成相關基因PA0171為新藥靶點研制抗菌藥物，為臨床治療和耐藥防治服務。
文檔編號C12N15/31GK101376886SQ20081015228
公開日2009年3月4日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權日2008年10月10日 公開號200810152284.0
發(fā)明者喬明強, 劉力偉, 單志英, 姚宏明, 張秀明, 徐海津, 銳 牟, 白艷玲, 靳永新 申請人:南開大學