專利名稱：角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體及其基因和制備方法及所用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體及其基因和制備方法及所用 引物。
背景技術(shù)：
角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因(命名為c/nM)的基因序列如SEQ ID NO: l所 示，屬于糖基水解酶家族18;其編碼的氨基酸序列(角毛殼菌幾丁質(zhì)酶)如 SEQ ID NO: 2所示，具有一個(gè)保守的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chitin-binding domain, ChBD)位于第105~第124個(gè)氮基酸。只有少數(shù)的真菌幾丁質(zhì)酶含有ChBD， 大部分真菌幾丁質(zhì)酶中不含有ChBD，因此目前對(duì)ChBD的功能和作用并不清 楚。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為幾丁質(zhì)酶ChBD的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，提供了一種角毛殼菌幾 丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體及其基因和制備方法及所用引物。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因序列如SEQ ID NO: 3所
不o
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因按以下步驟制備
一、 提取角毛殼菌總RNA:
二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
三、 克隆步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化五.Co"JM109感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；
四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95。C預(yù)變性lOmin， 94。C變性30s、 50。C退火30s、 72。C延伸90s、共 35個(gè)循環(huán)，72""C延伸10min;
五、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-W/5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 A: PCR反應(yīng)體系為50nL，由5|xL lOxpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lfxL濃度 為20|_imol/L上游引物PM1 、 lpL濃度為20拜ol/L下游引物PX、 0.25pL高信 度擴(kuò)增酶i^raZ^^DNApolymerase、 1&突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94。C變性30s、 57.6。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PM1 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物PX的基因 序列為5 ，-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3 ，；
六、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-c/2/5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50|iL，由5|iL lOxpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L上游引物PY、 ljiL濃度為20jimol/L下游引物PM2、 0.25jiL高信 度擴(kuò)增酶iV"oZ^wDNApolymerase、 l(oL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94。C變性30s、 58.7。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PY 的基因序歹lj為 5'-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3，； 下游引物PM2的基因序列為 5'-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3';
七、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴(kuò)增待融合片段A和B，然后進(jìn)行 融合PCR:由5pL lOxpyrobest buffer、4^L dNTP、0.25^L高信度擴(kuò)增酶尸》，ra6eW DNApolymerase、 ljxL濃度為10ng/^L的突變擴(kuò)增待融合片段A、 lpL濃度為 lOng^iL的突變擴(kuò)增待融合片段B和余量的ddH20組成的體積為50pL的融合 PCR反應(yīng)體系先進(jìn)行94。C變性30s、 57。C退火2min、 72。C延伸3min， 8個(gè)循 環(huán)；然后加入lpL濃度為20pimol/L上游引物PM1和lpL濃度為20^imol/L下 游引物PM2，再進(jìn)行94°(3變性30s、 57。C退火30s、 72。C延伸5min， 20個(gè)循 環(huán)；純化、回收，即得到角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體按以下步驟制備
一、 提取角毛殼菌總RNA:
二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
三、 克隆步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與pMD-18T
克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化五.Co/z'JM109感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；
四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95。C預(yù)變性10min， 94。C變性30s、 50。C退火30s、 72。C延伸90s、共 35個(gè)循環(huán)，72t:延伸10min;
五、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-c/n'5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 A: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4piL dNTP、 lpL濃度 為2(^mol/L上游引物PMl、 1^iL濃度為20nmol/L下游引物PX、 0.25^iL高信 度擴(kuò)增酶尸少ra&wDNApolymerase、 l(iL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94"C變性30s、 57.6。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PM1 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物PX的基因 序列為5 ，-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3 ，；
六、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-c/ '5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L上游引物PY、 1(iL濃度為20(amol/L下游引物PM2、 0.25高信 度擴(kuò)增酶尸,o&W DNApolymerase. lpL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94'C變性30s、 58.7'C退火30s、 72'C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PY 的基因序列為 5'-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3，； 下游引物PM2的基因序列為 5 ，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3';
七、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴(kuò)增待融合片段A和B，然后進(jìn)行 融合PCR:由5joL lOxpyrobest buffer、4^iL dNTP、0.25j^L高信度擴(kuò)增酶尸少ra&W DNApolymerase、 lpL濃度為lOng/pL的突變擴(kuò)增待融合片段A、 1^L濃度為 10ng/pL的突變擴(kuò)增待融合片段B和余量的ddH20組成的體積為50^L的融合 PCR反應(yīng)體系先進(jìn)行94。C變性30s、 57。C退火2min、 72。C延伸3min, 8個(gè)循 環(huán)；然后加入l|iL濃度為20Mmol/L上游引物PM1和lpL濃度為20^imol/L下
游引物PM2，再進(jìn)行94。C變性30s、 57。C退火30s、 72。C延伸5min， 20個(gè)循 環(huán)；
八、 將步驟七得到的基因片段與真核表達(dá)載體pPIC9K重組構(gòu)建重組表達(dá)
質(zhì)粒pPIC9K-A/5SD，然后采用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到真核表達(dá)宿主菌畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于MD平板培養(yǎng)基在3(TC條件下培養(yǎng)2 3天，之 后將MD平板培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化菌落分別點(diǎn)種到MM和MD平板培養(yǎng)基的 相應(yīng)位置上在30。C條件下培養(yǎng)2~3天，并根據(jù)菌落在MM平板上的生長情況
鑒定轉(zhuǎn)化子的表型；
九、選擇Mut+型轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)挑選Mut+型轉(zhuǎn)化子單菌落置于裝 有25mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中在28~30°C 、 250-300 r/min的條件下 培養(yǎng)至006。。 = 2~6，然后在室溫、1500~3000g的條件下離心5min，收集菌體 用BMMY重懸菌體使OD6Q() =0.9-1.1;將BMMY重懸菌液用雙層紗布或粗棉 布封口放置于28 30°C、 250~300 r/min的環(huán)境中繼續(xù)生長，每隔24h向培養(yǎng)基 中添加濃度為100%的甲醇至菌液中甲醇的終濃度為0.5~1.0%;連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng) 120h、并在4。C、 8000 r/min條件下離心10min，得到的上清液為含有角毛殼 菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的粗酶液。
本發(fā)明用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物PM1的基因 序列如SEQIDNO: 5所示，引物PM2的基因序列如SEQIDNO: 6所示， 引物PX的基因序列如SEQ ID NO: 7所示，引物PY的基因序列如SEQ ID NO: 8所示。
本發(fā)明為幾丁質(zhì)酶ChBD的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶ChBD 缺失突變體。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體制備方法采用具有互補(bǔ)末端 的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，在不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件 下實(shí)現(xiàn)DNA片段的拼接。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體制備方法僅一步PCR反應(yīng)就 能實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域的刪除，具有快速且節(jié)約成本的特點(diǎn)。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體及其基因的制備方法步驟七 中引物之間都通過重疊搭橋進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此在最初的8個(gè)循環(huán)反應(yīng)中不加 引物，模板間自動(dòng)退火搭橋形成長鏈，同時(shí)適當(dāng)?shù)难娱L了退火時(shí)間，提高了反 應(yīng)的成功率。
本發(fā)明缺失突變體基因的制備方法具有簡捷、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，而且在擴(kuò)增過程中未引入其他突變，保障了非突變區(qū)序列的正確性，所獲得的缺失突 變體基因可用于后續(xù)的分子克隆。
本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因制備方法中突變位點(diǎn)就 在引物上，因此本發(fā)明中突變引物的重疊區(qū)長，重疊區(qū)堿基均在27bp左右， 提高了引物與模板結(jié)合的特異性，所以本發(fā)明目的基因片段的特異性強(qiáng)。本發(fā) 明制備的缺失突變體基因與真核表達(dá)載體pPIC9K連接構(gòu)建重組表達(dá)載體，再 經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后表達(dá)出角毛殼菌幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失突變體 (W/5SZ))，說明本發(fā)明角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因具有表達(dá)功 能。
本發(fā)明用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物間每對(duì)引物 的退火溫度非常接近。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方 式間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一:本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的氨基 酸序列序列如SEQIDNO: 4所示。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因序 列如SEQIDNO: 3所示。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因按 以下步驟制備
一、 提取角毛殼菌總RNA:
二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
三、 克隆步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化￡.0 /^]^109感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；
四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95。C預(yù)變性10min, 94。C變性30s、 50。C退火30s、 72。C延伸90s、共 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min;
五、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-c/2/5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段
A: PCR反應(yīng)體系為50|liL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4(xL dNTP、 lpL濃度 為20pmol/L上游引物PM1、 lpL濃度為20nmol/L下游引物PX、 0.25pL高信 度擴(kuò)增酶尸,o&W DNApolymerase、 1^iL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94。C變性30s、 57.6。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PM1 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物PX的基因 序列為5 ，-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3 ，；
六、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-C/ '5<S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50|nL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4pL dNTP、 ljiL濃度 為20^imol/L上游引物PY、 l!iL濃度為20^imol/L下游引物PM2、 0.25pL高信 度擴(kuò)增酶i^ra6eWDNApolymerase、 1^L突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94'C變性30s、 58.7匸退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PY 的基因序列為 5'-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3，； 下游引物PM2的基因序列為 5 ，醒CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3 ，；
七、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴(kuò)增待融合片段A和B，然后進(jìn)行 融合PCR:由5pL 10xpyrobestbuffer、4(oL dNTP、0.25pL高信度擴(kuò)增酶尸少ra6eW DNApolymerase、 lpL濃度為10ng/pL的突變擴(kuò)增待融合片段A、 1^L濃度為 10ng4iL的突變擴(kuò)增待融合片段B和余量的ddH20組成的體積為50pL的融合 PCR反應(yīng)體系先進(jìn)行94。C變性30s、 57。C退火2min、 72。C延伸3min， 8個(gè)循 環(huán)；然后加入l|xL濃度為20(imol/L上游引物PM1和lpL濃度為20timol/L下 游引物PM2，再進(jìn)行94。C變性30s、 57"C退火30s、 72。C延伸5min， 20個(gè)循 環(huán);純化、回收，即得到角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因。
本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購得， 若無特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中的操作步驟參見試劑盒使 用操作手冊(cè)。
本實(shí)施方式得到的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因片段經(jīng)基因測序如SEQIDNO: 3所示，缺失角毛殼菌幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本實(shí)施方式中突變擴(kuò)增待融合片段A長311bp，突變擴(kuò)增待融合片段B長1138bp。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟二按以 下步驟實(shí)施a、將5nL角毛殼菌總RNA、 8^L RNase-free H20和2pL引物 01igod^T混勻后置于7(TC的環(huán)境中5min，然后放于冰上；
b、 將5pL5xMLVBuffer、 1.25^L dNTPmix、 0.6jiL鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRP)、 lpL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和2.5^iL ddH20混合；
c、 將a步驟和b步驟得到反應(yīng)體系混合，再置于42'C環(huán)境中反轉(zhuǎn)錄lh;
d、 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25pL，由2pL 10mM dNTP、 2pL25mMMgCl2、 5UExTaqDNA聚合酶lpL、 10pM上游引物PMl、 10pM下游引物PM2、 2pL步驟c反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和余量的ddH20組成，PCR反 應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5 min， 94。C變性20s、 57。C退火30s、 72。C延伸30s、 35個(gè)循環(huán)，72""C延伸10min;
其中步驟 d 中上游引物 PM1 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，；下游引物PM2的基因 序列為5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，。 其它步驟 及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體按以下 步驟制備
一、 提取角毛殼菌總RNA:
二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
三、 克隆步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化￡.0 /^]\4109感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選;
四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47迸行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95匸預(yù)變性10min， 94。C變性30s、 50。C退火30s、 72。C延伸90s、共 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min;
五、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-c/n'5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 A: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5pL 10xpyrobest buffer、 4^L dNTP、 l!止?jié)舛?為20pmol/L上游引物PMl、 lfiL濃度為20Mmol/L下游引物PX、 0.25pL高信
度擴(kuò)增酶/yo6eWDNApolymerase、 lpL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94。C變性30s、 57.6。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PM1 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物PX的基因 序列為5，-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG畫3，；
六、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-W/5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4jiL dNTP、 ljiL濃度 為20^imol/L上游引物PY、 ljxL濃度為20(xmol/L下游引物PM2、 0.25高信 度擴(kuò)增酶尸,o6eWDNApolymerase、 1^L突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94i:變性30s、 58.7。C退火30s、 72匸延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PY 的基因序歹U為 5'-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3'; 下游引物PM2的基因序列為 5 ，國CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3 ，；
七、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴(kuò)增待融合片段A和B，然后進(jìn)行 融合PCR:由5pL lOxpyrobest buffer、4^L dNTP、0.25pL高信度擴(kuò)增酶尸yra&w DNApolymerase、 l^L濃度為lOng/^L的突變擴(kuò)增待融合片段A、 1^iL濃度為 10ng/pL的突變擴(kuò)增待融合片段B和余量的ddH20組成的體積為50piL的融合 PCR反應(yīng)體系先進(jìn)行94"C變性30s、 57'C退火2min、 72'C延伸3min， 8個(gè)循 環(huán)；然后加入1jxL濃度為20(imol/L上游引物PM1和lpL濃度為20拜ol/L下 游引物PM2，再進(jìn)行94。C變性30s、 57。C退火30s、 72。C延伸5min， 20個(gè)循 環(huán)；
八、 將步驟七得到的基因片段與真核表達(dá)載體pPIC9K重組構(gòu)建重組表達(dá) 質(zhì)粒pPIC9K-c/n'5SD，然后采用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到真核表達(dá)宿主菌畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于MD平板培養(yǎng)基在30。C條件下培養(yǎng)2 3天，之 后將MD平板培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化菌落分別點(diǎn)種到MM和MD平板培養(yǎng)基的 相應(yīng)位置上在3(TC條件下培養(yǎng)2~3天，并根據(jù)菌落在MM平板上的生長情況 鑒定轉(zhuǎn)化子的表型(在MM平板培養(yǎng)基上生長正常的轉(zhuǎn)化子是Mut+型轉(zhuǎn)化子； 而在MM平板培養(yǎng)基上生長遲緩的轉(zhuǎn)化子是Muf型轉(zhuǎn)化子)；
九、 選擇Mut+型轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)挑選Mut+型轉(zhuǎn)化子單菌落置于裝
有25rnL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中在28 30°C 、 250~300 r/min的條件下 培養(yǎng)至006()() = 2~6(培養(yǎng)時(shí)間為16 18h)，然后在室溫、1500 3000g的條件下 離心5min，收集菌體用BMMY重懸菌體使OD, =0.9~1.1;將BMMY重懸 菌液用雙層紗布或粗棉布封口放置于28 30°C 、 250~300 r/min的環(huán)境中繼續(xù)生 長，每隔24h向培養(yǎng)基中添加濃度為100%的甲醇至菌液中甲醇的終濃度為 0.5~1.0%;連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)120h (幾丁質(zhì)酶活性最高)、并在4°C、 8000 r/min 條件下離心10min，得到的上清液為含有角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體 的粗酶液。
本實(shí)施方式隨機(jī)選取畢赤酵母GS115轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，并用引物 Sl(位于chi58序列內(nèi)部，SI基因序列為 5'-AAAGACACTGGTGTCGGCATCT-3')與載體引物3'AOXl進(jìn)行擴(kuò)增鑒定， 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50pL:由5jiL 10xPCRbuffer、 5jiL Genomic DNA(約l嗎)、lpL lOOmM dNTPs、 5jxL SI引物(0.1pg/|iL)、 5pL 3'AOXl引物、0.25|iL Tag polymemse(5U4iL)和余量無菌水組成；擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5 min， 94。C變性lmin、 63。C退火lmin、 72。C延伸2min、 25個(gè)循環(huán)，72。C延伸7min; 鑒定結(jié)果基因序列如SEQIDNO: 3所示，且在粗酶液中分離純化到與本實(shí)施 方式所設(shè)計(jì)的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體分子量相同的蛋白質(zhì)，說明 本實(shí)施方式制備的蛋白質(zhì)為角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體。
本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購得， 若無特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實(shí)施方式中的操作步驟參見試劑盒使 用操作手冊(cè)。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五的不同點(diǎn)是步驟七得到 的DNA片段純化、回收后5'末端磷酸化，再克隆到pSIMPLE-18五coRV/BAP 載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到陽性重組克隆。其它步驟及參數(shù)與實(shí) 施方式五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五的不同點(diǎn)是步驟二按以 下步驟實(shí)施a、將5jxL角毛殼菌總RNA、 8(iL RNase-free H20和2jiL引物 01igod18T混勻后置于7(TC的環(huán)境中5min，然后放于冰上；
b、將5(oL5xMLVBuffer、 1.25|xLdNTPmix、 0.6pL鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRP)、 lpLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和2.5^L ddH20混合；
c、 將a步驟和b步驟得到反應(yīng)體系混合，再置于42'C環(huán)境中反轉(zhuǎn)錄lh;
d、 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25pL，由2pL 10mM dNTP 、 2pL 25mM MgCl2 、 5U五x Taq DNA聚合酶、1 OpM上游引物PM1 、 1 OpM 下游引物PM2、 2nL步驟c反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和余量的ddH20組成，PCR反應(yīng)條件 為94。C預(yù)變性5min， 94'C變性20s、 57。C退火30s、 72°。延伸30s、 35個(gè)循 環(huán)，72。C延伸10min;
其中步驟 d 中上游引物 PM1 的基因序列為 5'誦GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物PM2的基因 序列為5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，。其它步驟 及參數(shù)與實(shí)施方式五相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五的不同點(diǎn)是步驟一中用 植物葉小量提取試劑盒提取總RNA:收集角毛殼菌菌絲并用無菌水沖洗，然 后干燥、液氮速凍、研磨；取0,2g研磨后的菌絲加入到lmL TRIZOL試劑中 靜置5min，再加入0.2mL三氯甲垸劇烈振蕩15s，然后在12000g、 4。C條件下 離心15min;取上清，加入沉淀劑離心，沉淀用質(zhì)量濃度為75%的乙醇洗滌兩 次、再干燥；將沉淀溶解在5(^L用DEPC處理的雙蒸水中，即得到角毛殼菌 總RNA。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式五相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變 體的引物的基因序列為
PM1: 5 ，-GACCQQA^IQAGCACGAGGCAAAAGCTCT畫3,， PM2: 5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，， PX: 5，-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG誦3，， PY: 5，-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3 。
本實(shí)施方式引物PM1和PM2中分別加入了 ￡coA I和A^f I酶切位點(diǎn)(加 下劃線部分)。
序列表
〈110〉哈爾濱工業(yè)大學(xué)
〈120〉角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體及其基因和制備方法及所用引物
〈160〉 9
〈210〉 1 〈211〉 2065 〈212> DNA
〈213>毛殼菌屬(Chaetomium)
〈400〉 1
Ctgttttgtgtgccaccgttctgctctctgtgccagtctccaaccggcctgtccatcaag60
attcgaccttggtcgttgtgactgcctatcatgaagacgtctctgagctgcgtcttgctc120
tgggctgggctggccgtggccgcgtccagctatgagtctagtttcctcgtccaagcccgc180
ggcaaaagctCtgg3CgCg￡Lgacgactcagacccgaagtgcaccaaggat240
attccgtgca卿tcgggtgctgtgggccattgtaggtctatcgctctcagataaacatc300
gcgc已a(bǔ)tgctg已CggCC3Cgacag3gacaaagacactggtgtcggcatctgcggcttggg360
accaaccttctgcggcgacgggtgcacctcgtcgtgcgactac犯gagcgagtgcgaccc420
gggctggggc3tgC3gtggtccaacgcatcgacgtgccccctcaacgtgtgctgcagtg3■
ctttggtttctgcggcacgaccgatgagttctgcaagggc卿g郷tgtcggtcccgca540
gtgcgacccggccgccaacagctcgcacgcgcgcaccgtcggctactatg鄉(xiāng)gctggaa600
ctggcagcgcccctgcggcaccatgaagccgtcgcagatcccgctcggttattacagtca660
cattttcttcgccttctcgttgctcgaccccaccaccttccggctgtcgcccatggatac720
Cg卿C3ggtaccctgtacggtgacgtctcggctatc犯gaaccgccagccgggcgtgca780
ag"tctggatcgccatcggcggctgggcgatgaatgaccccggtccgactcggccgacgtt840
ttcaaacctggcc犯ggacg鄉(xiāng)cggcgcagg3Cg3gttCttcgaggccctggtcacttt900
catg已tggccaacgactacgacggtgtcgatatcgactgggaatatcccgtcgccgacga960
t卿ggtggc3gCgtCg3ggactttgat犯ctacgtcaacctgctcaagcgcctscgcgc1020
gcgcctc犯cagcatcggcgtgccga鄉(xiāng)gcctgtctatcacgctgcccgcgtcgtactg1080
gtatctgaaagggtttgacattgtcaacctCg3gCC8t3tgtggactttttcaatgtcat1140
g3Cgt3tg3tattcgtgagt犯cgttagcccatttgctgttcctcttgcttttaatccct1200
ctcactgctcatcctctccatcctttattccttUttttttttttutututtum1260
ttttgaa幼gaatgtctttcctcttttcttgactttctgtttactcatctcattgttctg1320
tccttgttgagacctggactaactccgtaa aac已gacggtgtctgggattcgacggtcca1380
aagcctggggccctatgcccacgcccax:aLc c犯cctcsccg鄉(xiāng)tcg鄉(xiāng)3ggC￡LCtga€L1440
gctgctttggtcaaccccga gcgcgtcaacctgggcctgggtttctacgg1500
tcgtagcttcaccsitga犯gacccctcttg catggccgccggctgtga^gttcagctctgg1560
cggtaacggtggC3gCtgC3cgggtacccc gggagtcctctcagcccacgagatcgtcca1620
aatcatcaat認(rèn)ggcgcgacggtgaiccsc ggacg卿tggccgccgtggagattgtcac1680
ctgggeicaccaaccagtgggtctcatggga cagcaccaagacgctggccatg犯ggtcaa1740
ctacgccaacgagcgctgcctgggcggtgt catggtctgggccatcgacctcg3cgacgg1800
caccct犯tcaagtcscttgccgaceicggg acggcccacctgacggacct1860
cccctggatgacgggttgtttcggatccgc gtttgacgactggtcg鄉(xiāng)ctgaatgactc1920
cgacstcgattcaggaagcagttaatgctt tagtcgtcttgt犯t已tgtcatattggaat1980
ggatactctagggtgagg犯aatatgtcac tttaaacacatgctacccgaatattgcctg2040
Cg3t犯tt3ggttgtccgtggccag 2065
〈210〉 2 <211> 533 <212> PRT
<213>毛殼菌屬(Chaetomium) <400> 2
Met Lys Thr Ser 1
Ala Ala Ser Ser 20
Thr Arg Gin Lys 35
Lys Asp lie Pro 50
Thr Gly Val Gly 65
Cys Thr Ser Ser
Met Gin Trp Ser 100
Asp Phe Gly Phe
Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val 5 10 15
Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gin Ala Arg Gin Ser
25 30 Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
40 45 Cys Lys lie Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
55 60 lie Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly
70 75 80
Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly 85 90 95
Asn Ala Ser Thr Cys Pro Leu Asn Val Cys Cys Ser
105 110 Cys Gly Thr Thr Asp Glu Phe Cys Lys Gly Lys Glu115
Val Pro Gin Cys
Val Ser 130
Thr Val Gly Tyr Tyr 145
Met Lys Pro Ser
120
Pro Ala Ala Asn
Asp 135
Gly Trp Asn Trp
Glu 150
lie Pro Leu Gly
Ser 140 Arg
125
Ser His Ala Arg
Pro
Gin 165
Leu Asp Pro Thr
Gin 155
Tyr Ser His
Ala Phe Ser Leu 180
Gly Thr Leu Tyr
Tyr 170
Phe Arg Leu Ser
Thr Glu Thr 195
Gly Val Gin Val
Thr 185
Asp Val Ser Ala
Gin Pro 210
Asp Pro Gly Pro Thr 225
Alei Ala Gin Asp
Gly 200
lie Ala lie Gly
Trp 215
Pro Thr Phe Ser
Arg 230
Phe Phe Glu Ala
Asn Asp Asp Arg
Tyr
Glu 245
Gly Val Asp lie
Asp 260
Gly Ser Val Glu
Gly 275
Leu Arg Ala Arg
Lys Arg 290
Ser lie Thr Leu Pro Ala 305 310 Val Asn Leu Glu Pro Tyr
Leu 295 Ser
Val
Asp 280 Asn
Tyr
Asp
Pro 325
Trp Asp Ser Thr
lie His Gly Val 340
Thr Asn Leu Thr
His Als His 355 Asn
Asn
Trp Arg 370
Tyr Gly Arg Ser 385
lie Phe
Asn
Thr 390
Pro 375 Met
Glu 360 Glu
Lys
Asp 265 Phe
Ser
Trp
Phe
Val 345 lie
Leu 250 Trp
Asp
lie
Tyr
Phe 330 Gin
Glu
Arg Val Asn Asp
Pro
Ser 395
Cys
lie
Pro 190 Lys
Gly
Phe 175 Met
Asn
Thr 160 Phe
Asp
Arg
lie 205
Trp Ala Met Asn
Gly 220
Leu Ala Lys Asp
Asn 235
Val Thr Phe Met
Glu
Asn
Gly
Tyr Tyr
Pro
Val 285 Pro
Met 255 Ala
Glu 240 Ala
Asp
Val 270
Asn Leu Leu
Lys
Val 300
Leu Lys Gly Phe 315
Asn Val Met Thr
Ser Leu Gly Glu
Gly
Asp
Tyr 335 Tyr
Leu
lie 320 Asp
Ala
Ala
Leu 365 Gly
Pro 350
Lys Leu Leu
Leu
Leu 380
Cys Met Ala
Gly Ala
Phe
Gly 400 Cys Glu Phe Ser Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro
405 410 415
Gly Val Leu Ser Ala His Glu lie Val Gin lie lie Asn Asn Gly Ala
420 425 430
Thr Val Thr Thr Asp Glu Val Ala Ala Val Glu lie Val Thr Trp Asp
435 440 445
Thr Asn Gin Trp Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys
450 455 460
Val Asn Tyr Ala Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala 465 470 475 480
lie Asp Leu Asp Asp Gly Thr Leu lie Lys Ser Leu Ala Asp Thr Gly
485 490 495
Arg Pro Thr Tyr Asn Tyr Leu Thr Asp Leu Pro Trp Met Thr Gly Cys
500 505 510
he Gly Ser Ala Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp lie
515 520 525
Asp Ser Gly Ser Ser 530
<210> 3 <211> 1542 〈212> DNA <213>人工序列
〈220〉
<221> CDS
<222〉 (l)... (1542)
<220>
〈223>角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因。 〈400〉 3
atg aag acg tct ctg age tgc gtc ttg etc tgg get ggg ctg gcc gtg 48 Met Lys Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly Leu Ala Val 15 10 15
gcc gcg tec age tat gag tct agt ttc etc gtc caa gcc cgc cag age 96 Ala Ala Ser Ser Tyr Glu Ser Ser Phe Leu Val Gin Ala Arg Gin Ser
20 25 30
acg agg caa aag etc tgg acg cga gac gac tea gac ccg aag tgc acc 144 Thr Arg Gin Lys Leu Trp Thr Arg Asp Asp Ser Asp Pro Lys Cys Thr
35 40 45
aag gat att ccg tgc aag ate ggg tgc tgt ggg cca tta gac aaa gac 192 Lys Asp lie Pro Cys Lys lie Gly Cys Cys Gly Pro Leu Asp Lys Asp
50 55 60
act ggt gtc ggc ate tgc ggc ttg gga cca acc ttc tgc ggc gac ggg 240 Thr Gly Val Gly lie Cys Gly Leu Gly Pro Thr Phe Cys Gly Asp Gly 65 70 75 80
tgc acc teg teg tgc gac tac aag age gag tgc gac ccg ggc tgg ggc 288 Cys Thr Ser Ser Cys Asp Tyr Lys Ser Glu Cys Asp Pro Gly Trp Gly
85 90 95
atg cag tgg tec aac gca teg acg aag ggc aag gag gtg teg gtc ccg 336 Met Gin Trp Ser Asn Ala Ser Thr Lys Gly Lys Glu Val Ser Val Pro 100 105 110
cag tgc gac ccg gcc gcc aac age teg cac gcg cgc acc gtc ggc tac 384 Gin Cys Asp Pro Ala Ala Asn Ser Ser His Ala Arg Thr Val Gly Tyr
115 120 125
tat gag ggc tgg aac tgg cag cgc ccc tgc ggc acc atg aag ccg teg 432 Tyr Glu Gly Trp Asn Trp Gin Arg Pro Cys Gly Thr Met Lys Pro Ser
130 135 140
cag ate ccg etc ggt tat tac agt cac att ttc ttc gcc ttc teg ttg ■ Gin lie Pro Leu Gly Tyr Tyr Ser His lie Phe Phe Ala Phe Ser Leu 145 150 155 160
etc gac ccc acc acc ttc egg ctg teg ccc atg gat acc gag aca ggt 528 Leu Asp Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Pro Met Asp Thr Glu Thr Gly
165 170 175
acc ctg tac ggt gac gtc teg get ate aag aac cgc cag ccg ggc gtg 576 Thr Leu Tyr Gly Asp Val Ser Ala lie Lys Asn Arg Gin Pro Gly Val
180 185 190
caa gtc tgg ate gcc ate ggc ggc tgg gcg atg aat gac ccc ggt ccg 624 Gin Val T卬lie Ala lie Gly Gly Trp Ala Met Asn Asp Pro Gly Pro195 200 205
act egg ccg acg ttt tea aac ctg gcc aag gac gag gcg gcg cag gac 672 Thr Arg Pro Thr Phe Ser Asn Leu Ala Lys Asp Glu Ala Ala Gin Asp
210 215 220
gag ttc ttc gag gcc ctg gtc act ttc atg atg gcc aac gac tac gac 720 Glu Phe Phe Glu Ala Leu Val Thr Phe Met Met Ala Asn Asp Tyr Asp 225 230 235 240
ggt gtc gat ate gac tgg gaa tat ccc gtc age cga cga tga ggt ggc 768 Gly Val Asp lie Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ala Asp Asp Arg Gly Gly
245 250 255
age gtc gag gac ttt gat aac tac gtc aac ctg etc aag cgc eta cgc 816 Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu Lys Arg Leu Arg
260 265 270
gcg cgc etc aac age ate ggc gtg ccg aag ggc ctg tct ate acg ctg 864 Ala Arg Leu Asn Ser lie Gly Val Pro Lys Gly Leu Ser lie Thr Leu
275 280 285
ccc gcg teg tac tgg tat ctg aaa ggg ttt gac att gtc aac etc gag 912 Pro Ala Ser Tyr Trp Tyr Leu Lys Gly Phe Asp lie Val Asn Leu Glu
290 295 300
cca tat gtg gac ttt ttc aat gtc atg acg tat gat att cac ggt gtc %0 Pro Tyr Val Asp Phe Phe Asn Val Met Thr Tyr Asp lie His Gly Val 305 310 315 320
tgg gat teg acg gtc caa age ctg ggg ccc tat gcc cac gcc cac acc 1008 Trp Asp Ser Thr Val Gin Ser Leu Gly Pro Tyr Ala His Ala His Thr
325 330 335
aac etc acc gag ate gag gag gca ctg aag ctg ctt tgg cgc aac aac 1056 Asn Leu Thr Glu lie Glu Glu Ala Leu Lys Leu Leu Trp Arg Asn Asn
340 345 350
ate aac ccc gag cgc gtc aac ctg ggc ctg ggt ttc tac ggt cgt age 1104 lie Asn Pro Glu Arg Val Asn Leu Gly Leu Gly Phe Tyr Gly Arg Ser
355 360 365
ttc acc atg aaa gac ccc tct tgc atg gcc gcc ggc —tgt gag ttc age 1152 Phe Thr Met Lys Asp Pro Ser Cys Met Ala Ala Gly Cys Glu Phe Ser
370 375 380
tct ggc ggt認(rèn)ggt ggc age tgc acg ggt acc ccg gga gtc etc tea 1200
Ser Gly Gly Asn Gly Gly Ser Cys Thr Gly Thr Pro Gly Val Leu Ser 385 390 395 400
gcc cac gag ate gtc caa ate ate aat aac ggc gcg acg gtg ace acg 1248 Ala His Glu lie Val Gin lie lie Asn Asn Gly Ala Thr Val Thr Thr
405 410 415
gac gaa gtg gcc gcc gtg gag att gtc acc tgg gac acc aac cag tgg 1296 Asp Glu Val Ala Ala Val Glu lie Val Thr Trp Asp Thr Asn Gin Trp
420 425 430
gtc tea tgg gac age acc aag acg ctg gcc atg aag gtc aac tac gcc 1344 Val Ser Trp Asp Ser Thr Lys Thr Leu Ala Met Lys Val Asn Tyr Ala
435 440 445
aac gag cgc tgc ctg ggc ggt gtc atg gtc tgg gcc ate gac etc gac 1392 Asn Glu Arg Cys Leu Gly Gly Val Met Val Trp Ala lie Asp Leu Asp
450 455 460
gac ggc acc eta ate aag tea ctt gcc gac acg gga egg ccc acc tac 1440 Asp Gly Thr Leu lie Lys Ser Uu Ala Asp Thr Gly Arg Pro Thr Tyr 465 470 475 480
aat tac ttg acg gac etc ccc tgg atg acg ggt tgt ttc gga tec gcg 1488 Asn Tyr Leu Thr Asp Uu Pro Trp Met Thr Gly Cys Phe Gly Ser Ala
485 490 495
ttt gac gac tgg tcg aga ctg aat gac tec gac ate gat tea gga age 1536 Phe Asp Asp Trp Ser Arg Leu Asn Asp Ser Asp lie Asp Ser Gly Ser
500 505 510
agt taa 1542 Ser
〈210〉 4 <211> 513 〈212〉 PRT <213〉人工序列
<220>
〈223〉角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體。 <400〉 4Met Lys 1
Thr Ser Leu Ser Cys Val Leu Leu Trp Ala Gly
Ala
Ser
Thr Arg Gin 35 lie
Ser 20 Lys
Leu 5
Tyr Glu Ser Ser
Lys Asp 50 Thr Gly 65
Cys Thr Ser Ser
Leu Cys
Val Gly lie
Pro
Trp Lys
Thr
lie 55 Gly
Arg
40
Gly
Leu
Phe 25 Asp
Cys
Gly
Leu
10
Leu
Met Gin 100
Gin Cys
Cys 85
Trp Ser Asn
Cys 70
Asp Tyr Lys Ser
Asp Cys Pro
Ala 105
Asp Pro Ala Ala 115
Gly Trp Asn Trp
Glu 90
Ser Thr Lys Gly
Val
Ser
Gly
Thr
75
Cys
Tyr Glu 130
Gin lie Pro Leu Gly 145
Leu Asp Pro Thr
Lys 110
Asn Ser Ser His Ala 120
Arg Pro Cys Gly
Gin
Asp
Pro
60
Phe
Asp
Glu
Arg
Pro
45
Leu
Cys
Pro
Leu
Arg
30
Lys
Asp
Gly
Gly
Ala
15
Gin
Cys
Lys
Asp
Trp 95
Val Ser Val
Val
Ser
Thr
Asp
Gly
80
Gly
Pro
Gin 135
Tyr Ser His lie
Thr Val Gly Tyr 125
Met Lys Pro Ser
Tyr 150
Phe Arg Leu Ser
Thr 165
Asp Val Ser Ala
Thr Leu Tyr Gly 180
lie Ala lie Gly
Pro 170 Lys
Phe 155 Met
Asn
Thr 140
Phe Ala Phe Ser
Gin Val Trp 195
Pro Thr Phe Ser
Thr Arg 210 Glu Phe 225
Gly Val
Phe Glu Ala Asp
lie
Asp 245 Phe
Leu 230 Trp
Asn 215
Val
Glu Asn
Gly 200 Leu
Thr
Tyr
Tyr
lie 185
Trp Ala Met Asn
Asp Thr Glu Arg
Gin
Pro 190 Pro
Thr 175 Gly
Gly
Ala
Phe
Pro
Lys Met
Asp
Met 235 Ala
Glu 220 Ala
Asp
Asp 205
Ala Ala Gin
Val 250
Asn Leu Leu
Asn Asp Lys
Asp
Tyr
Gly 255 Leu
Leu 160 Gly
Val
Pro
Asp
Asp 240 Gly
Ser Val Glu Asp Phe Asp Asn Tyr Val Asn Leu Leu Lys Arg Leu Arg
260 265 270
Ala Arg Leu Asn Ser lie Gly Val Pro Lys Gly Leu Ser lie Thr Leu Pro
Pro 305 Trp
Ala 290 Tyr
275
Ser
Tyr Asp Asp Ser Thr
lie Asn
Phe
Ser 385 Ala
Thr 370 Gly
Pro 355 Met
Asp Glu Val
Val Ser
Asn
Asp 465 Asn
Phe
Ser
Glu 450 Gly
Tyr
Asp
Trp 435 Arg
Trp Tyr
Val
Asn Leu Thr
Glu 340 Glu
Lys Gly Asn
His Glu lie
Ala 420 Asp
Phe
Val 325 lie
Arg
Asp
Gly
Val 405 Ala
Leu Thr
Asp
Trp 500
Phe 310 Gin
Glu
Ser Thr Cys Leu Gly Thr Leu lie
Asp 485 Ser
Lys 470 Leu
Leu 295 Asn
Ser
Glu
280
Lys Gly Phe Asp
Val Met Thr Tyr 315 Tyr
Leu Gly Ala
Val Asn
Pro
Gly 390 Gin
Val
Ser 375 Ser
Leu 360 Cys
Leu 345 Gly
Met
Pro 330 Lys
Cys Thr
lie lie Asn
Glu
Lys
Gly 455 Ser
Pro
lie
Thr 440 Val
Val 425 Leu
Ala
Gly
Asn 410 Thr
Arg Leu
Trp Asn
Met
Asp 505
Thr 490 Ser
lie 300 Asp
285
Val Asn Leu Glu
lie His Gly Val 320 Thr
Ala His Ala
Leu Leu Trp Leu Gly Phe
Ala
Thr 395 Gly
Trp
Ala Met
Met Val Trp Leu Ala Asp
Thr 475 Gly
Gly 380 Pro
Ala
Asp
Lys
Ala 460 Gly
Tyr 365 Cys
Thr
Val 445 lie
350 Gly
His 335 Asn
Thr Val
Asn 430 Asn
Thr 415 Gin
Cys Phe Gly
Asp lie Asp Ser 510
Asn
Arg Ser Glu Phe Ser Gly Val Leu
Ser 400 Thr
Trp Tyr Ala
Asp Leu Asp Arg Pro Thr
Ser 495 Gly
Tyr 480 Ala
Ser
<210> 5
〈211> 30
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220>
<223>用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物PM1 。 〈400〉 5
gaccggaatt cagcacgagg caaaagctct 30
〈210〉 6 〈211〉 34 <212〉腿 〈213〉人工序列
〈220>
<223〉用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物PM2。 〈400〉 6
ccagcggccg cttaactgct tcctgaatcg atgt 34
<210> 7 <211> 30 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
〈223>用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物PX。 〈400〉 7
tgccgcaggg gcgctcgcac tgcgggaccg 30
〈210〉 8
〈211〉 24
〈212> DNA <213〉人工序列
〈220>
〈223〉用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物PY。 <400> 8
ccgcagtgcg agcgcccctg cggc 24
<210〉 9 <211> 22 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220>
〈223〉用于鑒定角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物Sl 。 <400> 9
aaagacactg gtgtcggcat ct 2權(quán)利要求
1、角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體，其特征在于角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的氨基酸序列如下所示MKTSLSCVLLWAGLAVAASSYESSFLVQARQSTRQKLWTRDDSDPKCTKDIPCKIGCCGPLDKDTGVGICGLGPTFCGDGCTSSCDYKSECDPGWGMQWSNASTKGKEVSVPQCDPAANSSHARTVGYYEGWNWQRPCGTMKPSQIPLGYYSHIFFAFSLLDPTTFRLSPMDTETGTLYGDVSAIKNRQPGVQVWIAIGGWAMNDPGPTRPTFSNLAKDEAAQDEFFEALVTFMMANDYDGVDIDWEYPVADDRGGSVEDFDNYVNLLKRLRARLNSIGVPKGLSITLPASYWYLKGFDIVNLEPYVDFFNVMTYDIHGVWDSTVQSLGPYAHAHTNLTEIEEALKLLWRNNINPERVNLGLGFYGRSFTMKDPSCMAAGCEFSSGGNGGSCTGTPGVLSAHEIVQIINNGATVTTDEVAAVEIVTWDTNQWVSWDSTKTLAMKVNYANERCLGGVMVWAIDLDDGTLIKSLADTGRPTYNYLTDLPWMTGCFGSAFDDWSRLNDSDIDSGSS。
2、角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因，其特征在于角毛殼菌幾丁 質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因序列如下所示ATGAAGACGTCTCTGAGCTGCGTCTTGCTCTGGGCTGGGCTGGCCG TGGCCGCGTCCAGCTATGAGTCTAGTTTCCTCGTCCAAGCCCGCCAGAGCAAGGATATTCCGTGCAAGATCGGGTGCTGTGGGCCATTAGACAAAGAC ACTGGTGTCGGCATCTGCGGCTTGGGACCAACCTTCTGCGGCGACGGGTGCAGTGGTCCAACGCATCGACGAAGGGCAAGGAGGTGTCGGTCCCGCACGTTTTCAAACCTGGCCAAGGACGAGGCGGCGCAGGACGAGTTCTTCGAGGCCCTGGTCACTTTCATGATGGCCAACGACTACGACGGTGTCGATATCGACTGGGAATATCCCGTCAGCCGACGATGAGGTGGCAGCGTCGAGGACTTTGATAACTACGTCAACCTGCTCAAGCGCCTACGCGCGCGCCTCAACAGCATCGGCGTGCCGAAGGGCCTGTCTATCACGCTGCCCGCGTCGTACTGGTAACGGCGCGACGGTGACCACGGACGAAGTGGCCGCCGTGGAGATTGTCGGTTGTTTCGGATCCGCGTTTGACGACTGGTCGAGACTGAATGACTCCG ACATCGATTCAGGAAGCAGTTAA。
3、角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因的制備方法，其特征在于角 毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因按以下步驟制備一、 提取角毛殼菌總RNA:二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；三、 克隆步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化￡.0 /^]^109感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95。C預(yù)變性10min， 94。C變性30s、 50。C退火30s、 72。C延伸90s、共 35個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min;五、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-W/5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 A: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20拜ol/L上游引物PMl、 lpL濃度為20(xmol/L下游引物PX、 0.25^iL高信 度擴(kuò)增酶i>o6eWDNApolymerase、 l(oL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94。C變性30s、 57.6。C退火30s、 72。C延伸lmin,共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PM1 的基因序列為 5，-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物PX的基因 序列為5'-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3，；六、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-A/5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5pL lOxpyrobest buffer、 4jiL dNTP、 lj^L濃度 為20pmol/L上游引物PY、 1^iL濃度為20^imol/L下游引物PM2、 0.25髙信 度擴(kuò)增酶iVoZ^/DNApolymerase、 lpiL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94""C變性30s、 58.7"C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PY 的基因序列為 5'-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3，； 下游引物PM2的基因序列為 5，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3，；七、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴(kuò)增待融合片段A和B，然后進(jìn)行 融合PCR:由5pL lOxpyrobest buffer、4pL dNTP、0.25pL高信度擴(kuò)增酶i^ra6eW DNA polymerase、 lpL濃度為lOng/^L的突變擴(kuò)增待融合片段A、 1^L濃度為 10ng/^iL的突變擴(kuò)增待融合片段B和余量的ddH20組成的體積為50mL的融合 PCR反應(yīng)體系先進(jìn)行94"C變性30s、 57。C退火2min、 72。C延伸3min， 8個(gè)循 環(huán)；然后加入lpL濃度為20|imol/L上游引物PM1和l^iL濃度為20pmol/L下 游引物PM2，再進(jìn)行94。C變性30s、 57。C退火30s、 72。C延伸5min， 20個(gè)循 環(huán)；純化、回收，即得到角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體基因的制 備方法，其特征在于步驟二按以下步驟實(shí)施a、 將5jiL角毛殼菌總RNA、 8pL RNase-free H20和2pL引物Oligod!gT 混勻后置于7(TC的環(huán)境中5min，然后放于冰上；b、 將5nL 5xMLV Buffer、 1.25^L dNTPmix、 0.6iiL鐵調(diào)節(jié)蛋白、lpL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和2.5|iL ddH20混合；c、 將a步驟和b步驟得到反應(yīng)體系混合，再置于42r環(huán)境中反轉(zhuǎn)錄lh;d、 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25^L，由2pL 10mM dNTP、 2pL 25mMMgCl2、 5U ￡x Taq DNA聚合酶lpL、 10pM上游引物PM1 、 10pM下游引物PM2、 2pL步驟c反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和余量的ddH20組成，PCR反 應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5 min， 94。C變性20s、 57。C退火30s、 72。C延伸30s、 35個(gè)循環(huán)，72i:延伸10min;其中步驟 d 中上游弓|物 PM1 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，；下游引物PM2的基因 序列為5'-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT畫3，。
5、角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的制備方法，其特征在于角毛殼 菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體按以下步驟制備一、 提取角毛殼菌總rna:二、 分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶基因采用RT-PCR法分離角毛殼菌幾丁質(zhì)酶 基因，再以角毛殼菌幾丁質(zhì)酶cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；三、 克隆步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與pMD-18T 克隆載體連接，再轉(zhuǎn)化五.CW/JM109感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；四、 挑取陽性白斑菌落利用通用引物RV-M和M13-47進(jìn)行PCR， PCR反 應(yīng)條件為95r預(yù)變性10min， 94i:變性30s、 5(TC退火30s、 72i:延伸90s、共 35個(gè)循環(huán)，72"C延伸10min;五、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-c/n'5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 a: PCR反應(yīng)體系為50piL，由5|jL 10xpyrobest buffer、 4^iL dNTP、 1^L濃度 為2(Himol/L上游引物PMl、 lpL濃度為20iimol/L下游引物PX、 0.25|xL高信 度擴(kuò)增酶iVoZ^/DNApolymerase、 lpL突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94。C變性30s、 57.6。C退火30s、 72。C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PM1 的基因序列為 5'-GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，； 下游引物PX的基因 序列為5，-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3，；六、 以步驟四PCR擴(kuò)增產(chǎn)物pMD18-T-A/5S為模板突變擴(kuò)增待融合片段 B: PCR反應(yīng)體系為50pL，由5|iL lOxpyrobest buffer、 4pL dNTP、 lpL濃度 為20^imol/L上游引物PY、 1^iL濃度為2(Vmol/L下游引物PM2、 0.25高信 度擴(kuò)增酶尸yo6eWDNApolymerase、 1^L突變擴(kuò)增模板和余量的ddH20組成； PCR反應(yīng)條件為94。C變性30s、 58.7'C退火30s、 72"C延伸lmin，共25個(gè)循 環(huán)；其中上游引物 PY 的基因序列為 5，-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC-3，；下游引物PM2的基因序列為 5 ，畫CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3';七、 用瓊脂糖凝膠電泳純化回收突變擴(kuò)增待融合片段A和B，然后進(jìn)行 融合PCR:由5[iL lOxpyrobest buffer、4joL dNTP、0.25(iL高信度擴(kuò)增酶/Vra&W DNApolymerase、 lpL濃度為10ng/^iL的突變擴(kuò)增待融合片段A、 lpL濃度為 10ng/pL的突變擴(kuò)增待融合片段b和余量的ddH20組成的體積為50hL的融合 PCR反應(yīng)體系先進(jìn)行94。C變性30s、 57。C退火2min、 72'C延伸3min， 8個(gè)循 環(huán)；然后加入lpL濃度為20pmol/L上游引物PM1和lpL濃度為20jmiol/L下 游引物PM2，再進(jìn)行94t變性30s、 57t:退火30s、 72。C延伸5min, 20個(gè)循 環(huán)；八、 將步驟七得到的基因片段與真核表達(dá)載體pPIC9K重組構(gòu)建重組表達(dá) 質(zhì)粒pPIC9K-W。SD，然后采用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到真核表達(dá)宿主菌畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于MD平板培養(yǎng)基在3(TC條件下培養(yǎng)2 3天，之 后將MD平板培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化菌落分別點(diǎn)種到MM和MD平板培養(yǎng)基的 相應(yīng)位置上在3(TC條件下培養(yǎng)2~3天，并根據(jù)菌落在MM平板上的生長情況 鑒定轉(zhuǎn)化子的表型；九、 選擇Mnt+型轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)挑選Mut+型轉(zhuǎn)化子單菌落置于裝 有25mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中在28~30°C 、 250 300 r/min的條件下 培養(yǎng)至006()。 = 2~6，然后在室溫、1500 3000g的條件下離心5min，收集菌體 用BMMY重懸菌體使OD6QQ =0.9~U;將BMMY重懸菌液用雙層紗布或粗棉 布封口放置于28 30°C、 250~300 r/min的環(huán)境中繼續(xù)生長，每隔24h向培養(yǎng)基 中添加濃度為100%的甲醇至菌液中甲醇的終濃度為0.5~1.0%;連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng) 120h、并在4'C、 8000 r/min條件下離心10min，得到的上清液為含有角毛殼 菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的粗酶液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的制備方 法，其特征在于步驟七得到的DNA片段純化、回收后5'末端磷酸化，再克隆 到pSIMPLE-18五coRV/BAP載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到陽性重組 克隆。
7、 用于制備角毛殼菌幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體的引物，其特征在于引 物的基因序列為PM1: 5'國GACCGGAATTCAGCACGAGGCAAAAGCTCT-3，， PM2: 5 ，-CCAGCGGCCGCTTAACTGCTTCCTGAATCGATGT-3 ，， PX: 5 ，-TGCCGCAGGGGCGCTCGCACTGCGGGACCG-3'， PY: 5，-CCGCAGTGCGAGCGCCCCTGCGGC誦3'。
全文摘要
角毛殼菌幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ChBD)缺失突變體及其基因和制備方法及所用引物，它涉及一種幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體及其基因和制備方法及所用引物。本發(fā)明為幾丁質(zhì)酶ChBD的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明缺失突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。本發(fā)明缺失突變體基因序列如SEQID NO3所示。本發(fā)明引物PM1、PM2、PX和PY的基因序列分別如SEQ IDNO5、6、7和8所示。本發(fā)明通過融合PCR法獲得缺失突變體基因，再通過轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)獲得缺失突變體。本發(fā)明為幾丁質(zhì)酶ChBD的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶ChBD缺失突變體。
文檔編號(hào)C12N15/81GK101353652SQ20081013711
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日
發(fā)明者謙 楊, 王艷君 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)