專利名稱：：維生素b6磷酸鹽磷酸酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的酶，即維生素B6磷酸鹽磷酸酶(vitaminB6-phosphatephosphatase)(此后稱為VB6PP)，生產(chǎn)VB6PP的方法，和利用VB6PP及能生產(chǎn)VB6PP的特定微生物的無細胞提取物從維生素B6-磷酸鹽(后文指VB6P)生產(chǎn)維生素B6的方法。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明"維生素B6"包括吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺。維生素B6是人，動物和植物和微生物營養(yǎng)的重要維生素之一。已知非特異性磷酸單酯酶如堿性和酸性磷酸酶水解各種磷酸-單酯化合物，包括VB6P,為對應(yīng)的無酯化合物[GlennandDilworth，Arch.Microbiol.126:251-256(1980)]。沒有有關(guān)除純化自人紅細胞的磷酸酶外的VB6P特異性磷酸酶的報道[Fonda，J.Biol.Chem.267:15978-15983(1992)]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供新的VB6PP，其作用于VB6P生產(chǎn)維生素B6。本發(fā)明VB6PP具有如下物化性質(zhì)a)分子量29，000±5,000(由具有分子量29,000±5,000的單體組成)b)輔助因子(Co-factor):Mn2+，Mg2+，Co2+,Sn2+，或Ni2+c)底物特異性對吡哆醇5'-磷酸鹽(下文指PNP)，吡哆醛5'-磷酸鹽(下文指PLP)和吡噴胺5'-磷酸鹽(下文指PMP)有活性d)最適溫度在pH7.5下30-40°Ce)最適pH:7.0-8.0.本發(fā)明另一目的是提供生產(chǎn)如上所述新的VB6PP的方法，其包括在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基通氣(aerobic)條件下，培養(yǎng)能生產(chǎn)具有上述物化性質(zhì)的VB6PP的屬于中華根瘤菌(5V"or/^o&Mm)屬微生物，破碎微生物細胞，從微生物的破碎細胞的無細胞4是取物分離并純化VB6PP。本發(fā)明另一方面是提供從VB6P生產(chǎn)維生素B6的方法，其包括將VB6P與(i)在Mn2+，Mg2+,Co2+，Sn2+,或N嚴存在下的如上所述VB6PP接觸，或(ii)屬于中華根瘤菌屬微生物的無細胞提取物，所述微生物能生產(chǎn)具有上述物化性質(zhì)的VB6PP，在(i)和(ii)每一情況下，從反應(yīng)混合物分離所得的維生素B6。實施例制備的VB6PP純化樣品的物化性質(zhì)如下1)酶活性在二價金屬離子存在下，即Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn"或Ni2+,本發(fā)明新的VB6PP催化VB6P水解為維生素B6，參照下式VB6P+1120^維生素B6+H3P04如下進行標(biāo)準酶檢測:總體積125pl的基本(basal)反應(yīng)混合物，組成為50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)，lmMMnCl2,1.35pg酶，水加至總體積118.5^,37。C下溫育1分鐘。然后6.5^1800uMPNP溶液加入得到40jiM終濃度，全部在37。C溫育。溫育30分鐘后，反應(yīng)混合物冰浴冷卻。如下兩種方法測定活性。(i)生產(chǎn)的維生素B6按照Osbone和Voogt的采用卡拉斯伯糖酵母Ofocc/wram7ce5c"^sZwge"W;)ATCC9080,通過濁度方法進行孩t生物檢觀'J[TheAnalysisofNutrientsinFoods,AcademicPress，London,224-227(1978)]。一個單位酶活性定義為在如上的沖企測系統(tǒng)中，30分鐘合成lpmole維生素B6的酶量。(ii)從推定底物釋放的磷酸鹽采用Gelad叩oulos等的malachitegreen方法進4亍比色4企測[AnalyticalBiochemistry192:112-116(1991)]，此方法用于測定底物特異性和米氏常數(shù)(Km)以及最大速度(maximumvelocity)(Vmax)值。Lowry方法[Lowryetal.,J.Biol.Chem.193:265-275(1951)]測定蛋白濃度。2)分子量酶分子量(下文指MW)采用凝膠過濾柱HiPrepSephacrylSJ00HR(AmershamPharmaciaBiotech(Uppsala,Sweden)觀'J定。與MW標(biāo)記蛋白相比較酶表觀MW計算為29,000土5，000:凝膠過濾標(biāo)準試劑盒，Bio-RadLaboratories(Bio-LadLaboratories,Richmond,California,USA);曱狀&泉;求蛋白(MW670,000)，牛血清丙種(gamma)球蛋白(MW158,000)，雞卵白蛋白(MW44,000),馬肌紅蛋白(MW17,000)和維生素B12(MW1,350)。與標(biāo)記蛋白相比較SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(下文指SDS-PAGE)得到MW為29，000±5,000的單一條帶采用LowMWElectrophoresiscalibrationkit(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden);牛血'清白蛋白(MW67,000)，卵白蛋白(MW43,000)，碳酸酐酶(MW30,000),大豆胰蛋白酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor)(MW20,100)和a-乳白蛋白(MW14,400)。這表明酶由單體單位組成。需要的話，酶MW值(MW29,000士5，000)可采用如下方法分別準確測定，即凝膠過濾柱方法和SDS-PAGE方法。3)輔助因子研究了酶轉(zhuǎn)化VB6P為維生素B6對輔助因子的需要。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二價金屬離子即Mn2+,Mg2+,Co2+，Sn"或N產(chǎn)可以作為此轉(zhuǎn)化的輔助因子。表1金屬鹽相對活性(％)無0MnCl2100MgCl288CoCl265SnCl211NiCl274)底物特異性酶底物特異性如l)使用相同方法測定，除使用不同底物溶液(160nM,反應(yīng)混合物終濃度)。表2底物相對活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>5)最適溫度酶活在5-45。C下測定。酶活性最適溫度是30-40°C。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6)最適pH酶活性與反應(yīng)混合物pH值的關(guān)系采用如l)相同酶4企測方法測定。酶反應(yīng)最適pH為7.0-8.0。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7)溫度穩(wěn)定性酶溶液用不同溫度處理IO分鐘，殘余酶活采用如上1)相同酶#:測方法測定。發(fā)現(xiàn)酶活性隨溫度提高降低，在50。C完全失活。表5溫度rc)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7)米氏常數(shù)(Km)和最大速度(Vmax)值酶Km值采用PNP和PLP作底物測定。基本酶4企測方法與l)相同，但是底物濃度不同。Km和Vmax值對PNP分別是330|iM和92nmol/min/mg。另一方面，Km和Vmax值對PLP分別是1.22mM和46nmol/min/mg。Km和Vmax值基于已知Michaelis-Menten方程計算。Km是得到酶反應(yīng)50%Vmax時的底物濃度。這些值指示涉及底物的酶的催化性質(zhì)。8)純化過程VB6PP純化原則上可采用已知純化方法的任意組合，如沉淀劑分級，如硫酸銨，聚乙二醇等，離子交換層析，吸附層析，疏水作用層析，凝膠過濾層析，凝膠電泳和鹽析和透析。如上所述，本發(fā)明VB6PP可采用在通氣條件下水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中采用合適的微生物培養(yǎng)制備，破碎微生物并從微生物破碎細胞的無細胞提取物中分離和純化VB6PP。本發(fā)明微生物是本文所述能生產(chǎn)維生素B6的屬于中華根瘤菌屬的微生物。本發(fā)明可用微生物包括S.meliloti，費氏中華根瘤菌(S.fredii)，新疆中華根瘤菌(S.xinjiangense),薩赫勒中華才艮瘤菌(S.saheli),S.terangae和S.medicae。所述微生物的突變體也可用于本發(fā)明。優(yōu)選菌抹是5^oWn'zo&wmme/纟/o"。最優(yōu)選用于本發(fā)明的具體菌林，作為Sz'"oWn'zo&wmme/"oriIFO14782,寸呆藏在發(fā)酵研究所，Osaka,17-85,Juso-honmachi2-chome，Yodogawa-kuOsaka523-8686Japan,并按照布達佩斯條約保藏于DSM，德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungVonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，MascheroderWeglb,D-3300Braunschweig,Germany,DSMNo.10226。微生物可培養(yǎng)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，其中可含有糖，如葡萄糖和蔗糖，醇如乙醇和甘油，脂肪酸如油酸和石更脂酸，或其酯，或油如菜子油(rapeseedoil)和豆油作碳源；尿素，硫酸銨，氯化銨，硝酸鈉，蛋白胨，氨基酸，玉米漿(cornsteepliquor),麩，酵母提取物等作氮源；硫酸鎂，硫酸錳，硫酸鐵，氯化鈉，碳酸鉤，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，等無機鹽；麥芽提取物，肉提取物等作其它營養(yǎng)源。培養(yǎng)基的pH為約5到9，優(yōu)選從約6到8。適宜的培養(yǎng)溫度范圍為約l(TC到約45°C,優(yōu)選約25。C到約40°C。培養(yǎng)時間通常是約1到約5天，優(yōu)選約1到約3天。通氣和攪拌培養(yǎng)通常會得到有利結(jié)果。培養(yǎng)后從微生物分離和純化VB6PP的實施方式如下從液體培養(yǎng)基通過離心或過濾收獲細胞。用水，生理鹽水或具有適宜pH的緩沖液洗滌收獲的細胞。洗滌的細胞在含EDTA/溶菌酶的緩沖液進行預(yù)處理，并通過勻漿器，超聲器，F(xiàn)renchpress等等破碎得到破碎細胞溶液。從破碎細胞的無細胞提取物分離純化VB6PP。本發(fā)明得到的VB6PP可用于從VB6P生產(chǎn)維生素B6的催化劑。VB6PP催化的VB6P水解為維生素B6可便利的在二價金屬離子存在下的溶劑中，在pH值約5.5到約9.0進行15分鐘到5小時。更優(yōu)選的pH范圍從約6.5到約8.0。作為溶劑，任何可維持pH約5.5到約9.5的緩沖液都是適合的，如Tris-HCl緩沖液，Tris-馬來酸鹽(maleate)緩沖液，Bis-tris緩沖液,HEPES(DojindoLaboratories,Kumamotoprefecture,Japan)緩沖液等。優(yōu)選的pH范圍進行反應(yīng)是在約15。C到約45。C,更優(yōu)選的溫度范圍約25。C到約40°C。當(dāng)pH和溫度設(shè)定為約6.5到約8.0和約37。C時反應(yīng)通常得到最佳結(jié)果。溶劑中VB6P濃度取決于其它反應(yīng)條件，但通常是liaM到lM，優(yōu)選的從lOiaM到100mM。適合存在于反應(yīng)混合物中的二價金屬離子量與其它反應(yīng)條件有關(guān)，但通常是在各種情況下獨立地為約lpM到100mM。反應(yīng)中VB6PP也可用于采用合適載體的固定狀態(tài)。可以采用本領(lǐng)域已知的任何固定酶方法。如可將酶直接結(jié)合到具有一或多個功能基團的樹脂的膜，顆粒等，或通過具有一或多個功能基團的橋連化合物(bridgingcompounds)結(jié)合到樹脂，如戊二醛。這樣的酶固定方法可參見MicrobialEnzymesandBiotechnology,ElsevierAppliedScience(1990)2nd版；Ed.FogartyandKelly)369-394頁實施例。具體實施例方式如下的實施例進一步說明本發(fā)明。實施例1:制備VB6PP所有操作4。C下進行，除非特別指出，緩沖液是10mMTris-HCl緩沖液(pH7.5),其中含有1mM二硫蘇糖醇，0.1mM苯基曱基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonylfluoride)和15%蔗糖。(1)培養(yǎng)SinorhizobiummelilotiIFO14782(DSMNo.10226):微生物培養(yǎng)在種子培養(yǎng)基中，其中含有1%葡萄糖，0.5%蛋白胨(NihonPharmaceuticalCo.，Osaka,Japan),0.2%酵母提取物(DifcoLaboratories,Detroit,Michigan,USA)，0.05%MgS04.7H20，0.001%MnS04.5H2O和0.001%FeS04.7H20，28"下17小時。將種子培養(yǎng)基移到500ml燒瓶中，其中含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基，其中含有4%葡萄糖，2%蛋白胨，0.2%酵母提取物，0.05%MgS04'7H2O,0.05%MnS04'5H2O，0.001%FeS04'7H20和一滴消泡劑CA115(NipponYushiCo.,Ltd.,Tokyo,Japan)。燒瓶搖床上28。C下振蕩培養(yǎng)。72小時培養(yǎng)后，從3.4升培養(yǎng)基通過離心，10，400xg下10分鐘得到59.5g濕細胞。(2)EDTA-溶菌酶處理進行溶菌酶/EDTA處理到除去細胞周質(zhì)部分(periplasmicfraction),其是參照Glenn等方法，[J.Gen.Microbiol.112:405-409(1979)]。濕細胞(59.5g)懸浮在340ml的30mMTriHCl緩沖液(pH8.0)中，其中含有20%蔗糖和1mMEDTA。170mg溶菌酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis,Missouri,USA)室溫下攪拌加入到懸浮液，攪拌持續(xù)20分鐘。10,400xg下離心10分鐘回收細胞(3)制備無細胞提取物細胞懸浮在340ml緩沖液中，以800kg/cn^經(jīng)過弗氏壓碎器(Frenchpressurecell)。處理后，34,000xg下離心90分鐘勻漿物。結(jié)果，得到280ml無細胞提取物，其中含8,570mg蛋白。(4)QSepharoseHP層析:前述步驟得到的無細胞提取物(280ml)上柱到QSepharoseHP柱(直徑44mm,高度17cm;AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden),其用緩沖液平衡。用同樣的緩沖液沖洗柱后，酶在0.4MKC1中洗脫。收集活性部分(350ml)，并對4升緩沖液透析過夜。(5)QSepharoseHP再層析前述步驟得到的透析樣品(5,700mgprotein)用QSepharoseHP柱(直徑44mm,高度12.5cm)再次層析，柱用緩沖液平衡。用同樣的緩沖液沖洗柱后，酶用具有線性梯度KCl(0-0.5M)濃度0.25MKC1洗脫。收集活性部分，并對4升緩沖液透析過夜。(6)EtherToyopearl層析:加入硫酸銨到前述步驟得到的透析酶溶液(316mg蛋白)，以得到濃度為1.3M。所得樣品上樣到EtherToyopearl柱(直徑2.5，高度15cm;TosohCo.，Tokyo,Japan),其用含1.3M硫酸銨緩沖液平衡。沖洗含1.3M硫酸銨緩沖液后，酶用具有硫酸銨線性梯度(1.3-0.5M)的濃度0.86M辟u酸4妄洗脫，收集活性部分。(7)ResourceISO層析:加入硫酸銨到前述步驟得到的活性酶溶液(74mg蛋白)，得到濃度1.2M。然后活性酶溶液上柱到ResourceISO6ml柱(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden),其用含1.2M石克酸銨的緩沖液平衡。用1.2M石克酸銨沖洗緩沖液后，用0.74M磁u酸銨線性梯度(1.2-0.5M)洗脫酶.收集活性部分，并對4升緩沖液透析過夜。(8)HiPrep16/60SephacrylS-200HR柱前述步驟得到的透析樣品通過超濾;農(nóng)縮(CentriplusYM-10然后是MicroconYM-10concentrators,AmiconInc,，Beverly,Massachusetts,USA)到300jil。樣品(4,2mg蛋白)上柱到HiPrep16/60SephacrylS-200HR柱(直徑16mm，高度60cm;AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden),其用50mMTris-HCl(pH7.5)含15%蔗糖，1mMDTT和150mMKCI平衡。用70.5ml緩沖液洗脫酶。酶在SDS-PAGE分析上得到均一的帶。表6:純化酶步驟總結(jié)步<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(9)反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定總體積5ml反應(yīng)混合物，組成為50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)，640(iMPNP,lmMMnCl2和108嗎酶，于37。C溫育。溫育l小時后，反應(yīng)混合物沸水浴3分鐘，離心除去所得反應(yīng)混合物中變性蛋白。上清上牙主到AmberliteCG-120(RohmandHaasCompany,Philadelphia,Pennsylvania,USA)柱(直徑16mm，長度11cm)。柱用40ml水沖洗，并用5%銨溶液展開。匯集銨溶液洗脫的級分，并減壓濃縮。殘余物溶解在少量曱醇中，在高壓液相層析分析，分析條件柱，CapcellpakC18SG120柱(直徑4.6mm，高度250mm,ShiseidoCo.,Tokyo,Japan);流動相，0.1M高氯酸鈉，0.1M磷酸鉀和2。/。乙腈(pH3.5);流速，1ml/分鐘；設(shè)定UV探測器為292nm。結(jié)果，與標(biāo)準吡。多醇樣品相比較，樣品證實為吡口多醇。權(quán)利要求1.維生素B6磷酸鹽磷酸酶，其具有下述物化性質(zhì)a)分子量29,000±5,000(由分子量29,000±5,000的單體組成)b)輔助因子Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+或Ni2+c)底物特異性對吡哆醇5′-磷酸鹽，吡哆醛5′-磷酸鹽和吡哆胺5′-磷酸鹽有活性d)最適溫度在pH7.5下30-40℃e)最適pH7.0-8.02.權(quán)利要求1的維生素B6磷酸鹽磷酸酶，其中得自能生產(chǎn)所述的維生素B6磷酸鹽磷酸酶屬于中華根瘤菌屬的微生物。3.權(quán)利要求2的維生素B6磷酸鹽磷酸酶，其中所述微生物是&woW^o6/t/mme/"o"IFO14782(DSMNo.10226)或其突變體。4.生產(chǎn)權(quán)利要求1的維生素B6磷酸鹽磷酸酶的方法，其包括在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基通氣條件下，培養(yǎng)能生產(chǎn)具有上述物化性質(zhì)的維生素B6磷酸鹽磷酸酶的屬于中華根瘤菌屬微生物，破碎微生物細胞，從微生物的破碎細胞的無細胞提取物分離并純化維生素B6磷酸鹽磷酸酶。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述《效生物是AwoW^oZj/mwme/z7o"IFO14782(DSMNo.10226)或其突變體。6.權(quán)利要求4的方法，其中進行所述發(fā)酵的pH范圍為5.0-9.0，溫度范圍10°C-45°C，進行l(wèi)-5天。7.權(quán)利要求4的方法，其中進行所述發(fā)酵的pH范圍為6.0-8.0，溫度范圍25°C-40°C,進行1-3天。8.從維生素B6磷酸鹽生產(chǎn)維生素B6的方法，其包含在Mn2、Mg2+,Co2+，Sn"或N產(chǎn)存在下，將維生素B6磷酸鹽與權(quán)利要求1的維生素B6磷酸鹽磷酸酶接觸，并從反應(yīng)混合物分離所得的維生素B6。9.權(quán)利要求8的方法，其中維生素B6磷酸鹽磷酸酶得自&"oW'zo&wwwe/z7oriIFO14782(DSMNo.10226)或其突變體。10.權(quán)利要求8或9的方法，其中進行所述發(fā)酵pH范圍為5.5-9.0,溫度范圍15°C-45°C，進行15分鐘-5小時。11.權(quán)利要求8-10的方法，其中進行所述發(fā)酵pH范圍為6.5-8.0，溫度范圍25°C-40°C，進行30分鐘-3小時。12.從維生素B6磷酸鹽生產(chǎn)維生素B6的方法，其包括將維生素B6磷酸鹽與屬于中華根瘤菌屬微生物的無細胞提取物接觸，其中所述微生物能生產(chǎn)權(quán)利要求1的維生素B6磷酸鹽磷酸酶，從反應(yīng)混合物分離所得的維生素。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述微生物是&woW^oto/mme/z7orilFO14782(DSMNo.10226)或其突變體。14.權(quán)利要求12的方法，其中進行所述反應(yīng)的pH范圍為5.5-9.0，溫度范圍15°C-45°C,進行15分鐘-5小時。15.權(quán)利要求12的方法，其中進行所述反應(yīng)的pH范圍為6.5-8.0,溫度范圍25°C-40°C,進行30分鐘-3小時。全文摘要本發(fā)明涉及維生素B6磷酸鹽磷酸酶(VB6PP)，制備VB6PP的方法以及利用VB6PP從維生素B6-磷酸鹽(VB6P)和能生產(chǎn)VB6PP的特定微生物的無細胞提取物生產(chǎn)維生素B6的方法。文檔編號C12R1/01GK101386843SQ20081013200公開日2009年3月18日申請日期2002年6月14日優(yōu)先權(quán)日2001年6月20日發(fā)明者市川敬子,星野達雄,田副正明申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司