專利名稱：一種乳制品中抗生素水解殘留物的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)方法，尤其是指乳制品中牛奶分解劑及抗生素水解 殘留物的檢測(cè)，具體為一種市售牛奶抗生素分解劑作用于抗生素后水解殘留物 的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
由于國(guó)標(biāo)中規(guī)定原料奶收購(gòu)時(shí)必須"無(wú)抗"， 一些不法奶站便人為使用抗生 素酶水解乳中殘留的抗生素，這類水解酶制劑及酶水解產(chǎn)物沒(méi)有做過(guò)相關(guān)的安 全性評(píng)價(jià)，對(duì)于消費(fèi)者存在直接或間接的安全隱患。奶牛在飼養(yǎng)過(guò)程中，用于預(yù)防和治療作用的藥物主要是抗生素類藥物。但 是這類藥物在停藥后一段時(shí)間內(nèi)，在分泌的牛奶中仍有殘留。使用抗生素殘留 超標(biāo)的牛奶，不僅會(huì)給產(chǎn)品的生產(chǎn)帶來(lái)影響，產(chǎn)品質(zhì)量無(wú)法保障，而且對(duì)消費(fèi) 者的健康存在眾多不利影響。國(guó)外很多國(guó)家都對(duì)不同種類抗生素的最大殘留量(MRL)做了具體規(guī)定，明確要求抗生素殘留超標(biāo)的牛乳嚴(yán)禁收售。國(guó)內(nèi)多數(shù) 乳品企業(yè)對(duì)于不同程度抗生素殘留超標(biāo)的牛乳釆取降價(jià)收購(gòu)和拒收的原則。出 于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，為謀求經(jīng)濟(jì)利益，市場(chǎng)上出現(xiàn)了人為使用一些生物制劑去 降解牛乳中殘留抗生素的"無(wú)抗奶，即生產(chǎn)了"人造"無(wú)抗奶。從2005年至今就有 數(shù)家公司公開出售分解牛乳中殘留抗生素的酶制劑。市售的抗生素分解劑是一 種黃色液體，其主要成份是青霉素酶，每瓶約4mL左右，在8-C-l(TC條件下放置一晚或反應(yīng)12小時(shí)，即可以使3-4噸有抗奶轉(zhuǎn)變?yōu)?人造"無(wú)抗奶。
針對(duì)高濃度的抗生素藥品，其分解產(chǎn)物的檢測(cè)方法一般有高效液相色譜法， 分光光度法；殘留級(jí)的抗生素水解殘留物的檢測(cè)則至今未有相關(guān)報(bào)道。而且， 液相色譜法或分光光度法都不利于在生產(chǎn)企業(yè)推廣應(yīng)用，設(shè)備成本大，檢測(cè)費(fèi) 用高，對(duì)檢測(cè)人員的要求也高，不利于在收奶和產(chǎn)品檢測(cè)中推廣應(yīng)用。
由于殘留在原料乳中的抗生素經(jīng)牛奶分解劑作用后，僅僅是其內(nèi)部P _內(nèi)酰 胺環(huán)的一個(gè)N-C鍵的斷開，因而其抑菌特性依然存在。利用這個(gè)特性，在這種"人 造"無(wú)抗乳中添加一定量的發(fā)酵劑，在43'C下恒溫培養(yǎng)， 一定時(shí)間后根據(jù)酸度的 變化大小就可以判斷出原料乳是否是"人造"無(wú)抗奶或產(chǎn)品。
由于乳制品中青霉素類抗生素酶解殘留物的檢測(cè)方法未見報(bào)道，為了確保 原奶及其產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，本領(lǐng)域急需一種可以檢測(cè)乳和乳制品中牛奶分解 劑及抗生素水解殘留物的方法。
發(fā)明內(nèi)容
為了滿足乳品企業(yè)及質(zhì)量監(jiān)控檢測(cè)機(jī)構(gòu)的需求，確保乳原料和乳制品的質(zhì) 量安全和消費(fèi)者的健康，本發(fā)明人開發(fā)了一種抗生素水解殘留物的檢測(cè)方法， 尤其是指乳制品中抗生素酶解殘留物的檢測(cè)方法，該方法能夠有效地檢測(cè)乳制
品，尤其是乳中殘留的獸藥抗生素水解產(chǎn)物殘留物。
本發(fā)明的目的在于提供一種原料乳及乳制品中抗生素水解殘留物的檢測(cè)方 法，該方法采用殘留物^t發(fā)酵的影響來(lái)確認(rèn)樣品中是否含有的抗生素水解殘留 物，可以有效地檢測(cè)乳和乳制品中殘留的抗生素水解殘留物，并可根據(jù)酸度的 相對(duì)變化值來(lái)定量其濃度范圍。
本發(fā)明提供了一種殘留的抗生素水解產(chǎn)物的檢測(cè)方法，其過(guò)程包括將待測(cè)的乳制品和作為空白對(duì)照的無(wú)抗奶樣品殺菌處理，優(yōu)選用巴士殺菌法殺菌，冷
卻后加入發(fā)酵劑，測(cè)定其起始的發(fā)酵液pH值，然后在43。C下保溫1小時(shí)，測(cè)定發(fā) 酵液的pH值，計(jì)算發(fā)酵前后pH值的變化與無(wú)抗奶對(duì)照樣變化值的差值，當(dāng)差值 大于等于0.03時(shí)，判定該樣品為陽(yáng)性樣品，即其中含有抗生素水解殘留物，為不 合格的"人造"無(wú)抗奶。
上述乳制品包括液態(tài)乳制品和固態(tài)乳制品，液態(tài)乳制品包括液態(tài)的原奶和還 原奶，固態(tài)乳制品包括奶粉等，若是固態(tài)乳制品則需要先用水還原成液態(tài)還原 奶。
上述檢測(cè)方法中采用的發(fā)酵劑為含有乳酸菌的發(fā)酵劑。 乳酸菌指發(fā)酵糖類，產(chǎn)生乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。 在其發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸的稱為同型乳酸發(fā)酵，而產(chǎn)物中除乳酸外還有較多乙 酸、乙醇、C02等物質(zhì)的稱為異型乳酸發(fā)酵。乳酸菌從形態(tài)上分類主要有球狀和 桿狀兩大類，主要包括乳酸鏈球菌(Streptococceae)和乳酸桿菌(Lactobacilleae)。 多數(shù)種可發(fā)酵乳糖，發(fā)酵后可將pH下降至6.0以下。乳酸桿菌中以乳酸桿菌屬 (Lactobacillus)最為重要。
本發(fā)明所用的發(fā)酵劑中含有的乳酸菌優(yōu)選含有乳稈菌屬、鏈球菌屬任一或 其組合的菌屬的乳酸菌，鏈球菌屬的乳酸菌優(yōu)選嗜熱鏈球菌Oftre內(nèi)oco"^ AemcpMw",乳稈菌屬的乳酸菌優(yōu)選保加利亞乳桿菌(Zfl"o6a"7/ws &w/gaWcwW。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，上述的發(fā)酵劑為含有嗜熱鏈球菌OSfreptococaw Aenwop/w7w)、保加利亞乳桿菌fla"o6a"7/w 6w/gar/cu^任一或其混合的乳酸菌 的發(fā)酵劑；更優(yōu)選為含有嗜熱鏈球菌fS^/ tococc船f/iemiop/n7一和保加利亞乳桿 菌(Xacto6ac!說(shuō)"6M/gahcwW的乳酸菌的工業(yè)發(fā)酵劑。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法中所加入的發(fā)酵劑的量為0.2-0.8U/L，以待測(cè)的乳制 品或作為空白對(duì)照樣品為基數(shù)，即每升待測(cè)的樣品溶液中加入0.2-0.8U/L，優(yōu)選 0.4-0.7U/L，更優(yōu)選加入0.6U/L;其中，所述的U為發(fā)酵劑中菌的活力單位。 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法具體的步驟包括
(1) .樣品的處理
取待測(cè)的液態(tài)乳制品樣品100ml， 75。C以上(優(yōu)選75-98。C)加熱10min; 將殺菌后的樣品冷卻備用；
若樣品為奶粉類固體或粉狀樣品時(shí)，稱取10-15g固體或者粉末狀樣品，用去 離子水溶解定容至100ml;
同時(shí)設(shè)置無(wú)抗奶為空白對(duì)照樣品，按同樣的上述方法處理待用；
(2) .發(fā)酵
在上述制備好的待測(cè)液態(tài)乳制品樣品和空白對(duì)照樣品中添加發(fā)酵劑，該發(fā) 酵劑為含有嗜熱鏈球菌fS"加ptocoa^ Aemo/^7z^ 、保加利亞乳桿菌 (IflctoZ)a"7/w 6M/gfln'cM)至少一種的乳酸菌的發(fā)酵劑，添加量約為0.4-0.7U/L， 搖勻，測(cè)定發(fā)酵前的初始pH值；
然后將樣品置入40-45。C恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵，取出冷卻；
(3) .測(cè)定pH值
待測(cè)樣品發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差，與空白對(duì)照樣品的發(fā)酵 結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差，以二者之差是否大于0.03來(lái)判定該樣品是 否為曾經(jīng)使用過(guò)抗生素的乳制品。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的
l.樣品的處理取待測(cè)的液態(tài)乳制品樣品lOOmI， 95'C加熱10min; 將殺菌后的樣品冷卻到40'C-45"C之間備用；
若樣品為奶粉類固體或粉狀樣品時(shí)，稱取13g固體或者粉末狀樣品，用去離 子水溶解定容至100ml;
同時(shí)設(shè)置無(wú)抗奶為空白對(duì)照樣品，按同樣的上述方法處理待用；
2. 發(fā)酵
在上述制備好的待測(cè)的液態(tài)乳制品樣品和空白對(duì)照樣品中添加發(fā)酵劑，例如 是經(jīng)過(guò)篩選的嗜熱鏈球菌OS^^tococc^ Awmo; /n7^)和保加利亞乳桿菌 (^"0^"7/^^/^^"力混合乳酸菌發(fā)酵劑^-1，添加量約為0.6U/L，搖勻，測(cè) 定發(fā)酵前的初始pH值；
然后將樣品置入43。C恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵，優(yōu)選0.5 — 2小時(shí)，更優(yōu)選發(fā)酵l小 時(shí)，取出冷卻，終止發(fā)酵；
3. 測(cè)定pH值
待測(cè)樣品發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH2)，與空白對(duì)照樣品 的發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH。， pHi和pH2二者之差^).03時(shí)， 即可判定該樣品為陽(yáng)性，即為"人造"無(wú)抗乳制品，即認(rèn)為待測(cè)樣品為人為添 加牛奶抗生素分解劑分解抗生素的乳制品，也就是說(shuō)，其為含有抗生素的原料 乳或用含有抗生素的原料乳生產(chǎn)的乳制品。 用計(jì)算式表示為 pHt 二pH, —pH01 (空白對(duì)照樣品發(fā)酵前后pH值之差) pH2=pH2—pHo2 (檢測(cè)樣品發(fā)酵前后pH值之差)
當(dāng)ApH, — ApH2》0.03時(shí)，判定為陽(yáng)性樣品，即待測(cè)乳制品為含有抗生素的乳制品。
上述步驟(2)中采用的發(fā)酵劑為含有的乳酸菌的發(fā)酵劑，該乳酸菌為含有 乳稈菌屬、鏈球菌屬任一或其組合的菌屬的乳酸菌。
在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，用于檢測(cè)乳中抗生素的酶解產(chǎn)物，所述的抗生素包 括e-內(nèi)酰胺類(青霉素類和頭孢類)，四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素等)， 氨基糖苷類(慶大霉素和鏈霉素等)，氯霉素類，大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素和螺旋 霉素等)。
本發(fā)明的方法可以檢測(cè)的酶解產(chǎn)物的濃度下限為10ppb。
發(fā)明方法的原理是基于抗生素及水解殘留物對(duì)微生物具有抑制作用，并利用 乳酸菌對(duì)乳的發(fā)酵特性，選取特殊的乳酸菌對(duì)樣品進(jìn)行發(fā)酵處理，跟蹤發(fā)酵過(guò) 程，根據(jù)其發(fā)酵特性來(lái)判斷樣品中有無(wú)抗生素的水解殘留物。該檢測(cè)判定方法 經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，適合乳品企業(yè)的原料奶質(zhì)量安全控制和工業(yè)原料品 質(zhì)控制及產(chǎn)品安全控制。實(shí)用性非常強(qiáng)。
本發(fā)明的大量的篩選實(shí)驗(yàn)其中較有代表性和說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下，均以業(yè) 內(nèi)普遍使用的青霉素類抗生素類為例
l.發(fā)酵劑產(chǎn)酸能力的比較，選擇最佳發(fā)酵劑
選擇目前國(guó)內(nèi)、外市場(chǎng)上發(fā)酵快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌作為發(fā)酵劑，共選擇 六種不同的市售商品，其區(qū)別在于含有不同種類和不同組合的菌屬，作為實(shí)驗(yàn) 用乳酸菌發(fā)酵劑，通過(guò)對(duì)比一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸量的多少，選出一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸能 力強(qiáng)的發(fā)酵劑。
方法
①滅菌乳的制備取無(wú)抗奶于三角瓶中，114。C滅菌15min。冷卻到45。C備用。
②樣品的制備
菌粉的添加方法
稱取0.04g菌粉，溶解于10ml滅菌乳中，充分混勻，取2.5mL接入250mL滅菌奶中。
按上述菌粉的添加方法向六個(gè)裝有滅菌奶的三角瓶中依次接入所選發(fā)酵劑。 之后于43。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于Omin、 50min、 110min、 170min測(cè)試樣品 的pH值，從而確定不同發(fā)酵劑的產(chǎn)酸能力。
對(duì)比后可以看出代號(hào)為YF-1和G-061的發(fā)酵劑在1小時(shí)后表現(xiàn)出最強(qiáng)的和 較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力；YF-1和G-061均含有嗜熱鏈球菌(5^e; tococms決"mo尸W/w^、 保加利亞乳桿菌(Xa"o6a"7/w ^/gafr/cmj至少一種。
2.產(chǎn)酸能力強(qiáng)的發(fā)酵劑對(duì)抗生素水解產(chǎn)物的感受性試驗(yàn)
根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，?yīng)選擇產(chǎn)酸能力強(qiáng)、且對(duì)抗生素水解產(chǎn)物敏感的發(fā)酵劑。即 使用上一實(shí)驗(yàn)選出的兩種產(chǎn)酸最強(qiáng)YF-1與G-061,進(jìn)行感受性實(shí)驗(yàn)。因?yàn)楸痉?法發(fā)明的意圖就是要開發(fā)快速的檢測(cè)方法，所以要選擇在最短的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出 最強(qiáng)的產(chǎn)酸性能的發(fā)酵劑。
方法
① 滅菌乳的制備
取無(wú)抗奶于三角瓶中，114。C滅菌15min。冷卻到45。C備用。
② 青霉噻唑酸鉀稀釋液的配制
精密稱取2.5g青霉素鉀于100mL容量瓶中，加入0.5mL (過(guò)量)抗生素分 解劑后用去離子水定容后搖勻，室溫放置4個(gè)小時(shí)，標(biāo)記為稀釋液①。取10ml稀釋液①于100mL容量瓶中，定容后搖勻，標(biāo)記為稀釋液②。取lmL稀釋液② 于100mL容量瓶中，用去離子水定容后搖勻，標(biāo)記為稀釋液③，其濃度為 25mg/L。
③樣品的制備 菌粉的添加方法-
稱取0.04g菌粉，溶解于10mL滅菌乳中，充分混勻，取2.5mL接入250mL
滅菌奶中。
陰性樣品的制備
將YF-1與G-061及對(duì)照(以L-812為代號(hào))三種發(fā)酵劑按上述菌粉的添加 方法分別接入到滅菌乳中，作為陰性對(duì)照。 陽(yáng)性樣品的制備
將YF-1與G-061及對(duì)照(以L-812為代號(hào))三種發(fā)酵劑按上述方法分別接 入到滅菌乳中，再分別向其中添加lml稀釋液③。三個(gè)樣品中的青霉噻唑酸鉀 濃度均為10(^g/L。分別標(biāo)記。由得出的數(shù)據(jù)曲線可以看出，YF-1對(duì)抗生素水 解產(chǎn)物的感受性強(qiáng)于G-061和L812。該YF-1為同時(shí)含有嗜熱鏈球菌 f5Vre/ fococcM51決em70/ /zr7i^)禾口保力口禾!j亞孚L桿菌(Iacfo6acz7/ws 6w/garz'cw"的發(fā)酵 劑。
3.最佳接種量試驗(yàn)
分別向滅菌奶中添加接種量為標(biāo)準(zhǔn)推薦量(0.2U/L)的1倍、2倍、3倍的YF-1， 用對(duì)照樣與標(biāo)準(zhǔn)推薦量試驗(yàn)組，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)(43'C下發(fā)酵1小時(shí))，以確定最 快速發(fā)酵的發(fā)酵劑使用劑量。
方法(1) 滅菌乳的制備
取無(wú)抗奶于三角瓶中，114。C滅菌15min。冷卻到45。C備用。
(2) 青霉噻唑酸鉀稀釋液的配制 精密稱取1.00g青霉素鉀于100mL容量瓶中，加入0.5mL抗生素分解劑后用
去離子水定容后搖勻，室溫放置4小時(shí)后標(biāo)記為稀釋液①。取10mL稀釋液①于 100mL容量瓶中，定容后搖勻，標(biāo)記為稀釋液②。取lmL稀釋液②于100ml容量 瓶中，用去離子水定容后搖勻，標(biāo)記為稀釋液③。取lmL稀釋液③于10mL容量 瓶中，用去離子水定容后搖勻，標(biāo)記為稀釋液④。
精密稱取2.50g青霉素鉀于100mL容量瓶中，加入0.5mL抗生素分解劑后用 去離子水定容后搖勻，室溫放置4小時(shí)后標(biāo)記為稀釋液⑤。取10mL稀釋液⑤于 100mL容量瓶中，定容后搖勻，標(biāo)記為稀釋液⑥。取lmL稀釋液⑥于100ml容量 瓶中，用去離子水定容后搖勻，標(biāo)記為稀釋液⑦，其濃度為25mg/L。
(3) 樣品的制備 陰性對(duì)照樣的制備
分別稱取其他發(fā)酵劑0.04g(0.2U)、 0.08g (0.4U)、 0.12g (0.6U)溶解于10mL 滅菌乳中，充分混勻，取2.5mL接入250mL滅菌奶中。由得出的數(shù)據(jù)曲線可以看 出，YF-1發(fā)酵劑在0.6U/L的添加量時(shí)發(fā)酵速度最快。 4.方法有效性的驗(yàn)證
樣品如下表所示0-6為自配濃度從10ppm至100ppb的添加抗生素水解殘 留物樣品，B為對(duì)照空白組。
樣品用95'C， 10min殺菌后，接種YF-1發(fā)酵劑，測(cè)定并記錄初始的pH值。置 入43X:恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵60min。起始pH值為6.67。0123456B
1000ppm50ppm10ppmOppmlppm100ppb10ppb0
6.556.536.516.506.496.486.476.44
實(shí)驗(yàn)結(jié)果接菌種量為0.6U/L最佳，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可以推測(cè)并且實(shí) 驗(yàn)證明(本發(fā)明已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí))0.55-0.65U/L，以及0.4-0.7U/L、甚 至0.2-0.8U/L也可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。 1)發(fā)酵前后pH、值的變化
6.67-6.55=0.12 6.67-6.53=0.14 6,67-6.51=0.16 6.67-6.50=0.17 6.67-6.49=0.18 6,67-6.48=0.19 6.67-6.47=0.20 B. 6.67-6.44=0.23
2)對(duì)照樣pH變化量與待檢樣pH變化量的差值:
0) B-0=0.23-0.12=0.11
1) B-l= 0.23-0.14=0.09
2) B-2=0.23-0.16=0.07
3) B-3=0.23-0.17=0.06
4) B-4=0.23-0.18=0.04
5) B-5=0.23-0.19=0.04
6) B—6=0.23—0.20=0.033)判定結(jié)果0-6號(hào)樣中均含有抗生素水解殘留物且最小檢測(cè)濃度為10ppb。
上述本發(fā)明的檢測(cè)方法可以定性乳或乳制品中是否含有殘留的抗生素酶解 殘留物，對(duì)原料乳和乳制品的品質(zhì)安全檢測(cè)提供可靠的依據(jù)，對(duì)于乳品企業(yè)控 制原奶質(zhì)量提供強(qiáng)有力的檢測(cè)手段和方法，使當(dāng)前不法奶站對(duì)原奶做手腳等現(xiàn) 象得到完全控制，對(duì)于出口奶粉的安全性檢測(cè)提供有力的方法支持。該方法具 有樣品前處理簡(jiǎn)單、快速、定性準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)，方法簡(jiǎn)便，對(duì)操作無(wú) 特殊要求，易于推廣。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。 本發(fā)明用于檢測(cè)乳中抗生素的酶解產(chǎn)物，所述的抗生素包括p-內(nèi)酰胺類(青 霉素類和頭孢類)，四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素等)，氨基糖苷類(慶 大霉素和鏈霉素等)，氯霉素類，大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素和螺旋霉素等)，在本 發(fā)明的下述實(shí)施例中，均以業(yè)內(nèi)普遍使用的青霉素類抗生素類為例。
實(shí)施例l:
以牛奶為待測(cè)產(chǎn)品。
1. 樣品的處理
取待測(cè)的牛奶樣品100ml， 95'C加熱10min; 將殺菌后的樣品冷卻到4CTC-45'C之間備用；
同時(shí)設(shè)置無(wú)抗奶為空白對(duì)照樣品，按同樣的上述方法處理待用；
2. 發(fā)酵
在上述制備好的待測(cè)的液態(tài)乳制品樣品和空白對(duì)照樣品中添加0.6U/L的 YF-1發(fā)酵劑，搖勻，測(cè)定發(fā)酵前的初始pH值；所述的YF-1發(fā)酵劑為含有嗜熱鏈球菌f5^re/7tococci^ ^er附o/ /2z7wj」禾口保力口禾IJ亞乳桿菌(Zacto6"c/〃Ms few/gan'ct^」的發(fā) 酵劑，由科漢森(CHRHansen)公司提供。
然后將樣品置入43。C恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵l小時(shí)，取出冷卻，終止發(fā)酵；
3，測(cè)定pH值
待測(cè)樣品發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH2)，與空白對(duì)照樣品 的發(fā)酵結(jié)朿后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH,)， pH2和pH!二者之差^).03時(shí)， 即可判定該樣品為"人造無(wú)抗乳制品"，即認(rèn)為待測(cè)樣品為人為添加牛奶抗生素 分解劑分解抗生素的乳制品，也就是說(shuō)，其為曾經(jīng)使用過(guò)抗生素乳制品。
實(shí)施例2:
以奶粉為待測(cè)產(chǎn)品。
1. 樣品的處理
稱取13g固體或者粉末狀樣品,用去離子水溶解定容至100ml (還原乳)；. 取待測(cè)的還原乳樣品100ml， 95。C加熱10min; 將殺菌后的樣品冷卻到4(TC-45。C之間備用； 同時(shí)設(shè)置無(wú)抗奶為空白對(duì)照樣品，按同樣的上述方法處理待用；
2. 發(fā)酵
在上述制備好的待測(cè)的樣品和空白對(duì)照樣品中添加0.6U/L的含有嗜熱鏈球 菌(S^pfococ"/5f/ emo; Mw)的發(fā)酵劑，搖勻，測(cè)定發(fā)酵前的初始pH值； 然后將樣品置入43。C恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵l小時(shí)，取出冷卻，終止發(fā)酵；
3. 測(cè)定pH值
待測(cè)樣品發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH2)，與空白對(duì)照樣品 的發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH。 ， pH2和p!^二者之差^).03時(shí)，即可判定該樣品為人為添加牛奶抗生素分解劑分解抗生素的乳制品，也就是說(shuō)， 其為曾經(jīng)使用過(guò)抗生素乳制品。 實(shí)施例3:
以牛奶為待測(cè)產(chǎn)品。
1. 樣品的處理
取待測(cè)的牛奶樣品100ml， 95'C加熱10min; 將殺菌后的樣品冷卻到40'C-45'C之間備用； 同時(shí)設(shè)置無(wú)抗奶為空白對(duì)照樣品，按同樣的上述方法處理待用；
2. 發(fā)酵
在上述制備好的待測(cè)的樣品和空白對(duì)照樣品中添加0.6U/L的含有保加利亞 乳桿菌(LactoZ^"7/^6"/g^7'c—的發(fā)酵劑，搖勻，測(cè)定發(fā)酵前的初始pH值； 然后將樣品置入43。C恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵l小時(shí)，取出冷卻，終止發(fā)酵；
3. 測(cè)定pH值
待測(cè)樣品發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH2)，與空白對(duì)照樣 品的發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差(pH。 ， pH2和pH,二者之差^).03 時(shí)，即可判定該樣品為人為添加牛奶抗生素分解劑分解抗生素的乳制品，也就 是說(shuō)，其為曾經(jīng)使用過(guò)抗生素乳制品。
實(shí)施例1的同時(shí)含有嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亞乳桿 菌(Lactobacillus bulgaricus)的發(fā)酵劑對(duì)抗生素水解產(chǎn)物的感受性強(qiáng)于實(shí)施例2和 3所采用的發(fā)酵劑。
實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)論是液態(tài)奶還是固態(tài)奶(例如奶粉、奶酪或者奶片)，只要 曾經(jīng)加入過(guò)抗生素并且試圖用酶解的方式掩蓋抗生素的存在，即使酶解產(chǎn)物的量很小(痕量)，采用本發(fā)明的方法也完全可以檢測(cè)出乳和乳制品中是否添加 過(guò)抗生素，從源頭上確保了乳和乳制品及其進(jìn)一步的加工產(chǎn)品的質(zhì)量安全。
權(quán)利要求
1.一種殘留的抗生素水解產(chǎn)物的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括將待測(cè)的乳制品和作為空白對(duì)照的無(wú)抗奶樣品殺菌、冷卻后加發(fā)酵劑，加入的量為0.2-0.8U/L，測(cè)定其起始的發(fā)酵液pH值，然后在40-45℃下恒溫培養(yǎng)1小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液的pH值，計(jì)算樣品發(fā)酵前后pH值的變化與無(wú)抗奶對(duì)照樣發(fā)酵前后的變化的差值。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中，所述的方法中采用的乳制品包括液 態(tài)乳制品和固態(tài)乳制品。
3. 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中，所述的方法中采用的液態(tài)乳制品包括液態(tài)的原奶和還原奶，固態(tài)乳制品包括奶粉。
4. 如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其中，所述的方法中采用的發(fā)酵劑為含有 乳酸菌的發(fā)酵劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其中，所述的方法中采用的發(fā)酵劑中含有 的乳酸菌為乳稈菌屬、鏈球菌屬任一或其組合的菌屬的乳酸菌。
6. 如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其中，所述的鏈球菌屬的乳酸菌為嗜熱鏈 球菌，乳稈菌屬的乳酸菌為保加利亞乳桿菌。
7. 如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其中，所述的方法中所加入的發(fā)酵劑的量 為0.4-0.7U/L;該U為菌的活力單位，該L為待測(cè)的乳制品或空白對(duì)照樣品的容積 單位。
8. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中，該方法包括 (1).樣品的處理取待測(cè)的液態(tài)乳制品樣品100ml， 95。C以上加熱10min; 將殺菌后的樣品冷卻到40'C-45。C之間備用；若樣品為奶粉類固體或粉狀樣品時(shí)，稱取10-15g固體或者粉末狀樣品，用 去離子水溶解定容至100ml;同時(shí)設(shè)置無(wú)抗奶為空白對(duì)照樣品，按同樣的上述方法處理待用；(2) .發(fā)酵在上述制備好的待測(cè)的液態(tài)乳制品樣品和空白對(duì)照樣品中添加發(fā)酵劑，搖勻，測(cè)定發(fā)酵前的初始pH值；然后將樣品置入43。C恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵，取出冷卻；(3) .測(cè)定pH值待測(cè)樣品發(fā)酵結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差，與空白對(duì)照樣品的發(fā)酵 結(jié)束后的pH值與發(fā)酵初始的pH之差，以二者之差是否大于0.03來(lái)判定該樣品是否為曾經(jīng)使用過(guò)抗生素的乳制品。
9. 如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其中，所述的方法步驟(2)中采用的發(fā)酵劑為含有的乳酸菌的發(fā)酵劑，該乳酸菌為含有乳稈菌屬、乳酸鏈球菌屬任一 或其組合的菌屬的乳酸菌。
10. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中，該殘留的抗生素水解產(chǎn)物包括|3-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、氯霉素類和/或大環(huán)內(nèi)酯類。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種殘留的抗生素水解產(chǎn)物的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括將待測(cè)的乳制品和空白對(duì)照無(wú)抗奶樣品經(jīng)殺菌、冷卻后加入發(fā)酵劑，測(cè)定其起始的發(fā)酵液pH值，然后在40-45℃下保溫1小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液的pH值，計(jì)算發(fā)酵前后pH值的變化與無(wú)抗奶對(duì)照樣變化值的差值，差值大于等于0.3時(shí)判定為陽(yáng)性樣品；該發(fā)明可以檢測(cè)出的酶解產(chǎn)物的最低濃度是10ppb，可以靈敏準(zhǔn)確地檢測(cè)乳制品中抗生素酶解殘留物。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101307349SQ20081013181
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者穎 安, 張志一 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司