專利名稱：固定化蛋白酶及其在制備乳酪蛋白肽中的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酶及其應(yīng)用，尤其涉及一種固定化蛋白酶，本發(fā)明 還涉及該固定化蛋白酶在制備乳酪蛋白肽中的應(yīng)用，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
功能性食品是二十一世紀(jì)食品工業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。開發(fā)各種具有生理活性的 功能營養(yǎng)因子，具有深遠(yuǎn)的生物學(xué)意義和重要的應(yīng)用價值，也是當(dāng)今國內(nèi)外食 品界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的產(chǎn)業(yè)。
乳中含有大量不同活性的生物活性肽，這些肽或自然存在于乳中或源于乳 蛋白水解后的產(chǎn)物。由于其分子量較小，在小腸內(nèi)以完整肽段的形式被人體吸 收，不會引起人體的免疫排斥反應(yīng)，且具有多種特殊的生理活性功能。
乳酪蛋白經(jīng)蛋白酶水解得到小分子乳酪蛋白肽，乳酪蛋白肽主要是由2 7 個氨基酸組成的多肽混合物，是一種多功能營養(yǎng)因子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、 抗高血壓、降膽固醇、抗菌等多種生理活性功能，可廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等 行業(yè)，可制成天然降血壓藥、患者營養(yǎng)補(bǔ)劑、嬰幼兒食品、老年食品、運(yùn)動食 品和各種功能健康食品等。
乳源生物活性肽，因其源于天然食物蛋白以及多種特殊的生理活性功能， 已成為發(fā)達(dá)國家的研究熱點(diǎn)。經(jīng)過近20年的探索，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多 種乳源生物活性肽。國外對乳蛋白來源的ACE抑制肽研究有一定的報道，尤其 是曰本對來源于乳清蛋白、酪蛋白和酸奶中的ACE抑制肽進(jìn)行了較多的研究， 取得了較大的進(jìn)展。目前國內(nèi)對此方面的研究才剛剛起步，國內(nèi)數(shù)所高校進(jìn)行 了乳源生物活性肽的研究，在蛋白酶的選擇，酶解工藝等方面取得了一定的進(jìn) 展。但目前只有極少數(shù)的生物活性肽能夠進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，如CPPs。對于大多 數(shù)乳蛋白來源的活性肽來說，其工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的難度，主要是因?yàn)檫@些 生物活性肽在乳蛋白酶解液中的含量低，分離和提純難度大，檢測手段和技術(shù)不夠成熟，這些都是阻礙乳蛋白源生物活性肽產(chǎn)業(yè)化的主要因素，也是今后研 究工作的重點(diǎn)所在。
目前國內(nèi)已有蛋白酶水解乳酪蛋白制取乳酪蛋白肽的研究，但關(guān)于固定化 酶水解制備乳酪蛋白肽的研究尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種固定化蛋白酶。
本發(fā)明目的之二是將該固定化蛋白酶應(yīng)用于制備乳酪蛋白肽。 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種固定化蛋白酶，主要按照以下方法制備得到
(1) 將濃度為0.5 10%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散， 滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(按體積分?jǐn)?shù)計) 達(dá)到0.2-3%，攪拌加入0.5-3 mol/L NaOH溶液，至NaOH溶液的終濃度(按體 積分?jǐn)?shù)計)為0.05% 3%，于40-7(TC保溫反應(yīng)0.5-5 h，靜置冷卻后棄去上層， 依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸餾水沖洗，真空干燥，得到固定化載體 殼聚糖微球，備用；
(2) 向0.1% 5%的蛋白酶溶液中加入步驟(1)所制備的固定化載體殼 聚糖微球，其中，蛋白酶溶液與固定化載體殼聚糖微球按1-4 : 1的重量比進(jìn)行 配比；置于搖瓶器中振蕩吸附2-30 h，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液， 使戊二醛溶液的最終濃度(按體積分?jǐn)?shù)計)達(dá)到0.2-3%，交聯(lián)0.2-10 h，得到固定 化蛋白酶。
其中，所述的蛋白酶優(yōu)選自木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋 白酶、動物蛋白水解酶、堿性蛋白酶或胃蛋白酶中的任意一種或一種以上按任 意比例所組成的復(fù)合酶。
根據(jù)需要，將本發(fā)明所制備得到的固定化蛋白酶裝入或填充入合適的柱中 (作為參考，柱子材質(zhì)可以為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑可以為 O50mm，長度可以為1200mm，裝填系數(shù)可以為85-90%等；當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù) 技術(shù)人員可根據(jù)需要將上述參數(shù)作相應(yīng)的修改)，得到固定化蛋白酶柱，可將 其應(yīng)用于制備乳酪蛋白肽。作為一種優(yōu)選的方法， 一種將上述固定化蛋白酶柱應(yīng)用于制備乳酪蛋白肽 的方法，包括以下步驟(1)預(yù)處理乳酪蛋白溶液；(2)將經(jīng)過預(yù)處理的乳酪 蛋白溶液過固定化蛋白酶柱，進(jìn)行酶水解反應(yīng)；(3)收集酶水解液，離心分離， 得上清液；(4)將上清液脫色處理后再進(jìn)行脫鹽處理；(5)將脫鹽處理后的酶 解液進(jìn)行納濾處理；(6)濃縮；(7)濃縮后的產(chǎn)物包埋于壁材中；(8)噴霧干 燥，即得乳酪蛋白肽。 .
為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，步驟(1)中所述的預(yù)處理優(yōu)選為將乳酪蛋白
配制成濃度為1.0-6.0 mg/mL的溶液在60-10(TC溫度條件下預(yù)熱處理5-20 min; 然后將乳酪蛋白溶液冷卻至30-60°C;
優(yōu)選的，步驟(2)中經(jīng)過預(yù)處理的濃度為1.0-6.0 mg/mL的乳酪蛋白溶液 以0.1-5.0 mL/min的流速過固定化蛋白酶柱；所述的酶水解反應(yīng)條件優(yōu)選為溫 度30-65。C， pH為4.0-9.0。
步驟(3)中所述的離心分離優(yōu)選在以下條件下進(jìn)行采用離心機(jī)于 4000—5000r/min，離心分離15--20min，分離未完全酶解的乳酪蛋白沉淀物，得 到澄清透明的酶解液。
步驟(4)中所述的脫色處理優(yōu)選在以下條件下進(jìn)行采用氫氧化鈉溶液將 離心上清液pH調(diào)整至6.0-7.0，加入溶液量0.5-3.0%的粉末或顆粒活性炭，于 30-50'C條件下進(jìn)行脫色處理，1.0-3.0 h后過濾分離。
步驟(4)中所述的脫鹽處理優(yōu)選在以下條件下進(jìn)行經(jīng)脫色處理的乳酪蛋 白酶解液，采用浸泡法或過柱法，先經(jīng)24g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交 換樹脂，處理30min，后經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理 30min，進(jìn)行脫鹽處理。
步驟(5)中所述的納濾分離優(yōu)選在以下條件下進(jìn)行采用NF-1即截留分 子量為2000的納濾膜，操作壓力0.3-1.0Mpa，截留分離分子量范圍小于2000 的乳酪蛋白肽。
步驟(6)中所述的濃縮優(yōu)選按照以下條件進(jìn)行控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度60-7(TC條件下，將乳酪蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為 10-30%;通過真空蒸發(fā)濃縮，得到高含量的乳酪蛋白肽溶液；
步驟(7)中所述的壁材由多孔淀粉與p-環(huán)糊精復(fù)合而成。本發(fā)明中所用到的各種原料都可通過商業(yè)途徑購買得到，例如所用到的乳 酪蛋白、殼聚糖、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、動物蛋白水解酶、酸性 蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等都可從生物試劑公司購買得 到。
固定化酶是采用吸附交聯(lián)法、偶聯(lián)法等，把酶固定于特定載體上的技術(shù)， 它能提高酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，延長酶的使用期和保管期，將反應(yīng)物和產(chǎn)物分 開，有效控制生產(chǎn)過程，省去熱處理使酶失活的步驟，簡化生產(chǎn)工藝，更重要 的是它能在生產(chǎn)中反復(fù)連續(xù)使用，大幅度提高酶的利用率。
本發(fā)明首先制備得到固定化的蛋白酶，再用固定化的蛋白酶對乳酪蛋白進(jìn) 行酶解，在此基礎(chǔ)上，篩選和優(yōu)化了酶解、離心分離、脫色脫鹽、納濾分離、 濃縮、復(fù)合微膠囊包埋、噴霧干燥等最佳工藝條件，建立了一整套采用固定化 蛋白酶水解制備乳酪蛋白肽的方法。
本發(fā)明制備乳酪蛋白肽方法采用固定化酶水解乳酪蛋白，固定化酶可反復(fù) 多次使用，使用效率高，有效降低了生產(chǎn)成本，產(chǎn)品分離方便、成本較低、生 產(chǎn)條件溫和、水解程度容易控制；所制備的乳酪蛋白肽產(chǎn)品具有肽含量高、肽 分子量分布范圍優(yōu)、質(zhì)量好、無苦味、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，為乳酪蛋白的深度開 發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。經(jīng)檢測，本發(fā)明方法所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計) 高達(dá)75.05%;肽分子量分布范圍為小于2409道爾頓的達(dá)到97.79%。
本發(fā)明方法所制備得到的乳酪蛋白肽主要是由2 7個氨基酸組成的多肽混 合物，是一種多功能營養(yǎng)型因子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固 醇、抗菌等多種生理活性功能，可廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)，可制成天然 降血壓藥、患者營養(yǎng)補(bǔ)劑、嬰幼兒食品、老年食品、運(yùn)動食品和各種功能健康 食品等。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著 描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何 限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對 本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
一、 試驗(yàn)材料
乳酪蛋白(青海凱興干酪素有限公司)；殼聚糖(廣州凱利生物制劑制品 廠)；戊二醛(體積分?jǐn)?shù)50%， Fluka公司，上?；瘜W(xué)試劑公司分裝)；胃蛋白 酶120萬u/g、胰蛋白酶250萬u/g (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；菠蘿蛋白 酶85萬u/g、動物蛋白水解酶10萬u/g (廣西南寧龐博生物科技有限公司)； 酸性蛋白酶5萬u/g (無錫市酶制劑廠)，堿性蛋白酶200萬u/g、中性蛋白酶 200萬u/g、木瓜蛋白酶7萬u/g (上海寶豐生化有限公司)。
二、 肽分子量分布測定方法 A.l方法提要
采用高效凝膠過濾色譜法測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分 分子體積大小的差別進(jìn)行分離，在肽鍵的紫外吸收波長220納米條件下檢測， 使用凝膠色譜測定分布的專用數(shù)據(jù)處理軟件(即GPC軟件)，對色譜圖及其數(shù) 據(jù)進(jìn)行處理，計算得到多肽的相對分子量大小及分布范圍。 A.2儀器
(1) 高效液相色譜儀，配有紫外檢測器和含有GPC數(shù)據(jù)處理軟件的色譜 工作站或積分儀；
(2) 流動相真空抽濾脫氣裝置；
(3) 超聲波震蕩器；
(4) 分析天平，感量0.0001g。 A.3試劑
(1) 乙晴，色譜純；
(2) 三氟醋酸，分析純；
(3) 水，超純級或二次蒸餾水；
(4) 分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品
(a) 細(xì)胞色素C (cyyochrome， MW 12500)
(b) 抑肽酶(aprotinin,MW6500)MW 1450)(d) 乙氨酸一乙氨酸一清氨酸一精氨酸(MW451)(e) 乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(MW 189) A.4色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)色譜柱TSKgel G2000 SWXL 300 mmx7.8mm，或性能與此相近的同類型 其它適用于測定蛋白質(zhì)和肽的凝膠柱。流動相乙晴水三氟乙酸，10: 90: O.l(體積比) 檢測波長UV220nm 流速0.5ml/min 柱溫30°C 進(jìn)樣體積l(VL為使色譜系統(tǒng)符合檢測要求，規(guī)定在上述色譜條件下，凝膠色譜柱的柱效即理論塔板數(shù)(AO按三肽標(biāo)準(zhǔn)品(乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸)峰計算不低于 10000，肽的分配系數(shù)(&)應(yīng)在0 1之間。 A.5分子量校正曲線制作分別用流動相配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的上述不同分子量肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用 孔徑0.2—0.5pm聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾后分別進(jìn)樣，得到系列標(biāo)準(zhǔn)品的 色譜圖。以分子量的對數(shù)(lgMF)對保留時間作圖或作線性回歸，得到分子量 校正曲線及其方程。 A.6 樣品制備稱取樣品約20.0mg于10ml容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲震蕩10 min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2,—0.5iam聚四氟乙烯或尼龍過濾膜 過濾后，上機(jī)進(jìn)樣。 A.7分子量分布的計算將A.5制備的樣品溶液在上述色譜條件下分析。然后用GPC數(shù)據(jù)處理軟件， 將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進(jìn)行計算，即可得到樣品的肽分子量及 其分布范圍。用峰面積歸一法可計得不同分子量范圍肽的相對百分比。表l 乳酪蛋白肽分子量分布分子量范圍峰面積百分比 (%，入220nm)數(shù)均分子量重均分子量〉3000 3000 2000 2000 1000 1000~500 500 130 〈1300. 72 1.49 5.45 20. 55 61.27 10. 52395324091458634257403024491505658285三、乳酪蛋白水解度測定方法3. 1溶液中可溶性氮的測定方法(微量擴(kuò)散法)取乳酪蛋白酶解澄清液5 ml，加入1 g消化催化劑和10 ml濃硫酸，在高溫 下消化至黃綠色后，取出冷卻至室溫，加水定容。然后取5 ml加入到擴(kuò)散皿的 外室，并在擴(kuò)散皿的內(nèi)室加入2ml的硼酸溶液，向外室中加入4ml濃NaOH溶 液，并迅速蓋上蓋片。在自然條件放置24h左右后，用標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸溶液滴定硼 酸溶液至紫羅蘭色即可。含氮量N (%) = (V2-V。 xNHx0.014x稀釋倍數(shù)/樣品重量xl00。/。 注V1:空白所需鹽溶液體積(ml)V2:滴定待測液耗用標(biāo)準(zhǔn)酸體積(ml) NH: 標(biāo)準(zhǔn)酸當(dāng)量濃度 0.014 1ml當(dāng)量氮的克數(shù) 3. 2水解度的測定方法——TCA法取10 ml酶解物中加入10 mlTCA，在水浴中加熱20 min，然后在4000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15min。取上清液，蛋白質(zhì)總氮和上清液可溶性氮由3.1中方法測得。水解度(DH)注Ni空白試樣的含氮量N2乳酪蛋白未經(jīng)酶解的含氮量N3乳酪蛋白經(jīng)酶解后的含氮量。實(shí)施例l固定化胰蛋白酶的制備(1) 將10%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到3%,攪拌 加入3 mol/LNaOH溶液，至NaOH的終濃度(體積分?jǐn)?shù))為3%，于7(TC保溫 反應(yīng)0.5，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸餾水沖 洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2) 向5%的胰蛋白酶溶液中加入固定化載體殼聚糖微球，其中胰蛋白酶溶液固定化載體殼聚糖微球=4: 1;置于搖瓶器中振蕩吸附30 h，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到3%，交 聯(lián)0.2-10 h，即得固定化胰蛋白酶。實(shí)施例2固定化胃蛋白酶的制備(1) 將0.5%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積 分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二酸溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到0.2%， 攪拌加入0.5 mol/L NaOH溶液，至NaOH的終濃度(體積分?jǐn)?shù))為0.05%,于 40'C保溫反應(yīng)5h，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用 蒸餾水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2) 向0.1%的胃蛋白酶溶液中加入所制備的固定化載體殼聚糖微球，其 中胃蛋白酶溶液固定化載體殼聚糖微球=1: 1;置于搖瓶器中振蕩吸附2 h， 然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá) 到0.2%，交聯(lián)0.2-10 h，即得固定化胃蛋白酶。實(shí)施例3固定化菠蘿蛋白酶的制備(1) 將5%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積分 數(shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到0.5%，攪 拌加入0.8mol/LNaOH溶液，至NaOH的終濃度(體積分?jǐn)?shù))為0.08%，于50°C 保溫反應(yīng)2.5h，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸 餾水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2) 向1.5%的菠蘿蛋白酶溶液中加入占菠蘿蛋白酶溶液體積5%的所制備 的固定化載體殼聚糖微球，其中菠蘿蛋白酶溶液固定化載體殼聚糖微球=3.5:1;置于搖瓶器中振蕩吸附10h，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5°/。戊二醛溶液，使戊二 醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到0.8%,交聯(lián)0.2-10h，即得固定化菠蘿蛋白 酶。實(shí)施例4固定化木瓜蛋白酶的制備(1) 將0.6%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積分 數(shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到0.3%,攪 拌加入0.6 mol/L NaOH溶液，至NaOH的終濃度(體積分?jǐn)?shù))為0.07%，于45°C 保溫反應(yīng)5h，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸餾 水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2) 向0.2%的木瓜蛋白酶溶液中加入占木瓜蛋白酶溶液體積4%的所制備 的固定化載體殼聚糖微球，其中木瓜蛋白酶溶液固定化載體殼聚糖微球=1.2: 1;置于搖瓶器中振蕩吸附30h，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液，使戊二 酸溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到1.5%，交聯(lián)0.2-10 h，即得固定化木瓜蛋白 酶。實(shí)施例5固定化中性蛋白酶的制備(1) 將9%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積分 數(shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到2.5%，攪 拌加入2.5 mol/L NaOH溶液，至NaOH的終濃度(體積分?jǐn)?shù))為1.5%，于60°C 保溫反應(yīng)1.5h，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸 餾水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2) 向4.5%的中性蛋白酶溶液中加入占中性蛋白酶溶液體積9%的所制備的固定化載體殼聚糖微球，其中中性蛋白酶溶液固定化載體殼聚糖微球=1: 1; 置于搖瓶器中振蕩吸附20h，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液，使戊二醛 溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到2.0。/。，交聯(lián)0.2-10h，即得固定化中性蛋白酶。實(shí)施例6固定化堿性蛋白酶的制備(1)將5.5%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到1.2%，攪 拌加入1.5mol/LNaOH溶液，至NaOH的終濃度(體積分?jǐn)?shù))為0.5%，于65°C 保溫反應(yīng)5h，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸餾 水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2)向0.2%的堿性蛋白酶溶液中加入占堿性蛋白酶溶液體積6%的所制備 的固定化載體殼聚糖微球，其中堿性蛋白酶溶液固定化載體殼聚糖微球-3: 1; 置于搖瓶器中振蕩吸附10h，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液，使戊二醛 溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到1.2 %，交聯(lián)0.2-10 h，即得固定化堿性蛋白酶。實(shí)施例7固定化動物蛋白水解酶的制備(1) 將9.5%的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積 分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體積分?jǐn)?shù))達(dá)到2.8%， 攪拌加入2.5mol/LNaOH溶液，至NaOH的終濃度(體積分?jǐn)?shù))為1.5%，于45°C 保溫反應(yīng)5h，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸餾 水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2) 向4. 5%的動物蛋白水解酶溶液中加入所制備的固定化載體殼聚糖微 球，其中動物蛋白水解酶溶液固定化載體殼聚糖微球=2: 1;置于搖瓶器中振 蕩吸附6h，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(體 積分?jǐn)?shù))達(dá)到2.5%，交聯(lián)0.2-10 h，即得固定化動物蛋白水解酶。實(shí)施例8固定化胰蛋白酶柱的制備將實(shí)施例1戶斥制備的固定化胰蛋白酶填充于柱 中，柱子自制，柱子材質(zhì)為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑0)50mm，長 度1200mm，裝填系數(shù)為85%，得到固定化胰蛋白酶柱；將乳酪蛋白配制成濃度為6.0mg/mL的溶液在IO(TC溫度條件下預(yù)熱處理5 min;然后將乳酪蛋白溶液冷卻至6(TC;將經(jīng)過預(yù)處理的濃度為6.0mg/mL的乳 酪蛋白溶液以5.0 mL/min的流速過固定化胰蛋白酶柱進(jìn)行酶水解反應(yīng)；所述的 酶水解反應(yīng)條件為溫度65。C， pH為9.0;收集過柱的酶解液，經(jīng)檢測，乳酪 蛋白的水解度為44.3%;采用離心機(jī)于5000 rpm，離心分離15 min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至7.0，加入為離心上清液重量的2.0%的粉 末活性炭，于5(TC條件下進(jìn)行脫色處理，3.0h后過濾分離；經(jīng)脫色處理的乳酪 蛋白酶解液采用過柱法，先經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂， 處理乳酪蛋白肽30min后，后經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂 處理乳酪蛋白肽30min，進(jìn)行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子量為2000的納濾 膜，在操作壓力0,3-1.0Mpa的條件，截留分離分子量范圍小于2000的乳酪蛋白 肽；控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度60-7(TC條件下，將乳酪蛋白肽 溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與P-環(huán)糊精復(fù)合壁材，與乳酪 蛋白肽混合，攪拌均勻后，再置于高壓均質(zhì)機(jī)中，30MPa壓力均質(zhì)，將乳酪蛋 白肽均勻地分散于壁材中，進(jìn)行復(fù)合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng) 溫度190°C、出風(fēng)溫度95。C、進(jìn)料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧 干燥，得到粉末狀乳酪蛋白肽。經(jīng)檢測，本實(shí)施例所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)為75.05%;肽分 子量分布范圍為小于2409道爾頓的達(dá)到97.79%實(shí)施例9固定化胃蛋白酶柱的制備將實(shí)施例2所制備的固定化胃蛋白酶填充于柱 中，柱子自制，柱子材質(zhì)為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑0)50mm，長 度1200mm，裝填系數(shù)為85%，得到固定化胃蛋白酶柱；將乳酪蛋白配制成濃度為1.0mg/mL的溶液在6(TC溫度條件下預(yù)熱處理20 min;然后將乳酪蛋白溶液冷卻至3(TC;將經(jīng)過預(yù)處理的濃度為lmg/mL的乳酪 蛋白溶液以0.1mL/min的流速過固定化胃蛋白酶柱進(jìn)行酶水解反應(yīng)；所述的酶 水解反應(yīng)條件為溫度3(TC， pH為4.0;收集過柱的酶水解液，經(jīng)檢測，乳清 蛋白的水解度為42.2%;將過柱的酶水解液采用離心機(jī)于4000 rpm，離心分離 20 min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.0，加入為離心上清 液重量的1.0%的粉末活性炭，于4(TC條件下進(jìn)行脫色處理，1.5h后過濾分離； 經(jīng)脫色處理的乳酪蛋白酶解液采用過柱法，先經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系 陽離子交換樹脂，處理乳酪蛋白肽30min后，后經(jīng)24g/100mL的強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理乳酪蛋白肽30min，進(jìn)行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子 量為2000的納濾膜，在操作壓力0.3—l.OMpa的條件，截留分離分子量范圍小 于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度60-7(TC條件 下，將乳酪蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與P-環(huán)糊精 復(fù)合壁材，與乳酪蛋白肽混合，攪拌均勻后，再置于高壓均質(zhì)機(jī)中，30MPa壓 力均質(zhì)，將乳酪蛋白肽均勻地分散于壁材中，進(jìn)行復(fù)合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴 霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度190°C、出風(fēng)溫度95。C、進(jìn)料流量40ml/min，將均質(zhì)后 的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳酪蛋白肽。經(jīng)檢測，本實(shí)施例所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)達(dá)73.97%;肽 分子量分布范圍為小于2409道爾頓的97.58占％。實(shí)施例10固定化菠蘿蛋白酶柱的制備將實(shí)施例3所制備的固定化菠蘿蛋白酶填充 于柱中，柱子自制，柱子材質(zhì)為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑。50mm， 長度1200mm，裝填系數(shù)為85%，得到固定化菠蘿蛋白酶柱；將乳酪蛋白配制成濃度為4mg/mL的溶液在80。C溫度條件下預(yù)熱處理10 min;然后將乳酪蛋白溶液冷卻至4(TC;將經(jīng)過預(yù)處理的濃度為4mg/mL的乳酪 蛋白溶液以2.0mL/min的流速過固定化菠蘿蛋白酶柱進(jìn)行酶水解反應(yīng)；所述的 酶水解反應(yīng)條件為溫度45'C, pH為7.0;收集過柱的酶水解液，經(jīng)檢測，乳 清蛋白的水解度為41.9%;將過柱的酶解液采用離心機(jī)于4500 rpm，離心分離 20 min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至6.5，加入為離心上清 液重量的1.5%的粉末活性炭，于45'C條件下進(jìn)行脫色處理，2.5h后過濾分離； 經(jīng)脫色處理的乳酪蛋白酶解液釆用過柱法，先經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系 陽離子交換樹脂，處理乳酪蛋白肽30min后，后經(jīng)24g/100mL的強(qiáng)堿性苯乙烯 系陰離子交換樹脂處理乳酪蛋白肽30min，進(jìn)行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子 量為2000的納濾膜，在操作壓力0.3—l.OMpa的條件，截留分離分子量范圍小 于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度為600-750 mmHg,在蒸發(fā)溫度60-70。C條件 下，將乳酪蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與p-環(huán)糊精 復(fù)合壁材，與乳酪蛋白肽混合，攪拌均勻后，再置于高壓均質(zhì)機(jī)中，30MPa壓力均質(zhì)，將乳酪蛋白肽均勻地分散于壁材中，進(jìn)行復(fù)合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度190°C、出風(fēng)溫度95'C、進(jìn)料流量40ml/min，將均質(zhì)后 的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳酪蛋白肽。經(jīng)檢測，本實(shí)施例所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)達(dá)73.29%;肽分 子量分布范圍為小于2409道爾頓的占97.24%。實(shí)施例11固定化木瓜蛋白酶柱的制備將實(shí)施例4所制備的固定化木瓜蛋白酶填充 于柱中，柱子自制，柱子材質(zhì)為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑0)50mm， 長度1200mm，裝填系數(shù)為85%，得到固定化木瓜蛋白酶柱；將乳酪蛋白配制成濃度為3.0mg/mL的溶液在7(TC溫度條件下預(yù)熱處理8 min;然后將乳酪蛋白溶液冷卻至35°〇；將經(jīng)過預(yù)處理的濃度為5mg/mL的乳酪 蛋白溶液以1.5 mL/min的流速過固定化木瓜蛋白酶柱；所述的酶水解反應(yīng)條件 為溫度55'C， pH為8.0;收集過柱的酶解液，經(jīng)檢測，乳清蛋白的水解度為 42.1%;將所收集過柱的酶解液，采用離心機(jī)于4000rpm，離心分離20 min，得 到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至7.0，加入為離心上清液重量的2.0 %的粉末活性炭，于5(TC條件下進(jìn)行脫色處理，3h后過濾分離；經(jīng)脫色處理 的乳酪蛋白酶解液采用過柱法，先經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換 樹脂，處理乳酪蛋白肽30min后，后經(jīng)24g/100mL的強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交 換樹脂處理乳酪蛋白肽30min，進(jìn)行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子量為2000 的納濾膜，在操作壓力0.3-1.0Mpa的條件，截留分離分子量范圍小于2000的乳 酪蛋白肽；控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度60-70'C條件下，將乳酪 蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與P-環(huán)糊精復(fù)合壁材， 與乳酪蛋白肽混合，攪拌均勻后，再置于高壓均質(zhì)機(jī)中，30MPa壓力均質(zhì)，將 乳酪蛋白肽均勻地分散于壁材中，進(jìn)行復(fù)合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控 制進(jìn)風(fēng)溫度190°C、出風(fēng)溫度95。C、進(jìn)料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液， 經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳酪蛋白肽。經(jīng)檢測，本實(shí)施例所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)達(dá)72.8%;肽分 子量分布范圍為小于2409道爾頓的占96.89%。16固定化中性蛋白酶柱的制備將實(shí)施例5所制備的固定化中性蛋白酶填充于柱中，柱子自制，柱子材質(zhì)為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑O50mm， 長度1200mm，裝填系數(shù)為85%，得到固定化中性蛋白酶柱；將乳酪蛋白配制成濃度為2.0mg/mL的溶液在95'C溫度條件下預(yù)熱處理5 min;然后將乳酪蛋白溶液冷卻至5(TC;將經(jīng)過預(yù)處理的濃度為2mg/mL的乳酪 蛋白溶液以4.5 mL/min的流速過固定化中性蛋白酶柱進(jìn)行酶水解反應(yīng)；所述的 酶水解反應(yīng)條件為溫度35X:， pH為5.0;收集過柱的酶解液，經(jīng)檢測，乳清 蛋白的水解度為41.9%;將酶解液采用離心機(jī)于4500 rpm，離心分離20 min， 得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至7.0，加入為離心上清液重量的 1.5%的粉末活性炭，于45i:條件下進(jìn)行脫色處理，2.5h后過濾分離；經(jīng)脫色處 理的乳酪蛋白酶解液采用過柱法，先經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交 換樹脂，處理乳酪蛋白肽30min后，后經(jīng)24g/100mL的強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子 交換樹脂處理乳酪蛋白肽30min，進(jìn)行脫鹽處理;采用NF-1即截留分子量為2000 的納濾膜，在操作壓力0.3-1.0Mpa的條件，截留分離分子量范圍小于2000的乳 酪蛋白肽；控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度60-7(TC條件下，將乳酪 蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與P-環(huán)糊精復(fù)合壁材， 與乳酪蛋白肽混合，攪拌均勻后，再置于高壓均質(zhì)機(jī)中，30MPa壓力均質(zhì)，將 乳酪蛋白肽均勻地分散于壁材中，進(jìn)行復(fù)合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴霧干燥，控 制進(jìn)風(fēng)溫度190'C、出風(fēng)溫度95。C、進(jìn)料流量40ml/min，將均質(zhì)后的乳化液， 經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳酪蛋白肽。經(jīng)檢測，本實(shí)施例所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)達(dá)71.58%;肽分 子量分布范圍為小于2409道爾頓的占95.27%。實(shí)施例13固定化堿性蛋白酶柱的制備將實(shí)施例6所制備的固定化堿性蛋白酶填充 于柱中，柱子自制，柱子材質(zhì)為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑O50mm， 長度1200mm，裝填系數(shù)為85%，得到固定化堿性蛋白酶柱；將乳酪蛋白配制成濃度為4.0mg/mL的溶液在65。C溫度條件下預(yù)熱處理20min;然后將乳酪蛋白溶液冷卻至3(TC;將經(jīng)過預(yù)處理的濃度為4mg/mL的乳酪 蛋白溶液以0.2 mL/min的流速過固定化堿性蛋白酶柱進(jìn)行酶水解反應(yīng)；所述的 酶水解反應(yīng)條件為溫度45"C， pH為7.0;收集過柱的酶解液，經(jīng)檢測，乳清 蛋白的水解度為40.9%;將所收集過柱的酶解液采用離心機(jī)于4000rpm，離心分 離20min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至7.0，加入為離心上 清液重量的2.0%的粉末活性炭，于5(TC條件下進(jìn)行脫色處理，1.5h后過濾分離； 經(jīng)脫色處理的乳酪蛋白酶解液采用過柱法，先經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系 陽離子交換樹脂，處理乳酪蛋白肽30min后，后經(jīng)24g/100mL的強(qiáng)堿性苯乙烯 系陰離子交換樹脂處理乳酪蛋白肽30min,進(jìn)行脫鹽處理；采用NF-1即截留分子 量為2000的納濾膜，在操作壓力0.3-l.OMpa的條件，截留分離分子量范圍小 于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度60-70'C條件 下，將乳酪蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉與(3-環(huán)糊精 復(fù)合壁材，與乳酪蛋白肽混合，攪拌均勻后，再置于高壓均質(zhì)機(jī)中，30MPa壓 力均質(zhì)，將乳酪蛋白肽均勻地分散于壁材中，進(jìn)行復(fù)合微膠囊包埋穩(wěn)定化；噴 霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度190°C、出風(fēng)溫度95t:、進(jìn)料流量40ml/min，將均質(zhì)后 的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳酪蛋白肽。經(jīng)檢測，本實(shí)施例所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)達(dá)72.68%;肽分 子量分布范圍為小于2409道爾頓的占95.87%。實(shí)施例14固定化動物蛋白水解酶柱的制備將實(shí)施例7所制備的固定化動物蛋白水 解酶填充于柱中，柱子自制，柱子材質(zhì)為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直 徑①50mm，長度1200mm，裝填系數(shù)為85%，得到固定化動物蛋白水解酶柱；將乳酪蛋白配制成濃度為6.0mg/mL的溶液在10(TC溫度條件下預(yù)熱處理20 min;然后將乳酪蛋白溶液冷卻至60'C;將經(jīng)過預(yù)處理的濃度為6.0mg/mL的乳 酪蛋白溶液以5.0 mL/min的流速過固定化動物蛋白水解酶柱進(jìn)行酶水解反應(yīng)； 所述的酶水解反應(yīng)條件優(yōu)選為溫度65。C， pH為4.0;收集過柱的酶解液，經(jīng) 檢測，乳清蛋白的水解度為41.6%;將收集過柱的酶解液采用離心機(jī)于5000rpm， 離心分離15min，得到澄清透明的上清液；將該上清液pH調(diào)整至7.0，加入為離心上清液重量的2.0%的粉末活性炭，于5(TC條件下進(jìn)行脫色處理，3.0h后 過濾分離；經(jīng)脫色處理的乳酪蛋白酶解液采用過柱法，先經(jīng)24g/100mL的強(qiáng)酸 性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理乳酪蛋白肽30min后，后經(jīng)24g/100mL的強(qiáng) 堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理乳酪蛋白肽30min，進(jìn)行脫鹽處理；采用NF-1 即截留分子量為2000的納濾膜，在操作壓力0.3-1.0Mpa的條件，截留分離分子 量范圍小于2000的乳酪蛋白肽；控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度 60-7(TC條件下，將乳酪蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;采用多孔淀粉 與P-環(huán)糊精復(fù)合壁材，與乳酪蛋白肽混合，攪拌均勻后，再置于高壓均質(zhì)機(jī)中， 30MPa壓力均質(zhì)，將乳酪蛋白肽均勻地分散于壁材中，進(jìn)行復(fù)合微膠囊包埋穩(wěn) 定化；噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度190°C、出風(fēng)溫度95'C、進(jìn)料流量40ml/min， 將均質(zhì)后的乳化液，經(jīng)噴霧干燥，得到粉末狀乳酪蛋白肽。經(jīng)檢測，本實(shí)施例所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)達(dá)72.75%;肽分 子量分布范圍為小于2409道爾頓的占95.12%。
權(quán)利要求
1. 一種固定化蛋白酶，其特征在于，主要按照以下方法制備得到(1)將0.5～10％的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5％的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為0.2-3.0％，攪拌加入0.5-3.0mol/L NaOH溶液，至NaOH溶液的終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為0.05％～3.0％，于40-70℃保溫反應(yīng)0.5-5.0小時，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸餾水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；(2)向濃度為0.1％～5.0％的蛋白酶溶液中加入固定化載體殼聚糖微球，其中，蛋白酶溶液與固定化載體殼聚糖微球按1-4∶1的重量比進(jìn)行配比；振蕩吸附2-30小時，然后滴入體積分?jǐn)?shù)為2.5％戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度按體積分?jǐn)?shù)計為0.2-3.0％，交聯(lián)0.2-10.0小時，即得。
2、 按照權(quán)利要求1所述的固定化蛋白酶，其特征在于所述的蛋白酶選自 木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白水解酶、堿性蛋 白酶或胃蛋白酶中的任意一種或一種以上按任意比例所組成的復(fù)合酶。
3、 由權(quán)利要求1或2所述的固定化蛋白酶制備得到的固定化蛋白酶柱。
4、 權(quán)利要求3所述的固定化蛋白酶柱在制備乳清蛋白肽中的應(yīng)用，包括 (1)預(yù)處理乳酪蛋白溶液；(2)將經(jīng)過預(yù)處理的乳酪蛋白溶液流過所述的固定化蛋白酶柱，進(jìn)行酶水解反應(yīng)；(3)收集酶水解液，離心分離，得上清液；(4) 將上清液脫色處理后再進(jìn)行脫鹽處理；(5)將脫鹽處理后的酶解液進(jìn)行納濾處 理；(6)濃縮；(7)濃縮后的產(chǎn)物包埋于壁材中；(8)噴霧干燥。
5、 按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于步驟(1)中所述的預(yù)處理為 將乳酪蛋白配制成濃度為1.0-6.0 mg/mL的溶液在60-100'C溫度條件下預(yù)熱處理 5-20分鐘，然后將乳酪蛋白溶液冷卻至30-6(TC。
6、 按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)中經(jīng)過預(yù)處理的濃度 為1.0-6.0 mg/mL的乳酪蛋白溶液以0.1-5.0 mL/min的流速過固定化蛋白酶柱； 所述的酶水解反應(yīng)條件為溫度30-65X:， pH為4.0-9.0。
7、 按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于步驟(4)中所述的脫色處理在 以下條件下進(jìn)行將離心上清液pH調(diào)整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0%的活性炭粉末或顆粒，于30-5(TC條件下進(jìn)行脫色處理，1.0-3.0小時后過濾分離。
8、 按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于步驟(4)中所述的脫鹽處理在 以下條件下進(jìn)行經(jīng)脫色處理的乳酪蛋白酶解液采用浸泡法或過柱法，先經(jīng)24 g/100mL的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，處理30分鐘后，后經(jīng)24g/100mL 的強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂處理30分鐘，進(jìn)行脫鹽處理。
9、 按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于步驟(5)中所述的納濾處理在 以下條件下進(jìn)行采用NF-1即截留分子量為2000的納濾膜，操作壓力 0.3-1.0Mpa，截留分離分子量范圍小于2000的乳酪蛋白肽。
10、 按照權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于步驟(6)中所述的濃縮按照以 下條件進(jìn)行控制真空度為600-750 mmHg，在蒸發(fā)溫度60-70"C條件下，將乳 酪蛋白肽溶液濃縮至固形物含量為10-30%;通過真空蒸發(fā)濃縮，得到高含量的 乳酪蛋白肽溶液；步驟(7)中所述的壁材由多孔淀粉與(3-環(huán)糊精復(fù)合而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化蛋白酶及其在制備乳酪蛋白肽中的應(yīng)用方法。本發(fā)明固定化蛋白酶主要制備方法如下(1)制備固定化載體殼聚糖微球；(2)向蛋白酶溶液中加入殼聚糖微球，振蕩吸附，滴入戊二醛溶液，交聯(lián)，即得。本發(fā)明制備乳酪蛋白肽的方法采用固定化酶水解乳酪蛋白。固定化酶可反復(fù)多次使用，使用效率高，有效的降低了生產(chǎn)成本，產(chǎn)品分離方便、成本較低、生產(chǎn)條件溫和、水解程度容易控制；所制備的乳酪蛋白肽產(chǎn)品具有肽含量高、肽分子量分布范圍優(yōu)、質(zhì)量好、無苦味、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)檢測，本發(fā)明方法所制備的乳酪蛋白肽含量(以干基計)高達(dá)75.05％；肽分子量分布范圍為小于2409道爾頓的達(dá)到97.79％。
文檔編號C12N11/00GK101260397SQ200810094030
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者周利根, 王君虹, 郜海燕, 陳新峰 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院