重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系及制備方法與應(yīng)用的制作方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蛋白表達(dá)體系，尤其涉及一種重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系及制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)的進(jìn)展迅速，自身免疫性疾病(AID)也有了全新的概念。正常情況下，T淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)經(jīng)負(fù)性選擇(克隆缺失)，使進(jìn)入外周血的成熟T細(xì)胞不會(huì)排斥自身抗原，只對(duì)非自身抗原進(jìn)行反應(yīng)，以維持機(jī)體的穩(wěn)定。在某些情況下，上述自身耐受性遭受破壞，免疫系統(tǒng)對(duì)自身組織成分產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答反應(yīng)，稱(chēng)為自身免疫反應(yīng)(AIR)。當(dāng)AIR造成自身組織損傷和相應(yīng)的功能障礙，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，稱(chēng)為AID。AIR的發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，目前對(duì)其引發(fā)的AID的治療尚無(wú)重大突破。因此，對(duì)于AIR發(fā)生的分子機(jī)制的進(jìn)一步研究和探索，將能對(duì)臨床的治療提供新的思路和手段。目前對(duì)自身免疫反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制已有了一定的認(rèn)識(shí)，越來(lái)越多的細(xì)胞與分子被證明與自身免疫反應(yīng)關(guān)系密切，在自身免疫病致病機(jī)制及治療過(guò)程中發(fā)揮色。TH1細(xì)胞因子主要參與器官特異性自身免疫性疾病，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、胰島素依賴(lài)性糖尿病(IDDM)、多發(fā)性硬化(MS)及曱狀腺疾病等；TH2細(xì)胞因子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、哞喘、過(guò)敏性疾病，艾滋病中占優(yōu)勢(shì)。故對(duì)T細(xì)胞及其相關(guān)分子的作用機(jī)制的研究引起了愈來(lái)愈多研究者的關(guān)注。2003年，Pernis與HuCM博士合作，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)，從人淋巴結(jié)cDNA文庫(kù)中篩選出一個(gè)IRF-4結(jié)合蛋白即人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白，并將其命名為IBP(IRF-4bindingprotein)。序列分析結(jié)果顯示，IBP的cDNA全長(zhǎng)約2.3kb,包含一個(gè)1893bp的開(kāi)》丈閱讀才匡(openreadingframe,ORF),編碼631個(gè)氨基酸，分子量約75KD,其編碼基因位于人染色體6p21.31。分析還發(fā)現(xiàn)IBP與Borggrefe報(bào)告的在B細(xì)胞的激活信號(hào)傳導(dǎo)及Ig亞類(lèi)轉(zhuǎn)換有重要作用的SWAP-70分子結(jié)構(gòu)很相似，,人N端到C端依次為EF-hand、PH(p1eckstrin-homo1ogy)、DH(Db1-homo1ogy)結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步組織學(xué)分布和功能研究發(fā)現(xiàn)IBP主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞。同年，Altman課題組在體外分化的鼠源性Thl和Th2細(xì)胞中，利用差異顯示分析技術(shù)分離出一段選擇性表達(dá)于Th2細(xì)胞的基因片斷，由于與SWAP-70有同源性，命名為SLAT(SWAP-70LikeAdapterofTcells),實(shí)際SLAT即為鼠源性IBP。為進(jìn)一步研究IBP在T細(xì)胞中的功能，申請(qǐng)人所在實(shí)驗(yàn)室與Pernis研究組合作，利用genetrapping技術(shù)使IBP表達(dá)缺失，成功建立了IBPtIap/一小鼠模型。長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)IBP缺失小鼠有系統(tǒng)性自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，特征為效應(yīng)/記憶T細(xì)胞和Ig『B細(xì)胞的積聚，高r球蛋白血癥及產(chǎn)生自身抗體。且IBP，""PT細(xì)胞在體內(nèi)外均有抗凋亡現(xiàn)象，亦表現(xiàn)出某些效應(yīng)功能的選擇性缺陷。而有效的免疫應(yīng)答需要外周T細(xì)胞適度的活化和分化及隨后的適度凋亡，以達(dá)到免疫自穩(wěn)，對(duì)T細(xì)胞功能和存活的調(diào)節(jié)受損后將會(huì)導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)發(fā)生。這些結(jié)果有力說(shuō)明IBP的缺失在誘發(fā)自身免疫反應(yīng)中起著重要的作用。從整體水平看，年幼的IBP一^p小鼠表型正常，5個(gè)月時(shí)60%雌性小鼠出現(xiàn)多發(fā)淋巴結(jié)腫大及脾腫大，蛋白尿，腎小球腎炎，其血清IgG水平明顯升高，IgGl和IgG2a均升高，但前者升高幅度更大。大多數(shù)大齡(>5個(gè)月)IBP"w雌鼠還有高效價(jià)的抗核抗體(ANAs)及抗-dsDNA及抗-Sm抗體。這些血清學(xué)改變?cè)谌庋劭梢?jiàn)的'淋巴病變之前就已出現(xiàn)。；維性IBPtrap/trap小鼠只有4艮少部分出現(xiàn)病變，且遠(yuǎn)不如雌鼠明顯。這與多發(fā)于女性的人系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)癥候群表現(xiàn)很相似。從細(xì)胞水平看，IBP一細(xì)p小鼠中分離純化的T細(xì)胞在TCR刺激下，增殖反應(yīng)有適度損傷，而用能繞開(kāi)TCR早期信號(hào)事件的PMA和ionomycin培養(yǎng)的IBP"ap/—T細(xì)胞增生正常，提示IBP對(duì)能獲得最佳增殖的早期TCR信號(hào)事件有作用。單個(gè)T細(xì)胞增殖反應(yīng)受損，體內(nèi)卻有效應(yīng)/記性T細(xì)胞的累積，說(shuō)明IBP缺失影響T細(xì)胞的存活。隨后JessicaC等證實(shí)在體內(nèi)外活化的IBP1—一T細(xì)胞凋亡能力明顯受損。因此IBP服務(wù)于活化T細(xì)胞的有效消除，IBP的缺失可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。IBP"ap""p小鼠中終末分化B細(xì)胞增加，出現(xiàn)異常的抗體反應(yīng)，血清IgGl和IgE基礎(chǔ)水平比對(duì)照小鼠有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著升高，但體外試-瞼中，B細(xì)胞刺激后的增殖和功能與對(duì)照小鼠無(wú)區(qū)別，且IBP'w小鼠對(duì)T-非依賴(lài)性抗原Np-Ficoll所引發(fā)的NP-特異抗體應(yīng)答反應(yīng)甚微，對(duì)T-依賴(lài)(TD)抗原NP-KLH的免疫應(yīng)答卻產(chǎn)生大量的IgE。說(shuō)明缺陷鼠中表現(xiàn)出的異?？贵w反應(yīng)本質(zhì)上不是源于B細(xì)胞，而是源于T細(xì)胞缺陷的后續(xù)效應(yīng)，這種Ig同種型產(chǎn)量的增加是TH2依賴(lài)性的。這與Altman所研究的通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)SLAT可增加TH2型細(xì)胞因子產(chǎn)生是不同的。盡管這種偏差產(chǎn)生原因尚不清楚，我們不排除這個(gè)新分子在TH分化中起著復(fù)雜作用的可能性，而在IBPtiap/一小鼠模型中，IBP在介導(dǎo)活化誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中起的作用似乎大于其在T細(xì)胞分化中的作用。TCR細(xì)胞骨架重塑對(duì)于受體和信號(hào)分子大規(guī)模重塑是至關(guān)重要的，這是免疫突觸(ImmunologicalSynapse,IS)形成的基礎(chǔ)，且持續(xù)的突觸形成是IL-2正常生成和T細(xì)胞完全發(fā)揮效應(yīng)功能所必需的。IBP分子中DH結(jié)構(gòu)域具有烏核苷酸交換因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF),能夠活化RhoGTP酶,包括RhoA,Racl和Cdc42,使其在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重建和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)及其他多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮廣泛作用。IBP分子上第210位的酪氨酸殘基能被LCK磷酸化，磷酸化后的IBP與PIP3結(jié)合，參與激活T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞相互接觸處的免疫突觸形成。研究發(fā)現(xiàn)IBP'—一T細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白聚合受損，IS的穩(wěn)定組建也不能持續(xù)，這個(gè)現(xiàn)象可部分解釋其受損的T細(xì)胞效應(yīng)反應(yīng)。由于RhoGTP酶在細(xì)胞骨架重塑中起重要作用而IBP在TCR依賴(lài)模式下能活化GTP酶，我們用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)證實(shí)了IBP缺失時(shí)所致的肌動(dòng)蛋白聚合缺陷與其活化PhoGTP酶的能力相關(guān)。有趣的是，T細(xì)胞缺少GEFs家族中另一成員Vav時(shí)亦能表現(xiàn)出細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的缺陷。說(shuō)明這些不同類(lèi)型的PhoGTP酶激活器的活性均被這些過(guò)程所必需，但此復(fù)雜的級(jí)聯(lián)過(guò)程中，IBP與Vav是共同作用于某特殊的調(diào)節(jié)步驟還是作用于不同階段還未可知。T細(xì)胞最佳功能?chē)?yán)格依賴(lài)于IS形成及細(xì)胞骨架重建，可以肯定的是，IBP缺失所致的自身免疫反應(yīng)與其導(dǎo)致的肌動(dòng)蛋白聚合及IS持續(xù)中的缺陷是相關(guān)的，但致使這種缺陷形成的具體步驟未明。IBP是一個(gè)與SWAP-70和顯著同源的新型Rac-GEF，在T細(xì)胞中高表達(dá)。IBP在TCR活化時(shí)被迅速磷酸化并募集到IS，此過(guò)程依賴(lài)于Lck和PI3K的活化，這些TCR介導(dǎo)的信號(hào)還能調(diào)控IBP活化Rac和Cdc42的能力，-使這些RhoGTP酶在月幾動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑和T細(xì)胞的適度發(fā)育和功能中起作用。IBP缺失小鼠中出現(xiàn)明顯的自身免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為效應(yīng)/記憶1細(xì)胞和^0+B細(xì)胞的積聚，高r球蛋白血癥、產(chǎn)生自身抗體，T細(xì)胞凋亡障礙等，但誘發(fā)過(guò)程的分子機(jī)制未明。免疫穩(wěn)態(tài)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究IBP在自身免疫穩(wěn)態(tài)的和腫瘤發(fā)生中分子機(jī)制并結(jié)合臨床自身免疫性疾病與腫瘤患者體內(nèi)IBP表達(dá)水平與病程的關(guān)系，有望為自身免疫性疾病和腫瘤的診斷與治療提供新的靶點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系，利用本發(fā)明所述表達(dá)體系制備的重組IBP為抗原免疫動(dòng)物制備的抗IBP抗體或直接檢測(cè)IBP核酸的試—瞼。本發(fā)明所述表達(dá)體系包含表達(dá)載體和干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段。其中上述的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段具有SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，上述的表達(dá)載體包括pGEX-KG/IBP或pET-32a/IBP。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供上述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法，其主要包含以下步驟1)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段的克??；2)步驟1)獲得的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段與所述表達(dá)載體連接，然后轉(zhuǎn)化受體菌，獲得干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒；3)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白；4)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白的鑒定與純化5)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白的濃度的測(cè)定。其中步驟1)中可以采用RT-PCR法克隆所述干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段，所采用的RT-PCR引物優(yōu)選為SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5，其步驟l)可具體包括a)人白細(xì)胞總RNA的提取；b)以SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5為引物，以步驟a)中獲得的人白細(xì)胞總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR,克隆干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段；c)步驟b)中克隆得到的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段的回收與純化。上述重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法的步驟4)中優(yōu)選為采用陰離子交換層析柱/GST柱親和層析或陰離子交換層析柱/鎳柱親和層析純化所述干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白；步驟5)中可采用Lowry法測(cè)定重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系表達(dá)的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白的應(yīng)用，其可用于制備免疫檢測(cè)用試劑盒或治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明采用的表達(dá)體系的思想不局限于所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系，任何采用上述表達(dá)體系的思想所表達(dá)的人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白也同樣可用于制備免疫檢測(cè)用試劑盒或治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道，^r測(cè)IBP(蛋白或核酸，包括與其序列同源性大于85%的同源性分子)或其與某些細(xì)胞成分相互作用的物質(zhì)或其與某些細(xì)胞成分相互作用產(chǎn)生的物質(zhì)的任何方法都可用作診斷不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)或不希望有的物質(zhì)成分產(chǎn)生的疾病，包括癌癥，自身免疫性疾病的方法。這類(lèi)方法包括基于利用本發(fā)明所述表達(dá)體系制備的重組IBP為抗原免疫動(dòng)物制備的抗IBP抗體或直接檢測(cè)IBP核酸的試驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道，當(dāng)本發(fā)明所述IBP(蛋白或核酸，包括與其序列同源性大于85%的同源性分子)或其與某些細(xì)胞成分相互作用的物質(zhì)或其與某些細(xì)胞成分相互作用產(chǎn)生的物質(zhì)作為治療靶點(diǎn)的時(shí)候，能夠激動(dòng)或者抑制IBP(蛋白或核酸，包括與其序列同源性大于85%的同源性分子)或其與某些細(xì)胞是人工合成配體都可用作治療不希望有的細(xì)胞生長(zhǎng)或不希望有的物質(zhì)成分產(chǎn)生的疾病，包括癌癥，自身免疫性疾病。這些天然配體或者是人工配體可以是肽，抗體及其片段，脂質(zhì)，糖和其它有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物。這些分子能夠進(jìn)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞并影響IBP(蛋白或核酸，包括與其序列同源性大于85%的同源性分子)的表達(dá)或者其它一些基因的表達(dá)。計(jì)算機(jī)模型制作和檢索技術(shù)可以鑒定化合物，或改良已鑒定的化合物，所述化合物可以影響IBP的表達(dá)或活性。所述化合物的有效劑量可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測(cè)定這類(lèi)化合物的毒性和治療效力，例如測(cè)定LD50(是50%群體致死的劑量)和ED50(對(duì)50%群體治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比例是治療指數(shù)，可將該指數(shù)表示為L(zhǎng)D50/ED50的比值。優(yōu)選出高治療指數(shù)的化合物。盡管可使用表現(xiàn)出毒副作用的化合物，但應(yīng)精心設(shè)計(jì)出可將這類(lèi)化合物靶向受影響的組織位點(diǎn)的傳遞系統(tǒng)，以使其對(duì)未受影響的細(xì)胞的潛在損害最小化，從而降低副作用。對(duì)于本發(fā)明中提及的IBP(蛋白或核酸，包括與其序列同源性大于85%的同源性分物質(zhì)而言，最初可從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中估計(jì)治療有效劑量?？稍趧?dòng)物模型中配制劑量以達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50(即使一半的癥狀達(dá)到最大抑制的受試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可被用于更精確的測(cè)定人的有用劑量。通過(guò)例如高效液相層析可測(cè)定血漿中的水平?；衔锏呐渲坪褪褂每砂匆环N或多種生理可接受的載體或賦形劑，按常規(guī)方法配制本發(fā)明所用的藥物組合物。因此，化合物及其生理可接受的鹽和溶劑化物可#1配制成經(jīng)吸入或吹入(通過(guò)口或鼻)給藥，或口，頰，非腸道或直腸給藥。為了口服給藥，藥物組合物可采取例如使用藥物可接受的賦形劑通過(guò)常規(guī)方法制備得到的片劑或膠嚢的形式。所述賦形劑如結(jié)合劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、濕潤(rùn)劑，可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法包被片劑?？诜囊后w制品可采取例如溶液，糖槳或懸液的形式，或以干產(chǎn)物的形式提供，使用前再用水或其它適當(dāng)載體配制。使用藥物可接受的添加劑，通過(guò)常規(guī)方法可制備這種液體制劑，所述添加劑如懸浮劑(如山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)；不含水的載體(如杏仁油,油狀酯，乙基醇或分級(jí)分離的植物油)；和防腐劑(如對(duì)羥基苯甲酸曱酯或丙酯或山梨酸)。適當(dāng)時(shí)，制劑中也可含有緩沖的鹽，調(diào)味劑，著色劑和甜味劑?？诜苿┛蛇m當(dāng)?shù)呐渲瞥煽蒯屝问降幕钚曰衔?。頰內(nèi)施用的組合物可采取以常規(guī)方法配制的片劑或錠劑形式。為了通過(guò)吸入給藥，可以用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，如二氯二氟曱烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適當(dāng)氣體，由加壓的容器或噴霧器以氣溶膠噴霧形式方便的傳遞根據(jù)本發(fā)明使用的化合物。對(duì)加壓氣溶膠而言，通過(guò)提供閥來(lái)傳遞按規(guī)定供給的量可以測(cè)定劑量單位，可配制用于吸入劑或吹入劑的例如明膠膠嚢和藥筒配，它們含有化合物和適當(dāng)粉末主劑(如乳糖或淀粉)的粉末混和物。可以配制通過(guò)注射而非腸道給藥的化合物，如巨丸劑注射或連續(xù)灌注?？梢詥挝粍┝啃问教峁┳⑸溆玫脑噭?。組合物可采用例如油狀或含水載體中的懸浮液，溶液或乳劑的形式，可含有配劑，如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是使用前用例如無(wú)菌無(wú)熱原水這樣的適當(dāng)載體配制的粉末形式。也可將化合物配置成直腸用組合物，如含有常Mi全劑主劑(如可可酯或其它甘油酯)的栓劑或保留灌腸劑。除了上述制劑外，也可將化合物配制成緩釋制劑，因此，.例如，可用適當(dāng)?shù)木酆衔锘蚴杷晕镔|(zhì)配制化合物(例如配置成可接受油中的乳劑)，或用離子交換樹(shù)脂配制化合物，或?qū)⒒衔锱渲瞥缮匀苄匝苌铮缟匀苄喳}的形式。必要時(shí)，可以用可含有一個(gè)或多個(gè)含活性成分的單位劑量形式的包裝或分配器裝置來(lái)提供組合物。例如，包裝可含有金屬或塑料箔，如泡罩包裝。包裝或分配器裝置中附有給藥說(shuō)明。通過(guò)閱讀本發(fā)明各個(gè)方面的描述，本發(fā)明的這些和其它目的對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。圖1為RT-PCR克隆得到的IBP基因片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中M為DNAMarkerDL2000,泳道14為PCR擴(kuò)增的IBP基因片段。圖2A為pGEX-KG/1BP質(zhì)粒雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的圖譜，其中M為DNAMarkerIII,泳道l3為pGEX-KG/IBP質(zhì)粒雙酶切，泳道4為pGEX-KG/IBP質(zhì)粒。圖2B為pET-32a/IBP質(zhì)粒雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的圖譜，其中M為DNAMarkerDL2000,泳道12為pET-32a/IBP質(zhì)粒雙酶切，泳道3為pET-32a/IBP質(zhì)粒。和pET-32a/IBP.圖3為重組蛋白pGEX-KG/IBP和pET-32a/IBPSDS-PAGE電泳鑒定圖譜，其中泳道1為中科院預(yù)染蛋白Marker,泳道2為pET-Wa/IBP/BUl未誘導(dǎo)，泳道3為pET-32a/IBP/BL21誘導(dǎo)，泳道4為His/IBP陰離子層析純化，泳道5為His/IBPHis親和層析純化，泳道6為pGEX-KG/IBP/BL21未誘導(dǎo)，泳道7為pGEX-KG/IBP/BL21誘導(dǎo)，泳道8為GST/IBP陰離子層析純化，泳道9為GST/IBPGST親和層析純化。具體實(shí)施方式定義本發(fā)明中，除非另有定義，所用的所有科技術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義相同。本申請(qǐng)所用的命名和下述的實(shí)驗(yàn)方法是本領(lǐng)域所眾所周知的和常用的。重組核酸方法，微生物培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化中使用的是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，一般根據(jù)廠商的具體說(shuō)明進(jìn)行。一般根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和貫穿本文提供的一般性的參考文獻(xiàn)(參見(jiàn)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版(2001)，冷泉港)進(jìn)行技術(shù)和方法。本發(fā)明中所用的命名和下述的分析化學(xué)、有機(jī)物合成化學(xué)和藥液配制實(shí)驗(yàn)室方法是本領(lǐng)域眾所周知和常用的?；瘜W(xué)合成、化學(xué)分析、藥液配制和傳遞以及患者的診斷和治療使用的是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。本發(fā)明中所用術(shù)語(yǔ)"序列同源性"描述了兩個(gè)核酸之間堿基配對(duì)的比例或兩個(gè)氨基酸序列之間的氨基酸配對(duì)的比例。當(dāng)序列同源性以百分比，如85%表示時(shí)，百分比表示與一些其它序列相比，IBP序列整個(gè)長(zhǎng)度配對(duì)的比例。缺口(兩個(gè)序列中的任一個(gè)中)是允許的，這樣可使配對(duì)最大化；本發(fā)明所述"基本上純的"指的使所需的物質(zhì)種類(lèi)是存在的占優(yōu)勢(shì)的種類(lèi)(即在分子基礎(chǔ)上，它的組合物中任何其它大分子的單個(gè)種類(lèi)更豐富)，優(yōu)選基本上純的組分是其中所需物質(zhì)種類(lèi)占存在的所有大分子種類(lèi)的至少50%(在分子基礎(chǔ)上)的成分。一般而言，基本上純的成分占組合物中存在的所有大分子種類(lèi)的約80%以上，更優(yōu)選為85%,90%或90%以上。材料和來(lái)源菌抹和質(zhì)粒大腸桿菌克隆菌抹DH5a和大腸桿菌表達(dá)菌林BLH均為申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室保存，pGEX-KG購(gòu)自Pharmacia公司，pET-32a購(gòu)自Novagen公司。酶及試劑盒RT-PCR試劑盒購(gòu)自Promega/^司，月交回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，Trizol試劑購(gòu)自Gibco/BRL,限制性?xún)?nèi)切酶fcoRI、#//dIII、I購(gòu)自Toyobo/>司，質(zhì)^4由^d式劑盒購(gòu)自Promega/>司。PCR引物由上海英俊公司合成。親和層4斤4主購(gòu)自Pharmacia7>司。實(shí)施例1表達(dá)并分離純化得到重組人IBP片段1.RT-PCR法獲得IBP基因(1)引物設(shè)計(jì)與合成才艮據(jù)GenBank中已發(fā)表的IBPcDNA序列(SEQIDNO:6):設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異引物。設(shè)計(jì)針對(duì)pGEX-KG的IBP相對(duì)特異序列(AA410631)上游引物為SEQIDNO:2_5，-CGGAATTCATATGCAGGCAGATGGAG-3'(含I位點(diǎn))；下游引物為SEQIDNO:3—5，-CCCAAGCTTATTTTCTGGTGCTGGATC-3,(含#//dIII位點(diǎn));針對(duì)pET-32a的IBP相對(duì)特異序列(AA410631)上游引物為SEQIDNO:4—5，-CGGAATTCATGCAGGCTGAGATGGA-3，(含fcdlI位點(diǎn))；下游引物為SEQIDNO:5_5，-GACGTCGACTATTTTCTGGTGCTGGATC-3，(含I位點(diǎn))。將上述引物委托上海英俊公司進(jìn)行合成。(2)人白細(xì)胞總RNA提取淋巴細(xì)胞分離；l.在試管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上。水平離心2000rpmx20分鐘。離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另試管中，加入5倍體積的Hank's液，"OOrprnxlO分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。加入適量Trizol試劑，RNA提取參見(jiàn)Trizol試劑操作手冊(cè)。(3)RT-PCRRT-PCR按Promega公司的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行將1mg外周血白細(xì)胞總RNA和1julOligo(dT)引物加入到14.2ji1DEPC處理的水中，70。C加熱5分鐘后，水浴5分鐘，再依次加入5|i15x反應(yīng)緩沖液、1.25hi1dNTP、1ju1M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、0.55|li1RNA酶抑制劑，終體積為25(i1,42°C2小時(shí)，95€變性5分鐘，-20。C保存。取上述RT產(chǎn)物1ju1,lOx反應(yīng)緩沖液5|ul,上下游引物各l)il(終濃度為50pmol)，dNTP2jul，Taq酶1ja1(2U),25mmol/LMgCl22.5jil，ddH2036.5jal，總體積為50jal。94。C預(yù)變性4分鐘，然后94。Cl分鐘，55。Cl分鐘，72°Cl分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物10(i1做1.5%瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)得到大小約為670bp的特異性片段(圖1)(SEQIDNO:1所示的核苷酸序列)。(4)IBP目的基因的回收紫外燈下切下含特異PCR產(chǎn)物的膠條，放入EP管中稱(chēng)重，加入3倍體積的緩沖液QG，5(TC水浴10分鐘直至膠條完全融化，并檢查顏色是否是黃色，如為紫色或才登色，加10jal3niol/L醋酸鈉(pH5.0)，混勻直至顏色恢復(fù)，加入等膠條體積的100°/異丙醇(如lmg膠加ly1)，顛倒混勻，將l個(gè)MinElute柱放入提供的2ml收集管中，并放于架子上，將全部樣品移入柱內(nèi)，離心1分鐘，倒出流過(guò)柱子的液體，將MinElute柱;故回同一收集管中，力口500jjl緩沖液QG于MinElute柱內(nèi)，離心1分鐘，倒出流過(guò)柱子的液體，將MinElute柱放回同一收集管中，力口750jil緩沖液PE于MinElute柱內(nèi)洗滌，放置5分鐘后離心1分鐘，倒出流過(guò)柱子的液體，離心1分鐘，將MinElute柱放入l個(gè)干凈的l.5ml離心管,加IOml緩沖液EB于MinElute柱上的膜中心，洗脫DNA，柱子放置l分鐘后離心l分鐘，收集洗脫的DNA。2.IBP重組質(zhì)粒構(gòu)建將pGEX-KG載體用fcoRI和&'"dIH雙酶切消化3小時(shí)后與回收并雙酶切PCR產(chǎn)物用LDNA連接酶4。C過(guò)夜連接，將pET-32a載體用5^/1和NdeI雙酶切消化3小時(shí)后，與回收并雙酶切的PCR產(chǎn)物用T4DNA連4妄酶4。C過(guò)^艾連接。取一無(wú)菌離心管，加入已制備好的感受態(tài)DH5oc菌200iLi1,水浴，吸取卩()jal連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5a菌，輕拍管壁混勻，水浴30分鐘，42。C水浴90秒，取出離心管再水浴2分鐘，加入80Qjal室溫的LB培養(yǎng)液混勻，37。C搖床22Qrpm振蕩培養(yǎng)l小時(shí)，將菌液離心后涂于2個(gè)含氨卞青霉素抗性的LB培養(yǎng)板上，37。C恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于了氨卞青霉素(100iag/ml)LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。3.IBP重組質(zhì)粒酶切鑒定沉淀菌體，12000rpm,離心l分鐘，棄上清，盡量吸干，用150yl預(yù)冷的溶液I將上述細(xì)菌沉淀重懸，劇烈振蕩，新鮮配制的溶液I1300jLil輕輕顛倒混勻5次，冰浴3-5分鐘，使其澄清，加入預(yù)冷的溶液ffl150yl，輕輕混勻后冰浴10分鐘，使蛋白質(zhì)均勻分布于水相中，加入預(yù)冷的溶液IV15Qjil，輕輕混勻，12000rpm離心10分鐘。小心吸取水相(約400|a1)移于另一l.5ml離心管中,加入2jalRNaseA(lOjig/ml)，55。C水浴10分鐘。再加400p1Tris-酚及400lil氯仿，渦振混勻，12000rpm離心10分鐘。取上清至另一裝有600jal異丙醇的1.5ml離心管中，來(lái)回顛倒幾次，4°C12000rpm離心10分鐘，棄上清。用70%乙醇1ml洗滌DNA2次，12000rpm離心3分鐘，棄上清，室溫干燥10-20分鐘，加入TE20|a1溶解質(zhì)粒DNA，-2G°C保存。取pGEX-KG/IBP和pET-32a/IBP10|il質(zhì)粒雙酶切后跑l.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均可見(jiàn)切下的一個(gè)大小約為670bp的特異片段，表明質(zhì)粒中已插入大小約為670bp的片段(圖2)。4.IBP重組質(zhì)粒插入片斷測(cè)序?qū)蓚€(gè)重組質(zhì)粒送往上海英^^公司測(cè)序，并應(yīng)用Blast軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank的IBPcDNA進(jìn)行同源性分析。測(cè)序的結(jié)果顯示，插入片段與GenBank中才艮道的IBPcDNA序列完全一致。5.IBP片段的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定(1)轉(zhuǎn)化BL21菌取上次提取的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌，涂布于含氨千青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)箱過(guò)4復(fù)培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。(2)IBP片段的誘導(dǎo)表達(dá)將擴(kuò)大培養(yǎng)的轉(zhuǎn)pGEX-KG/IBP和pET-32a/IBP重組質(zhì)粒的BL21菌，用LB固體培養(yǎng)基篩選單克隆菌落，將轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)細(xì)菌OD值達(dá)O.6-0.8時(shí)加入終濃度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)，按時(shí)間點(diǎn)2、4、6、8、10、12小時(shí)收集誘導(dǎo)的細(xì)菌。結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌出現(xiàn)分子量約為53kD和46kD的特異性蛋白條帶，與預(yù)期重組IBP的分子量值相符，且6小時(shí)時(shí)IBP表達(dá)量最高，約占細(xì)菌總蛋白的30%。再將IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)的BL21重組菌用裂菌液破菌，離心后分別取上清和沉淀電泳，未誘導(dǎo)的菌液和誘導(dǎo)6小時(shí)的菌液分別做陰性和陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果在上清中與陽(yáng)性對(duì)照IBP片段條帶相對(duì)應(yīng)的位置發(fā)現(xiàn)特異蛋白條帶，而沉淀無(wú)此蛋白條帶，證實(shí)IBP片段為可溶性表達(dá)。6.IBP重組蛋白的純化1)誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)化有pGEX-KGZ/5尸重組質(zhì)粒的BL21。4。C離心收集細(xì)菌。以陰離子交換層析A液重懸沉淀，水浴超聲破碎后4。C離心，用O.45jim濾膜過(guò)濾后留待上柱。結(jié)合緩沖液(A液)20mmol/LTris-HCl,pH8.0。洗脫緩沖液(B液):20mmol/LTris-HCl，1.Omol/LNaCl，pH8.0。將陰離子交換層析柱HiTrapQ接入AKTAExplorer,以100ml洗脫緩沖液沖洗B道，再以100ml結(jié)合緩沖液平衡A道，流速5.0ml/分鐘，至UV280曲線(xiàn)呈水平即可上樣；將上一步制備好的樣品用系統(tǒng)泵上樣，流速5.Oml/分鐘；上樣完全后以結(jié)合緩沖液平衡至監(jiān)測(cè)曲線(xiàn)呈水平；隨后進(jìn)行梯度洗脫20個(gè)柱體積內(nèi)B液由0%升至100%，流速為5.Oml/分鐘，收集流穿峰和洗脫峰，將收集的產(chǎn)物取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。選擇目的條帶較純的洗脫液進(jìn)行下一步純化。pGEX-KG/7》戶(hù)重組蛋白陰離子純化產(chǎn)物再進(jìn)行GST柱親和層析配置GST柱所需緩沖液結(jié)合緩沖液(A液):20mmol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl，pH7.3。洗脫緩沖液(B液)50mmol/LTris-HCl，10mmol/L谷胱甘肽，pH8.0。測(cè)？0￡乂-10}//》戶(hù)重組蛋白陰離子洗脫液離子強(qiáng)度，根據(jù)所測(cè)值用NaCl調(diào)其離子強(qiáng)度與GST結(jié)合緩沖液同，再將pH值調(diào)至7.3左右。接入GST親和層析柱GSTrapFF,以A、B液平衡各自管道，上樣，梯度洗脫，方法同前。純化產(chǎn)物于12.5%SDS-PAGE電泳鑒定。2)誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)化有pET-32a/IBP重組質(zhì)粒的BL21。4。C離心收集細(xì)菌。處理方式及陰離子交換層析過(guò)程同前。將pET-32a/75尸重組蛋白陰離子純化產(chǎn)物進(jìn)行4臬柱親和層析，配置所需緩沖液結(jié)合緩沖液(A液):20mmol/LTris-HCl，0.5tnol/LNaCl，pH8.0。洗脫緩沖液(B液)20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl,0.5mol/L咪唑，pH8.0。測(cè)pET-32aZ/i尸重組蛋白陰離子洗脫液離子強(qiáng)度，4艮據(jù)所測(cè)值用NaCl調(diào)其離子強(qiáng)度與鎳柱結(jié)合緩沖液同。才妄入石危酸4臬處理后的his親和層4斤柱HiTrapchelatingHP，以A、B液平衡各自管道，將調(diào)整好的陰離子純化產(chǎn)物上樣，梯度洗脫。l2.5%SDS-PAGE電泳鑒定。(圖3)7.IBP重組蛋白濃度。(1)Lowry法(Folin酚法)測(cè)定IBP片^^"含量制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在650nm波長(zhǎng)下，以空白管為對(duì)照調(diào)零，分別測(cè)定各管的吸光度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，只作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將待測(cè)蛋白稀釋后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A則值和，A則值。根據(jù)公式，蛋白濃度C-(1.45xA28。-0.75xA26。)x稀釋倍數(shù)，計(jì)算出待測(cè)蛋白的粗略濃度，然后將蛋白樣品用蒸餾水稀釋至25-250Mg范圍，按照上表的操作程序反應(yīng)，測(cè)定出650nm吸光度值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的濃度，在乘以稀釋倍數(shù)計(jì)為待測(cè)蛋白的濃度，多管計(jì)算平均值，測(cè)得pGEX-KG/IBP濃度為1.0mg/ml，pET-32a/IBP為0.6mg/ml。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。序列表<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系及制備方法與應(yīng)用〈130〉8P99015-CN<騰6<170>Patentlnversion3.2<210〉1<211〉666<212>DNA<213〉重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段序列〈400〉1atgcaggctg卿tggagctgaaggaggaggaggctgcccggcagcggcagcgcatcaag60gagctggaggagatgcagcagcggttgcaggaggccctgcaactagaggtga犯gctcgg120cg,tgaagaatctgtgcgaatcgctcagaccagactgctgga卿ggagga卿gaag180ctgaagcagttgatgcagctg幼gg3gg3gcaggagcgctacatcgaacgggcgcagcag240gagaagg朋gagctgcagcagg卿tggcaC3gC3g3gCCgctccctgcagcaggcccag300cagcagctggaggaggtgcggc卿accggc卿gggctgacg鄉(xiāng)atgtggaggctgcc360cagagaaaactgcgccaggccagc3ccai3cgtgaaacactggaatgtccagatgaaccgg420ctgatgcatccaattgagcctgg卿taagcgtccggtcaccagcagctccttctcaggc480ttccagccccctctgcttgcccaccgtgactcctccctaaagcgcctgscCCgCtgggg3540tcccagggcaacaggaccccctcgcccaac3gC33tg3gCagcagaagtccctcaatggt600gggg3tgeiggctcctgccccggcttccacccctcaggaagataaactggstccagcacca660gaaaat666〈210〉2<211>26〈212〉DNA〈213〉針對(duì)pGEX-KG的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白相對(duì)特異序列(AA410631)上游引物序列〈400〉2cggaattcatatgcaggcagatggag26〈210〉3〈211>27<212〉DNA<213>針對(duì)pGEX-KG的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白相對(duì)特異序列(AA410631)下游引物序列<400〉3cccaagcttattttctggtgctggatc27<210〉4〈211〉25<212>DNA<213〉針對(duì)pET-32a的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白相對(duì)特異序列(AA410631)上游引物序列<400〉4cggaattcatgcaggctgagatgga25〈210>5<211>28<212〉DNA<213>針對(duì)pET-32a的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白相對(duì)特異序列(AA410631)下游引物序列〈400〉5gacgtcgactattttctggtgctggatc28〈210〉6<211〉2280<212DNA〈213〉GenBank中已發(fā)表的千擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白cDNA序列〈400〉6tggccctgcgcaagg犯ctgctcaagtccatctggtacgcctttaccgcgctggacgtgg60卿聊gtggcaaagtctccaagtcccagctc犯ggtgctgtcccacaacctgtacacgg120tcctgcacatcccccatgaccccgtggccccttccgagatgatgatgacg180gccctgtgtccagccaggg已tacatgccctacctcaacaagtacatcctggacaaggtgg240ttttgttaaagagcactttgatgagctgtgctggacgctgacggccaaga300已g3act3tcgggc卿tagc犯cggg3已cagtatgctctccaatcaggatgccttccgcc360tctggtgcctcttcaacttcctgtctgaggacaagtaccctctgatcatggttcctgatg420鄉(xiāng)tgg犯t已cctgctgaaaa3ggt3ctcagC3gC3tg3gcttggaggtgagcttgggtg■agctggaggagcttctggcccagg鄉(xiāng)cccaggtggcccagaccaccggggggctcagcg540tctggcagttcctggagctcttcaattcgggccgctgcctgcggggcgtgggccgggaca600ccctcagcatggccatccacgaggtctacc3ggagctcatccaagatgtcctg肪gc鄉(xiāng)660<213>人工序列<220><223>PEZ005反義引物<400>8tractgtatacaacattgtc20<210>9<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>PEZ006正義引物<400〉9atgagcactgggtgttatac20<210〉10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>PEZ006反義引物<400>102C2ca^ttgc2ttgtcaaac20權(quán)利要求1.一種重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系，其特征在于該表達(dá)體系包含表達(dá)載體和干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系，其特征在于所述的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系，其特征在于所述的表達(dá)載體包括pGEX-KG/IBP或pET-32a/IBP。4.權(quán)利要求1所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法，其特征在于包含以下步驟1)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段的克?。?)步驟1)獲得的千擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段與所述表達(dá)載體連接，然后轉(zhuǎn)化受體菌，獲得干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒；3)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白；4)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白的鑒定與純化；5)干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白的濃度的測(cè)定。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法，其特征在于步驟1)中采用RT-PCR法克隆所述干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法，其特征在于步驟l)中采用的RT-PCR引物為SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組人千擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法，其特征在于步驟l)包括a)人白細(xì)胞總RNA的提??；b)以SEQIDNO:2-3或SEQIDNO:4-5為引物，以步驟a)中獲得的人白細(xì)胞總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR,克隆干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段；c)步驟b)中克隆得到的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段的回收與純化。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法，其特征在于步驟4)中采用陰離子交換層析柱/GST柱親和層析或陰離子交換層析柱/鎳柱親和層析純化所述干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法，其特征在于步驟5)中采用Lowry法測(cè)定重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)含量。10.權(quán)利要求1所述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系表達(dá)的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白用于制備免疫4企測(cè)用試劑盒或治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及一種重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系，該表達(dá)體系包含表達(dá)載體和干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段，其中所述的干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白基因片段具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列；本發(fā)明還涉及上述的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系的制備方法；本發(fā)明的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白表達(dá)體系表達(dá)的重組人干擾素調(diào)節(jié)因子4結(jié)合蛋白可用于制備免疫檢測(cè)用試劑盒或治療癌癥或自身免疫性疾病的藥物。利用本發(fā)明所述表達(dá)體系制備的重組IBP為抗原免疫動(dòng)物制備的抗IBP抗體或直接檢測(cè)IBP核酸的試驗(yàn)。文檔編號(hào)C12N15/12GK101225391SQ20081006936公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年2月15日優(yōu)先權(quán)日2008年2月15日發(fā)明者張竹君,鵬李,李淑慧,胡川閩,安陳申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)