專利名稱：一種重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物疫苗的開發(fā)，尤其涉及一種重組減毒鼠傷寒沙門氏菌 載體疫苗及制備方法。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌(EHEC) 0157:H7是腸出血性大腸桿菌的一個主要血清 型，感染該菌可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎、也可引發(fā)溶血性尿毒綜合征及血 小板減少性紫癜等并發(fā)癥，嚴重者可導(dǎo)致死亡。自1982年被確定為致病菌的20 多年間，世界各地已發(fā)生了多起0157的暴發(fā)流行，表明0157: H7的感染已成為 一個全球性的公共衛(wèi)生問題。然而目前缺乏有效的防治方法，研究證實抗生素 可促使0157菌釋放致死性志賀毒素(Stx)，從而使患者并發(fā)溶血性尿毒綜合癥的 危險性增加，因此，研制0157疫苗對預(yù)防和控制0157感染有著極其重大的意義。EHEC 0157:H7的致病性主要體現(xiàn)于細菌在宿主體內(nèi)的粘附定植和產(chǎn)生毒 素兩個方面。粘附與定植是細菌感染的第一步。緊密粘附素(Intimin)是一種分子 量約為96KD的跨膜蛋白，也是0157菌重要而特異的粘附分子。細菌主要通過 Intimin及其受體(轉(zhuǎn)位緊密粘附素受體，Tir)的相互作用粘附于腸上皮細胞，引起 擦拭性(A/E : attaching/effacing)損傷。Intimin的膜外區(qū)(C端片段IntiminC)是與 Tir受體結(jié)合的功能區(qū)。有實驗指出Intimin及IntiminC的特異性抗體均可以阻斷細 菌的粘附進而使其喪失致病力，具有較強的免疫保護性 (Aleksic.S,H.Karch，J.BockemuhI，et al.A biotyping scheme for Shia-like(Vero) toxin-producing Escherichia coli 0157 and a list of serological cross-reactions between 0157 and other Gramnegative bacteria.Int.J.Med.Microbiol.1992: 276: 221-230)。而引起和介導(dǎo)O157細菌粘附定植的主要結(jié)構(gòu)單元EHEC III型分泌系統(tǒng) (type-Ill secretion system,TTSS)的分泌蛋白EspA(Esp為E. coli secreted protein縮寫)可以在細菌表面形成管狀結(jié)構(gòu)，是多種效應(yīng)蛋白及Tir進入宿主細胞的通道， 同時也參與A/E損傷形成時信號的傳遞。有研究表明EspA具有良好的免疫原性和 免疫保護性。此外，EHEC 0157:H7主要產(chǎn)生兩種毒素，分別稱為志賀毒素I(Stxl) 和志賀毒素11(Stx2) ( Paola Marcato ， George Mulvey ， Randy J.Read ， et al.Imm皿oprophylactic Potential of Cloned Shiga Toxin 2B Subunit.J Infect Dis.2001; 183: 435-443)。在細菌體內(nèi)，Stx2為分泌型表達，Stxl為胞內(nèi)表達。 兩種毒素均由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞單位具有細胞內(nèi)毒性，能與 28S rRNA作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成停止，是大腸桿菌0157:H7引起臨床表現(xiàn)的病理 基礎(chǔ)；B亞單位具有細胞結(jié)合特性，能與特定受體(Gb3)的細胞結(jié)合，從而引導(dǎo)A 亞單位發(fā)揮作用。志賀毒素(Stx)—方面直接殺死腸絨毛表面的上皮細胞，另一 方面由Stx引起的腸上皮損傷以LPS、炎性因子能促進Stx穿越腸上皮細胞進入血 液循環(huán)造成腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及Gb3受體含量較高的器官的損傷。多數(shù) 0157:H7細菌產(chǎn)生Stx2，其毒性強于Stxl，與溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓形 成性血小板減少性紫癜(TTP;i等嚴重并發(fā)癥的相關(guān)性更為密切，因此Stx2是該菌 致病性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。Paola Marcato等克隆表達了志賀樣毒素II結(jié)合亞單位 (Stx2B)并探索了其免疫保護性，發(fā)現(xiàn)Stx2B無毒，且具有良好的免疫保護性，針 對Stx2B的單克隆抗體具有阻斷毒素的作用(Paola Marcato， George Mulvey， Randy J.Read， et al.Immunoprophy lactic Potential of Cloned Shiga Toxin 2B Subunit.J Infect Dis.2001; 183: 435-443)。減毒鼠傷寒沙門氏菌能通過粘附、侵襲、定居在腸道相關(guān)淋巴組織，并經(jīng) 腸系膜淋巴結(jié)到達肝臟、脾臟，進一步有效地刺激機體產(chǎn)生粘膜、細胞和體液 免疫應(yīng)答，是攜帶抗原的良好載體和天然粘膜免疫佐劑，已成為疫苗接種的新 途徑。根據(jù)共同粘膜免疫理論，以減毒傷寒沙門氏菌為載體制成的口服疫苗可 在口腔、乳腺、生殖道、淚腺等粘膜部位誘發(fā)較強的粘膜免疫，且口服接種的 方式安全，可以避免因注射免疫而造成艾滋病毒及肝炎病毒等的感染。特別是 近來利用不以抗生素作為選擇壓力的載體-宿主平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建的減毒鼠傷寒 沙門氏菌載體疫苗已顯示出良好的應(yīng)用前景。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有0157:H7基因工程疫苗存在保護效果不佳等不足之處，旨 在通過構(gòu)建以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的腸出血性大腸桿菌0157:H7疫苗和 口服與皮下或肌肉注射蛋白相結(jié)合的聯(lián)合免疫策略提供了一種新型的0157:H7 疫苗，本發(fā)明的提供的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，其包含抗原亞單位 EspA、 IntiminC300禾卩Stx2B,其中，上述的抗原亞單位EspA、 IntiminC300和 Stx2B來源于腸出血性大腸桿菌0157: H7。本發(fā)明的另外一個目的是提供上述重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗的制 備方法，其主要包括以下步驟1) 通過 PCR 方法獲得融合基因 EspA-IntiminC300 、 EspA-IntiminC300-Stx2B;2) 融合基因分別與表達載體連接，得到重組表達質(zhì)粒；3) 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一中間宿主菌株，獲得重組子；4) 重組子轉(zhuǎn)化第二中間宿主菌株，鑒定陽性重組子；5) 步驟4)中鑒定正確的陽性重組子轉(zhuǎn)化終宿主菌株；6) 誘導(dǎo)表達，得到重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗；7) 鑒定步驟6)中得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗中EspA、 IntiminC300、 Stx2B的表達；8) 檢測步驟6)中得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗中EspA、 IntiminC300、 Stx2B的免疫原性；9) 重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗攻毒保護實驗；10) 在有、無選擇壓力的情況下進行體外傳代培養(yǎng)，鑒定重組減毒鼠傷寒 沙門氏菌載體疫苗穩(wěn)定性。其中步驟1)中通過PCR方法獲得EspA-IntiminC300時使用的PCR引物如 SEQ ID NO: 1-2所示，通過PCR方法獲得EspA-IntiminC300-Stx2B時使用的PCR 引物如SEQIDNO:3-4所示；步驟2)中所述的表達載體優(yōu)選為pYA3149;步驟 3)中所述的第一中間宿主菌株優(yōu)選為大腸桿菌X6097;步驟4)中所述的第二 中間宿主菌株優(yōu)選為減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730;步驟5)中所述的終宿主菌株優(yōu)選為減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550,其中所述的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550優(yōu) 選為asd基因缺陷型菌株；步驟8)中可以通過Western免疫印跡檢測EspA、 IntiminC300、 Stx2B的免疫原性。本發(fā)明的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗可以用于免疫腸出血性大腸桿 菌，其可通過口服免疫或加強免疫，口服免疫具體可為約4xl08CFU/只/次， 每次間隔1 2周；加強免疫具體可為口服免疫2~4次后間隔一定時間通過皮 下或肌肉注射蛋白的方式加強免疫一次，這里所述的一定時間視生物體的情況 而定，可以為一周或一個月等。本發(fā)明采用平衡一致死系統(tǒng)構(gòu)建了表達腸出血性大腸桿菌(EHEC)0157:H7 EspA、 IntiminC300、 Stx2B融合蛋白的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗株， 并且構(gòu)建的疫苗株無論有無選擇壓力均能穩(wěn)定地在體外傳代培養(yǎng)，通過口服疫 苗菌株和皮下或肌肉注射重組蛋白相結(jié)合的免疫方案免疫小鼠后證明該疫苗具 有良好的免疫原性和免疫保護效果。本發(fā)明的優(yōu)點主要在于1)成功構(gòu)建了重 組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體，并且有效表達了腸出血性大腸桿菌(EHEC) 0157:H7 EspA、 IntiminC300、 Stx2B融合蛋白；2)利用鼠傷寒沙門氏菌同腸 出血性大腸桿菌一樣都是腸道菌，容易粘附、定植到粘膜系統(tǒng)的特性有效地激 發(fā)粘膜免疫；3) 口服載體疫苗菌株與皮下或肌肉注射蛋白相結(jié)合的聯(lián)合免疫策 略大大提高了對于高危人群(老人、小孩)、高發(fā)流行地區(qū)或季節(jié)的免疫效果， 有效預(yù)防和控制腸出血性大腸桿菌(EHEC) 0157:H7感染，降低感染率；4) 這種免疫策略對其他疫苗也有借鑒意義。本發(fā)明的口服載體疫苗菌株與皮下或肌肉注射蛋白相結(jié)合的聯(lián)合免疫策略 大大提高了對于高危人群(老人、小孩)、高發(fā)流行地區(qū)或季節(jié)的免疫效果，有 效預(yù)防和控制腸出血性大腸桿菌(EHEC) 0157:H7感染，降低感染率。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳 實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。
圖1:重組質(zhì)粒pYA3149- EspA-IntiminC300構(gòu)建策略圖；圖2: EspA-IntiminC300 PCR結(jié)果，其中泳道1為核酸(DNA)分子量標準 (Marker)，泳道2 EspA-IntiminC300 PCR結(jié)果(約1476bp);圖3:重組質(zhì)粒pMDl8-T-EspA-IntiminC300的酶切鑒定圖，泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker),泳道2為pMD18-T-EspA-IntiminC300 EcoRI和HindIII雙酶切結(jié)果； 圖4:重組質(zhì)粒pYA3149-EspA-IntiminC300/x6097的酶切鑒定， 泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker),泳道2為pYA3149-EspA-IntiminC300/x6097 EcoRI和HindIII雙酶切結(jié)果；圖 5 : PCR 鑒定 pYA3149-EspA-IntiminC300/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300/X4550結(jié)果，泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker),泳道 2 、 3 分另U 為 pYA3149-EspA-IntiminC300/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300/X4550 PCR結(jié)果；圖6:重組質(zhì)粒pYA3149- EspA-IntiminC300-Stx2B構(gòu)建策略圖；圖7: EspA-IntiminC300-Stx2B的PCR結(jié)果，泳道1為EspA-IntiminC300-Stx2B PCR結(jié)果，泳道2為核酸(DNA)分子量標準(Marker);圖8 :重組質(zhì)粒pYA3149—EspA-IntiminC300-Stx2B/X6097的酶切鑒定結(jié)果，泳道1、 3分別為重組質(zhì)粒pYA3149 —EspA-IntiminC300-Stx2B /X6097 EcoRI和HindIII雙酶切結(jié)果，泳道2為核酸(DNA)分子量標準(Marker);圖 9 : PCR 鑒定 pYA3149-EspA-IntiminC300陽Stx2B/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/X4550結(jié)果，泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker),泳道 2 、 3 分另lj為 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/X3730 及 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/X4550 PCR結(jié)果；圖 10 : 重組蛋白pYA3149-EspA-IntiminC300/x4550 、 pYA3149-EspA-IntiminC300-Stx2B/x4550的表達，泳道l， 2， 3， 4分別表示IPTG誘導(dǎo)48、 24、 12、 6小時的重組菌株，泳道5為誘導(dǎo)前的重組菌株，泳道6為IPTG誘導(dǎo)4小時的pYA3149/X4550，泳道7為蛋白分子量標準；圖ll: west-blotting鑒定EspA-IntiminC300、 EspA-IntiminC300-Stx2B的免疫反應(yīng)性，泳道l、 4、 7 分別為EspA、 IntiminC300和Stx2B的正對照，泳道2、 5、 8 分別為同EspA的單克隆抗體反應(yīng)的EspA蛋白、同 IntiminC300多克隆抗體反應(yīng)的IntiminC300蛋白和同Stx2B多克隆抗體反應(yīng)的 Stx2B蛋白，泳道3、 6、 9為負對照；圖12A-12F:小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、回腸末端免疫熒光檢測結(jié)果，其中12A為小鼠脾臟陰性對照(x400)， 12B為免疫后小鼠脾臟免疫熒光檢測 (x400)， 12C為小鼠腸系膜淋巴結(jié)陰性對照(x400)， 12D為免疫后小鼠腸系膜淋巴 結(jié)免疫熒光檢測(x400)， 12E為小鼠回腸末端陰性對照(x400)， 12F為免疫后小鼠 回腸末端免疫熒光檢測0400)。
具體實施方式
本發(fā)明利用pYA3149的載體-宿主平衡致死系統(tǒng)表達EHEC0157:H7的EspA 及l(fā)ntiminC300、 Stx2B的融合保護性抗原，構(gòu)建以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的 腸出血性大腸桿菌(EHEC) 0157:H7疫苗，并通過動物實驗觀察重組載體疫苗 的免疫原性及免疫保護性，為發(fā)展新型的0157疫苗提供實驗依據(jù)。本發(fā)明首先釆用基因工程技術(shù)克隆了 EspA-IntiminC300和EspA-IntiminC300- Stx2B基因，并利用表達載體pYA3149成功地在終宿主菌-減毒鼠 傷寒沙門氏菌X4550中進行了表達。本發(fā)明所用的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550 具有如下特征其為asd基因缺陷型細菌，由于asd基因是DAP(二氨基庚二酸， 革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分)生物合成途徑中必需的酶，該基因的缺失可導(dǎo) 致該突變株在無外源性DAP存在的條件下溶菌死亡，從而高效減毒。減毒鼠傷 寒沙門氏菌能表達外源抗原,在哺乳動物中經(jīng)口、鼻、直腸等粘膜途徑免疫能誘 導(dǎo)強大而特異的免疫反應(yīng)。能夠定居在宿主小腸和腸相關(guān)淋巴組織，不致病并且 能穩(wěn)定表達外源基因。所表達的靶抗原不需純化，可直接用于免疫保護試驗， 免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序。在融合蛋白的構(gòu)建中，以本申請人的專利申請，
發(fā)明者抒 余, 劉艷青, 寧元元, 張衛(wèi)軍, 勇 易, 毛旭虎, 王慶旭, 程建平, 童文德, 肖大平, 鄒全明, 穎 馬 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)