專利名稱：：一種用作NT-proBNP免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品的重組蛋白及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種用作NT-proBNP免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品的重組蛋白及制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：心血管疾病在中國、甚至全球，都是嚴(yán)重威脅人類生命和健康的重要疾病。世界衛(wèi)生組織在2004年9月26日第5個"世界心臟日"時，在日內(nèi)瓦發(fā)表的一份公報中指出，全球每年有1700萬人死于心臟病和其他心血管疾病，約占全球死亡人數(shù)的1/3,預(yù)計到2020年這個數(shù)字將突破2000萬，心血管疾病和中風(fēng)將成為人類死亡和致殘的首要原因。其中，心力衰竭(HeartFailure,HF)是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病中的一種病理綜合癥，如今已不再被簡單地看作是獨立臨床疾病，而是作為心血管疾病發(fā)展到后期的一個階段。從始發(fā)危險因子(高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病)到左心室肥大、心肌細(xì)胞功能紊亂、冠心病，最后發(fā)展成為心力衰竭。2003年，中國心血管健康多中心合作研究組應(yīng)用四階段整群隨機抽樣方法，在中國10省市抽樣調(diào)查，結(jié)果顯示心衰患病率為0.9%，隨著年齡增高，心衰患病率顯著上升，北方明顯高于南方1.4%對0.5°/。，女性1.0%高于男性0.9%。由于我國冠心病和高血壓發(fā)病仍呈上升趨勢，人口老齡化趨勢明顯，HF正成為我國心血管領(lǐng)域的重要公共衛(wèi)生問題。在發(fā)達(dá)國家，HF是一種常見情況，影響著1%-2°/。的人口，并且有著很高的死亡率，特別是在老年患者中。有學(xué)者統(tǒng)計，心力衰竭患者一旦出現(xiàn)典型癥狀，5年存活率男性為25%,女性為38%，與惡性肺瘤病人相仿。目前慢性心臟衰竭在70歲以上老年人群中的發(fā)病率約為10%以上。有資料顯示，由于飲食習(xí)慣的改變等原因，中國目前有2億人超重、7000萬人肥胖，高血壓和高血脂的人數(shù)都超過1.6億，所有這些，導(dǎo)致了中國的冠心病、中風(fēng)等心血管疾病患者呈爆發(fā)性增長。在發(fā)達(dá)國家，約有7%的人群患有此病，但只有2%的人被診斷出來，還沒有特異性生化參數(shù)和治療監(jiān)測方法。HF的不良預(yù)后，使越來越多的學(xué)者開始考慮應(yīng)打破傳統(tǒng)的觀念，于尚未出現(xiàn)明顯"充血性"癥狀之前就著手干預(yù)治療，從根本上防治HF，延緩HF發(fā)展進程，提高患者的遠(yuǎn)期存活率。HF盡早發(fā)現(xiàn)是非常重要的，因為，如果被發(fā)現(xiàn)得早，通常它是能用藥物控制的。因此，對心衰的預(yù)防和及時正確的診斷和治療非常重要。傳統(tǒng)根據(jù)病史和體征對心衰患者的診治及長期監(jiān)控是非常不完善的，常需住院來調(diào)節(jié)體液的潴留。如果有一個能有效監(jiān)控心衰的生化標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷，那將是非常有效的。因此，心臟生物化學(xué)標(biāo)志物的準(zhǔn)確有效的應(yīng)用，顯得更加重要。目前研究證實，B型鈉尿肽(BNP)或非活性的N末端前鈉尿肽(NT-ProBNP)是心衰時較好的心臟標(biāo)志物，能反映心室容積擴大、心室超負(fù)荷和心臟功能有無損傷及損傷程度。早在2000年"Heart"雜志在一篇名為"BNP:很快成為治療心衰患者的常規(guī)措施"的編者社論中就明確認(rèn)為腦鈉肽或B型鈉尿肽(brainnatriureticpeptide,B-typenatriureticpeptide;BNP)有助于i貪斷心衰，可作為心衰患者預(yù)后標(biāo)志物，是一種較新的監(jiān)控心衰的方法。BNP是一種鈉尿肽，由心室分泌的類肽化合物，具有利鈉、利尿、舒血管、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的作用。研究表明容量負(fù)荷引起的心室壓力改變以及室壁張力的增加是刺激BNP分泌的因素。BNP是32個氨基酸的多肽，是從氨基酸前體蛋白(pro-BNP)中的羧基端裂解而來，同時產(chǎn)生76個氨基酸非活性的N末端腦鈉尿肽原(NT-proBNP),在血中濃度隨BNP升高而升高。MuellerT與Hervas等研究發(fā)現(xiàn)血漿BNP、NT-proBNP濃度的升高對于心衰的診斷具有很高敏感性，可作為心力衰竭診斷的敏感指標(biāo)，并能評估心功能損害嚴(yán)重程度。NT-proBNP和含有C端32個氨基酸的具有生物活性的BNP是等摩爾釋放，因此二者在心血管系統(tǒng)疾病的診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后方面有著相似的臨床應(yīng)用。但與BNP相比，NT-proBNP因其半衰期長(半衰期為120min)、心衰時升高幅度大而更有利于臨床應(yīng)用。美國FDA在2000年11月22日首次批準(zhǔn)了BiositeDiagnostics公司用于幫助診斷充血性心力衰竭的BNP試劑盒，BiositeDiagnosticsTriageBNP。這是一種床旁檢驗(POCT),使用六滴全血或血漿可在15分鐘完成此項檢測。如以100pg/ml為診斷心衰判斷值時，特異性為95.6%，靈壽文度為82.4%。與紐約心臟學(xué)會(NYHA)的心衰功能分級分相比，發(fā)現(xiàn)BNP的化驗具有敏感、準(zhǔn)確、快速的特點，能夠準(zhǔn)確地反映心衰的嚴(yán)重程度，并與心衰的功能分級有良好的相關(guān)性，而且更能分辨出早期的心臟功能紊亂。早期實驗的研究對象多是急診室呼吸困難、肺病、心臟病患者，顯示BNP、NT-proBNP與心衰具有很好的相關(guān)性，有些心力衰竭患者BNP正常，陽性預(yù)測值達(dá)到90°/。-95%，其陰性預(yù)測能力更具有價值。當(dāng)急性心力衰竭出現(xiàn)左室充盈壓增加的臨床綜合征以及如缺血、肺栓塞等任何導(dǎo)致肌細(xì)胞伸展的情形，化驗NT-proBNP非常有益，同時對于鑒別呼吸困難是否為心源性原因具有重要意義，優(yōu)于臨床判斷。另夕卜，NT-proBNP還能輔助判斷進展期心衰患者的預(yù)后，以及對左心室功能不全的治療進行監(jiān)測和指導(dǎo)。2000年左右，國際上已經(jīng)認(rèn)定腦鈉肽前體，NT-proBNP,是測定心衰的一個劃時代的具有特異性的標(biāo)志物。2002年11月19日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市NT-proBNP,一種用于實驗室?guī)椭\斷充血性心力衰竭(congestiveheartfailure)的新的酶聯(lián)免疫4企測試劑盒。這種4全測試劑，ElecsysproBNP測定(ElecsysproBNPImmunoassay),是由印地安納州Indianapolis的羅氏診斷學(xué)公司(RocheDiagnostics,Inc)制造的。FDA批準(zhǔn)這種檢驗試劑是基于生產(chǎn)廠商在美國和歐洲16個醫(yī)學(xué)中心對2000多位健康和病患男女進行的臨床研究。此項研究顯示充血性心力衰竭癥狀的嚴(yán)重性與NT-proBNP的水平有關(guān)。目前，中國國內(nèi)的醫(yī)院使用的同類產(chǎn)品，全部依賴進口，而且國際上只有少數(shù)幾家公司擁有此項技術(shù)。如前所述，NT-ProBNP作為一種良好的心肌標(biāo)志物已經(jīng)獲得臨床認(rèn)可，得到廣泛的應(yīng)用，但由于目前的相關(guān)檢測試劑依賴進口，導(dǎo)致患者使用成本相對較高，進口的NT-ProBNP的ELISA檢測試劑盒的價格為7200元人民幣/96次檢測、RIA檢測試劑盒的價格為9800元/125次檢測。定量檢測人NT-proBNP常用的是免疫學(xué)方法，建立免疫學(xué)定量檢測方法除了需要特異性良好的抗體之外，還需要相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)品與之配套。目前國際還沒有國際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品提供，中國國內(nèi)使用的標(biāo)準(zhǔn)品是由提供NT-ProBNP試劑的公司單獨提供，并且價格昂貴，每包裝達(dá)到上萬元。由于NT-proBNP的分子量僅由8.9KD,在體內(nèi)降解速度較快，在血液中穩(wěn)定約48小時。人體內(nèi)NT-proBNP極低,正常外周血濃度為100pg/ml左右；因而無法從血漿(血清)中純化，NT-proBNP主要由心肌組織生成，以上使得天然NT-ProBNP多肽制備十分困難。而直接多肽合成成本過高。用基因工程制備低分子量多肽，一般采用融合蛋白表達(dá)，能克服單獨表達(dá)低分子量多肽時出現(xiàn)的翻譯效率低表達(dá)產(chǎn)物易受蛋白水解酶降解的缺陷,但較大的標(biāo)簽蛋白對小分子蛋白的免疫原性有一定的影響。所以通常使用一些蛋白酶切除標(biāo)簽蛋白，切除標(biāo)簽后的蛋白需要進一步純化和去除加入的蛋白酶，操作比較麻煩并且蛋白酶十分昂貴。對檢測標(biāo)準(zhǔn)品要求主要為與天然存在的人NT-proBNP有相同或相近的結(jié)構(gòu)，具有相同的免疫原性及高度的穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種NT-proBNP重組蛋白，其具有選自于下列a)或b)的氨基ll^列a)SEQIDNO:l所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后仍具有所述NT-proBNP重組蛋白活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種編碼上述NT-proBNP重組蛋白的核苷酸序列，其具有選自下歹'Jc)、d)或e)的核苷酸序列c)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQIDNO:2但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:2所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；e)在嚴(yán)格雜交條件下與上述c)或d)中的序列雜交，并且編碼具有所述NT-proBNP重組蛋白活性的核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其主要包含以下步驟1)根據(jù)GENEBANK中提供的BNP編碼序列，獲得NT-proBNP的編碼序列SEQIDNO:3，將編碼序列SEQIDNO:3同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子獲得編碼序列SEQIDNO:4，進行NT-proBNP基因的克隆，獲得NT-proBNP基因；2)NT-proBNP基因與載體連接，構(gòu)建NT-proBNP重組質(zhì)粒，獲得NT-proBNP重組質(zhì)粒；3)NT-proBNP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行NT-proBNP重組蛋白的表達(dá)，獲得NT-proBNP重組蛋白；4)NT-proBNP重組蛋白的可溶性鑒定；5)NT-proBNP重組蛋白的純化；6)NT-proBNP重組蛋白的濃度、純度鑒定；7)NT-proBNP重組蛋白的活性鑒定。上述制備方法中，步驟1)包括將編碼序列SEQIDNO:3中第41、54、69、73、76位氨基酸同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子，根據(jù)改造后的基因序列設(shè)計N端引物和C端引物；其中上述的大腸桿菌優(yōu)選為BL21。上述的N端引物優(yōu)選為SEQIDNO:5或SEQIDNO:6所示的核香酸序列；C端引物優(yōu)選為SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。上述步驟1)還包括采用核心模板法，采用上述的N端引物和C端引物，進行基因拼接PCR擴增上述的NT-proBNP基因。上述制備方法中，步驟2)中使用的載體包括pET32a或pET42a。上述制備方法中，步驟5)包括采用陽離子交換層析純化，其中采用的陽離子交換介質(zhì)優(yōu)選為快流速瓊脂糖凝膠(SPSepharoseFastFlow)。上述制備方法中，步驟5)還包括采用親和層析純化，其中采用的親和層析純化介質(zhì)優(yōu)選為快流速組氨酸標(biāo)簽(HistrapFastFlow)。上述制備方法中，步驟5)還包括脫鹽柱(Desalting)處理。上述的步驟5)具體包括以下步驟①將含目的NT-proBNP重組蛋白的破菌上清用快流速瓊脂糖凝膠初純化，采用連續(xù)洗脫并收集目的NT-proBNP重組蛋白蛋白峰；②初純化的NT-proBNP重組蛋白用快流速組氨酸標(biāo)簽親和層析柱再次純化，洗脫采用40mM和500mM咪唑階段洗脫收集后者；③用脫鹽柱脫鹽和去除咪唑，流動相緩沖為50mMTris-HCl，pH8.0;脫鹽后NT-proBNP重組蛋白內(nèi)加入帶有His標(biāo)簽的重組EK酶，重組EK酶與NT-proBNP重組蛋白量比為1:1000,置于4。C低速搖床24-48小時；⑤再次用快流速組氨酸標(biāo)簽親和層析柱純化及去除重組EK酶，洗脫采用40mM和500mM咪唑階段洗脫，40mM洗下蛋白即為所需NT-proBNP重組蛋白。上述制備方法中，步驟6)中采用Lowry法(Folin酚法)測定NT-proBNP重組蛋白濃度；采用高效液相色譜法(HPLC)測定NT-proBNP重組蛋白純度。本發(fā)明還有一個目的是提供上述的NT-proBNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用，其可代替天然NT-proBNP多肽用作NT-proBNP免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品，或NT-proBNP重組蛋白用于制備NT-proBNP檢測試劑盒。本發(fā)明獲得的NT-proBNP重組蛋白為含83個氨基酸的多肽，與天然NT-proBNP的76個氨基酸相比，僅在N端多帶有7個從融合表達(dá)蛋白切下的氨基酸-AMADIGS。經(jīng)密碼子改造的基因構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)，大腸桿菌表達(dá)蛋白制備工藝簡單，價格低廉，能大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)明獲得的NT-proBNP重組蛋白為含83個氨基酸的多肽在純化過程中發(fā)現(xiàn)，它在與融合蛋白切開后能非特異性的結(jié)合到HisTrapHP柱，經(jīng)(20mmol/Lsodiumphosphate,0.5MNaCl,20-50mmol/L咪唑pH7.4)可以將其洗脫，而未切開的蛋白及切下的標(biāo)簽蛋白與加入的EK酶(帶His標(biāo)簽)不能洗脫，達(dá)到純化分離和去除加入的蛋白酶的效果，制備的NT-proBNP-83純度很高，方法簡單，所用的純化材料也是很常見的純化填料。并且研究發(fā)現(xiàn)在相同的保存條件和測定條件下，Trx-NT-proBNP在4。C保存15天活性下降為7.8%;NT-proBNP-83(表示共83個氨基酸的NT-proBNP蛋白)下降了13.2%;而NT-proBNP-76(表示共76個氨基酸的NT-proBNP蛋白)下降了47.0%,Trx-NT-proBNP和NT-proBNP-83的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于NT-proBNP-76。由于NT-proBNP-83切除了標(biāo)簽蛋白，與天然存在的人NT-proBNP相比僅在N端多7個氨基酸，具有相同或相近的結(jié)構(gòu)，能被現(xiàn)在的NT-proBNP的檢測試劑檢測，其具有與天然NT-proBNP相同的免疫原性，而且純度高，有更好的穩(wěn)定性；而且上述的純化工藝簡單，成產(chǎn)成本j氐。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。圖1為基因拼接(GeneSOEing)PCRS1物設(shè)計原理圖；圖2為NT-proBNP基因密碼子偏性分析圖，其中柱高值在10以下的部分為在大腸桿菌使用頻率較低的密碼子；圖3GeneSOEingPCR構(gòu)建NT-proBNP基因的電泳圖，其中M為Marker;泳道l、2、3、4、5為笫一輪PCR的產(chǎn)物；泳道6為第二輪PCR產(chǎn)物；泳道7為第三輪PCR產(chǎn)物；泳道8為以S1和A1為引物的PCR產(chǎn)物，泳道9為以S2和A1為？1物的PCR產(chǎn)物；圖4為pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；圖5為pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒的測序圖譜；圖6為pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖，其中M為Marker;泳道l為pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒誘導(dǎo)；泳道2為pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)；泳道3為空質(zhì)粒誘導(dǎo)；泳道4為空質(zhì)粒未誘導(dǎo)；圖7為NT-proBNP誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的可溶性鑒定，其中，泳道l為NT-proBNP誘導(dǎo)表達(dá)；泳道2為NT-proBNP破菌上清；圖8為Trx-NT-proBNP純化后蛋白與EK酶切割后電泳鑒定結(jié)果，其中M為Marker;泳道1為Trx-NT-proBNP未切割；泳道2為Trx-NT-proBNP切的標(biāo)簽；泳道3為NT-proBNP-83;圖9為Trx-NT-proBNP切割后HisTrapHP純化結(jié)果，8%B洗脫峰即為NT-proBNP-83,其中M表示Marker;泳道l為pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒誘導(dǎo)；泳道2為pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)；泳道3為空質(zhì)粒誘導(dǎo)；泳道4為空質(zhì)粒未誘導(dǎo)；圖10為pET42a-NT-proBNP重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖；圖11GST-NT-proBNP純化后蛋白與EK酶切割后電泳鑒定結(jié)果，其中M為Marker;泳道1為GST-NT-proBNP未切割；泳道2為GST-NT-proBNP切下的標(biāo)簽；泳道3為NT-proBNP-76。具體實施方式材料和來源菌種、質(zhì)粒、所用菌林Eco/ZBL21(DE3)、DH5a為本實驗室保存；pGEM-T購自promega7仝司；pET32a(+)及pET42a(+)購自Novagen^^司。主要試劑Sall、BamHI購自ToYoBo公司；pfiiDNA聚合酶、T4DNA連接酶購自promega公司；DL2000DNAMarker,DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自Tiangen生物科技有限公司；NT-proBNP檢測試劑盒購自Roche公司；蛋白質(zhì)BCA法定量4企測試劑購自P正RCE公司；蛋白質(zhì)Marker為中科院生物制品研究所產(chǎn)品；純化所用層析柱及填料購自Amersham公司；腸激酶(EK酶)為本室自制(帶HIS-Tag)。S1物合成及測序均由Invitrogen公司完成;其它試劑均為中國產(chǎn)化學(xué)分析純。實施例一NT-proBNP基因的克隆1引物設(shè)計與合成根據(jù)GENEBANK提供的BNP基因序列(CR54976)得到NT-proBNP編碼序列為pro-BNP基因中編碼第27-103個氨基酸的共228個堿基(SEQIDNO:3)。將此序列遞交于Graphicalcodonusageanalyzer(http:〃guca.schoedl.del)分析發(fā)現(xiàn)該基因中第41、54、69、73、76位氨基酸編碼的密碼子在￡.co//BL21中使用的頻率較低(參照圖2的NT-proBNP基因密碼子偏性分析圖，其中柱高值為10以下的部分為在大腸桿菌使用頻率較低的密碼子)，對其進行同義改造后獲得編碼序列SEQIDNO:4，將該編碼序列分十段合成并設(shè)計了一對特異引物-上游引物Sl(SEQIDNO:5)和下游引物Al(SEQIDNO:7)。上游引物Sl(SEQIDNO:5)為5'CGCGGATCCCACCCGCTGGG3'(含BamHI位點)；下游引物Al(SEQIDN0:7)為5'AGGCGTCGACTTAGCGCGGTGC3'(含SalI位點)，上下游引物的5'端均帶有保護堿基，將上述引物委托上海英駿生物工程有限公司進行合成。2基因拼接(GeneSOEing)PCR構(gòu)建NT-proBNP基因取合成的寡核苷酸引物片段l-10各100pmo1,按如下核心模板法進行PCR:①將引物1和2、3和4、5和6、7和8、9和10兩兩混合(片段1-10如表1所示)，按照pfU酶擴增反應(yīng)體系配成100pl(2.5mmol/L的dNTP各8pl,pfti緩沖液10^il,寡核苷酸片段各100pmol，pfU2U)反應(yīng)體系。PCR^應(yīng)條件94°C5min-(94。C30S,55°C30S，72°Clmin)X20國72。C5min。②以(5+6)的PCR產(chǎn)物為核心模板，(3+4)、(7+8)的PCR產(chǎn)物作為兩頭的引物，各取33pl混合，補加lUpfli，PCR^應(yīng)條件同上。③以3-8片段的PCR反應(yīng)產(chǎn)物為核心模板，(1+2)、(9+10)的PCR產(chǎn)物作為兩頭的引物，各取33(il混合，補加lUpfu,PC版應(yīng)條件同上。④用S1和A1端引物對組裝好的1-10的PCR產(chǎn)物進行擴增，反應(yīng)體系2.5mmol/L的dNTP各8^1，pfU緩沖液10fxl，第③步PCRA應(yīng)產(chǎn)物10iil，pfli2U,總體積lOOjil。PC版應(yīng)條件94°C5min-(94。C40s，60°C40S,72°Clmin)X25-72。C5min?；蚱唇釉韴D請詳見圖l。反應(yīng)結(jié)束后?、懿轿?0jil做1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳，證實得到大小為250的特異性片段(圖3)。表1:引物名稱引物序列l(wèi)-SEQIDNO:85'CACCCGCTGGGCAGCCCGGGTAGCGCCAGCGACCTGGAAACG3'2-SEQIDNO:95'CTGCTCCTGCAGGCCGCTCGTTTCCAGGTCGCTGGCGCTA3'3-SEQIDNO:105'AGCGGCCTGCAGGAGCAGCGCAACCATCTGCAGGGCAAACTG3'4-SEQIDNO:115'CCACCTGCAGCTCGCTCAGTTTGCCCTGCAGATGGTTGCG3'5-SEQIDNO:125'AGCGAGCTGCAGGTGGAGCAGACCAGCCTGGAGCCGCTGC3'6-SEQIDNO:135'ACCGGTCGGACGCGGGCTCTCCTGCAGCGGCTCCAGGCTGGTCTGCT3'7-SEQIDNO:145'AGGAGAGCCCGCGTCCGACCGGTGTCTGGAAGAGCCGCGAGGTGG3'8-SEQIDNO:155TGGCCACGGATGCCCTCGGTGGCCACCTCGCGGCTCTTCCAGAC3'9-SEGIDNO:165CCACCGAGGGCATCCGTGGCCACCGCAAAATGGTCCTGTACACCCTGC3'10-SEQIDNO:175TTAGCGCGGTGCGCGCAGGGTGTACAGGACCATTTTGCGG3'S卜SEQIDNO:55CGCGGATCCCACCCGCTGGG3'A1-SEQIDNO:75AGGCGTCGACTTAGCGCGGTGC3'3NT-proBNP目的基因的回收紫外燈下切下含特異PCR產(chǎn)物的膠條，放入EP管中稱重，加入3倍體積的緩沖液QG,50。C水浴10分鐘直至膠條完全融化，并^r查顏色是否是黃色，如為紫色或橙色，力口10iil3mol/L醋酸鈉(pH5.0)，混勻直至顏色恢復(fù)，加入等膠條體積的100%異丙醇(如lmg膠加lpl),顛倒混勻，將l個MinElute柱放入提供的2ml收集管中，并;^丈于架子上，將全部樣品移入柱內(nèi)，離心l分鐘，倒出流過柱子的液體，將MinElute柱放回同一收集管中，力口50(^1緩沖液QG于MinElute柱內(nèi)，離心l分鐘，倒出流過柱子的液體，將MinElute柱放回同一收集管中，力口750pl緩沖液PE于MinElute柱內(nèi)洗滌，放置5分鐘后離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，離心l分鐘，將MinElute柱放入l個干凈的1.5ml離心管，力口IOpl緩沖液EB于MinElute柱上的膜中心，洗脫DNA,柱子放置l分鐘后離心l分鐘，收集洗脫的DNA。實施例二pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒的構(gòu)建將pET32a載體和回收的PCR產(chǎn)物BamHI和SalI雙酶切消化4小時后用丁4DNA連接酶4。C過夜連接，取一無菌離心管，加入已制備好的感受態(tài)DH5a菌200^1，水浴，吸取liil連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5a菌，輕拍管壁混勻，水浴30分鐘，42。C水浴90秒,取出離心管再冰浴2分鐘，加入800pl室溫的2xYT培養(yǎng)液混勻，37。C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)l小時，分別將50pl、200)al及剩下的全部轉(zhuǎn)化菌液涂于3個含氨千青霉素抗性的2xYT培養(yǎng)板上，37。C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于2xYT培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。實施例三pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒的酶切鑒定沉淀菌體，12000rpm，離心l分鐘，棄上清，盡量吸干，用150pl預(yù)冷的溶液I將上述細(xì)菌沉淀重懸,劇烈振蕩，新鮮配制的溶液I1300pl輕輕顛倒混勻5次,冰浴3-5分鐘/f吏其澄清，加入預(yù)冷的溶液nil50^d，輕輕混勻后冰浴IO分鐘，使蛋白質(zhì)均勻分布于水相中，加入預(yù)冷的溶液IV150pl，輕輕混勻，12000rpm離心IO分鐘。小心吸取水相(約400pl)移于另一1.5ml離心管中，加入2plRNaseA(10嗎/ml)，55。C水浴10分鐘。再加400plTris-酚及400(xl氯仿，渦振混勻，12000rpm離心10分鐘。取上清至另一裝有600(al異丙醇的1.5ml離心管中，來回顛倒幾次，4°C12000rpm離心10分鐘，棄上清。用70%乙醇lml洗滌DNA2次，12000rpm離心3分鐘，棄上清，室溫干燥10-20分鐘，加入TE20|il溶解質(zhì)粒DNA，-20°C保存。取l(Hil質(zhì)粒用BamHl/SalI雙酶切后跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切反應(yīng)體系為pET32a-NT-proBNP質(zhì)粒DNA10pi,BamHISalIl|il，10x緩沖液K2pl，ddH206離心30秒，37°C水浴4小時，取酶切產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見切下的一個大小約為250bp的特異片段，表明pETllb質(zhì)粒中已插入大小約為250bp的片段(圖4)。實施例四pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒插入片斷測序?qū)ET32a/NT-proBNP重組質(zhì)粒送往上海英駿測序，并應(yīng)用Blast軟件將測序結(jié)果與設(shè)計序列比對。測序的結(jié)果顯示，插入片段長度為250bp，與設(shè)計的NT-proBNP序列完全一致(圖5)。實施例五NT-proBNP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定1轉(zhuǎn)化BL21菌取上次提取的重組pET32a-NT-proBNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌，涂布于含氨千青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),用堿裂解法提取質(zhì)粒，取質(zhì)粒用BamHI/SalI雙酶切4小時，酶切體系同前，并取酶切產(chǎn)物10pl行1.5。/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定與設(shè)計值一致。2NT-proBNP重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將擴大培養(yǎng)的轉(zhuǎn)pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒的BL21菌，用LB固體培養(yǎng)基篩選單克隆菌落,將轉(zhuǎn)化菌擴大培養(yǎng),測細(xì)菌OD值達(dá)0.6-0.8時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，按時間點2、4、6、8、10、12小時收集誘導(dǎo)的細(xì)菌。結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌出現(xiàn)分子量約為30kD的特異性蛋白條帶，與預(yù)期pET32a-NT-proBNP的分子量值相符，且6小時時NT-proBNP表達(dá)量最高，約占細(xì)菌總蛋白的30。/。。再將IPTG誘導(dǎo)6小時的BL21重組菌用裂菌液破菌，離心后分別取上清和沉淀電泳，未誘導(dǎo)的菌液和誘導(dǎo)6小時的菌液分別做陰性和陽性對照，結(jié)果在上清中與陽性對照重組蛋白條帶相對應(yīng)的位置發(fā)現(xiàn)特異蛋白條帶，而沉淀無此蛋白條帶，證實重組融合蛋白為可溶性表達(dá)(圖6)。3NT-proBNP重組蛋白的可溶性鑒定將lmlIPTG誘導(dǎo)6小時的菌液加入到離心管中，5000rpm離心10分鐘，收集細(xì)菌，1mlGTE液重懸細(xì)菌，5000rpm離心5分鐘，棄上清，1mlGTE重懸細(xì)菌，加入100(^1溶菌酶(10mg/ml),混勻，冰浴20分鐘，再依次加入20^1脫氧膽酸鈉(40mg/ml)、10(^1MgCl2(lmol/L)和5(ilDNaseI(1mg/ml)，室溫下顛倒混勻使溶液由稠變稀，12000rpm離心10分鐘，分別取上清和沉淀電泳，未誘導(dǎo)的菌液和^^導(dǎo)6小時的菌液分別作為陰性對照和陽性對照，觀察電泳結(jié)果(圖7)。實施例六NT-proBNP重組蛋白的純化轉(zhuǎn)化pET32a-NT-proBNP重組質(zhì)粒的菌經(jīng)1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，6000r/分鐘離心10分鐘，收集菌體，使用陽離子層析柱HiTmpSP.F.F的結(jié)合緩沖液(20mmol/Lsodiumphosphate,pH5.8)重懸后水上超聲破菌，4。C高速離心留上清經(jīng)過濾后用Amersham的AKTAprime上柱，Bindingbuffer平衡后用洗脫緩沖液(20mmol/L磷酸三鈉(sodiumphosphate),lMNaCl,pH5.8)線性洗脫，收集主洗脫峰。將含目的蛋白的洗脫峰用His-結(jié)合緩沖液(20mmol/Lsodiumphosphate,0.5MNaCl,pH7.4)按l:9的體積比稀釋后上HisTrapHP再次純化，His-結(jié)合緩沖液平衡后用His-洗脫緩沖液(20mmol/Lsodiumphosphate,0.5MNaCl,0.5M咪峻PH7.4)先10。/。B洗脫去除非特異性結(jié)合的雜蛋白，平衡后用100。/()B將目的蛋白洗下。將獲得的純化重組蛋白用HiTrapDesalting置換緩沖體系為EK切割緩沖液(50mmol/LTris-HCl,pH8.0)，按EK酶與蛋白1:1000的質(zhì)量比加入EK酶，4°C低速搖床(60r/min)切割12小時左右。切割后用His-結(jié)合緩沖液稀釋后HisTrapHP純化，分別收集穿透、10。/。B和100。/。B的蛋白，17.5%SDS-PAGE電泳進行鑒定。pET32a-NT-proBNP切下的蛋白除76個氨基酸的NT-proBNP外在其N端帶有7個質(zhì)粒氨基酸(Ala-Met-Ala-Asp-Ile-Gly-Ser)，共83個氨基酸，大小為9.5KD(記為NT-proBNP-83)。在純化過程中申請人發(fā)明發(fā)現(xiàn)其會以非特異的形式結(jié)合到HisTrapHP層析柱，在8。/。B(20mmol/Lsodiumphosphate,0.5MNaCl,40mM咪唑pH7.4)的條件-陂洗脫(圖8、圖9)。實施例七NT-proBNP重組蛋白的濃度、純度鑒定1Lowry法(Folin酚法)測定NT-proBNP-83蛋白質(zhì)含量表l:制備標(biāo)準(zhǔn)曲線單位(ml)__空白管標(biāo)準(zhǔn)管l標(biāo)準(zhǔn)管2標(biāo)準(zhǔn)管3標(biāo)準(zhǔn)管4標(biāo)準(zhǔn)管5標(biāo)準(zhǔn)蛋白液00.20.40.60.81.0蒸餾水1.00.80.60.40.20試劑曱5.0(室溫放置10分鐘)試劑乙_0.5(迅速混勻，反應(yīng)30分鐘)_在650nm波長下，以空白管為對照調(diào)零，分別測定各管的吸光度，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，只作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測蛋白稀釋后，紫外分光光度計測定A26o值和,A28o值。根據(jù)公式，蛋白濃度C-(1.45xA28o-0.75xA26o)x稀釋倍數(shù)，計算出待測蛋白的粗略濃度，然后將蛋白樣品用蒸餾水稀釋至25-250嗎范圍，按照上表的操作程序反應(yīng)，測定出650nm吸光度值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的濃度，在乘以稀釋倍數(shù)計為待測蛋白的濃度，多管計算平均值，測得濃度為1.240g/L。Tioredoxin-NT-proBNP經(jīng)HPLC檢測純度為98。/。，每升誘導(dǎo)菌獲得28.4mg該融合蛋白，經(jīng)切割后可以獲得7mg左右的NT-proBNP-83。2純化產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進行純度測定。Tioredoxin-NT-proBNP經(jīng)HPLC檢測純度為98。/。，每升誘導(dǎo)菌獲得28.4mg該融合蛋白，經(jīng)切割后可以獲得7mg左右純度達(dá)98.3。/。的NT-proBNP-83。實施例八天然76個氨基酸NT-proBNP重組蛋白的制備設(shè)計兩條N端引物S2(SEQIDNO:6)(5'GGATCCGATGATGATGATAAGCACCCGCTGGG3'),加入BamHI酶切位點，為EK酶的識別位點。用S2和Al端引物對組裝好的1-10的PCR產(chǎn)物進行擴增，反應(yīng)體系2.5mmol/L的dNTP各8jxl，pfli緩沖液10iJ，第③步PCR反應(yīng)產(chǎn)物10^1，pfU2U，總體積100(xl。PCR反應(yīng)條件94°C5分鐘-(94。C40秒，60°C40秒，72°C1分鐘)25個循環(huán)-72'C5分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，證實得到大小為250的特異性片段(圖3)。將pET42a載體和回收的PCR產(chǎn)物BamHI/SalI雙酶切消化4小時后用丁4DNA連接酶4。C過夜連接，取一無菌離心管，加入已制備好的感受態(tài)DH5a菌200^1，冰浴，吸取lial連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5a菌，輕拍管壁混勻，水浴30分鐘，42。C水浴90秒,取出離心管再冰浴2分鐘，加入800jal室溫的2xYT培養(yǎng)液混勻，37。C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)l小時，分別將50pl、200pl及剩下的全部轉(zhuǎn)化菌液涂于3個含卡那霉素抗性的2xYT培養(yǎng)板上，37。C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于2xYT培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。提取的重組pET42a/NT-proBNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌，涂布于含卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),用堿裂解法提取質(zhì)粒，取質(zhì)粒用BamHISalI雙酶切4小時，酶切體系同前，并取酶切產(chǎn)物IO|^1行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定與設(shè)計值一致。將擴大培養(yǎng)的轉(zhuǎn)pET42a/NT-proBNP重組質(zhì)粒的BL21菌，用LB固體培養(yǎng)基篩選單克隆菌落,將轉(zhuǎn)化菌擴大培養(yǎng)，測細(xì)菌OD值達(dá)0.6-0.8時加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo),按時間點2、4、6、8、10、12小時收集誘導(dǎo)的細(xì)菌。結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌出現(xiàn)分子量約為40kD的特異性蛋白條帶，與預(yù)期pET42a/NT-proBNP的分子量值相符，約占細(xì)菌總蛋白的30°/。。再將IPTG誘導(dǎo)6小時的BL21重組菌用裂菌液破菌，離心后分別取上清和沉淀電泳，未誘導(dǎo)的菌液和誘導(dǎo)6小時的菌液分別做陰性和陽性對照，結(jié)果在上清中與陽性對照重組蛋白條帶相對應(yīng)的位置發(fā)現(xiàn)特異蛋白條帶，而沉淀無此蛋白條帶，證實重組融合蛋白為可溶性表達(dá)(圖10)。轉(zhuǎn)化pET42a-N-proBNP重組質(zhì)粒的菌經(jīng)1.Ommol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后使用GSTrapF.F.初純化，使用GSTmpF.F.的結(jié)合緩沖液(20mmol/Lsodiumphosphate,0.15MNaCl，pH7.3)重懸后水上超聲破菌，4°C高速離心留上清經(jīng)過濾后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脫液(50mmol/LTris-HCl，10mmol/L還原型谷胱苷肽，pH8.0)洗脫,收集洗脫蛋白，洗脫蛋白也用HisTrapHP再次純化，方法與上同。將獲得的純化重組蛋白用HiTrapDesalting置換緩沖體系為EK切割緩沖液(50mmol/LTris-HCl，pH8.0),按EK酶與蛋白1:1000的質(zhì)量比加入EK酶，4。C低速搖床(60r/分鐘)切割12小時左右。切割后用His-結(jié)合緩沖液稀釋后HisTrapHP純化，分別收集穿透、10。/。B和100。/。B的蛋白，17.5%SDS-PAGE電泳進行鑒定。pET42a-NT-proBNP表達(dá)的融合蛋白是以GST-NT-proBNP形式存在，經(jīng)EK酶切后得到76個氨基酸的目的蛋白(記為NT-proBNP-76)，其氨基酸序列與天然完全相同。GST-NT-proBNP經(jīng)HPLC4全測純度為90%,每升誘導(dǎo)菌獲得38.5mg融合蛋白，經(jīng)切割后可以獲得3.5mg左右的NT-proBNP-76(圖11)。實施例九NT-proBNP-83特異免疫反應(yīng)性鑒定采用Roche公司NT-proBNP檢測試劑盒測定其特異免疫反應(yīng)性稀釋成合適的濃度后，將稀釋后的蛋白lpl加入到299^1的人血清中，分別測定人血清和加了重組蛋白的人血清中NT-proBNP含量。經(jīng)Roche電化學(xué)發(fā)光免疫測定試劑測定其特異免疫反應(yīng)性，結(jié)果如下(表2)。制備的四種NT-proBNP重組蛋白均具有較強的特異免疫反應(yīng)活性，但切下的NT-proBNP-76和NT-proBNP-83免疫反應(yīng)活性明顯優(yōu)于帶有標(biāo)簽的NT-proBNP蛋白，原因可能為大分子量標(biāo)簽對NT-proBNP特異免疫反應(yīng)活性的影響，而NT-proBNP-76可能由于存在降解的小片斷使蛋白定量結(jié)果偏低。表2:電化學(xué)發(fā)光免疫測定試劑測定重組NT-proBNP特異免疫反應(yīng)性(濃度單位pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>增加濃度=測定濃度-人血清測定濃度；理論增加濃度=(融合蛋白分子量/NT-proBNP分子量)*蛋白純度*蛋白濃度；實施例十NT-proBNP重組蛋白穩(wěn)定性試驗將純化的NT-proBNP重組蛋白用保存液(含BSA、抑肽酶aprotinin、EDTA和慶大霉素)稀釋后等份分裝，各種蛋白初始濃度相近。置于4。C保存，分別于1、3、7、9、11、15d后后用NT-proBNP電化學(xué)發(fā)光免疫測定試劑測定，計算免疫活性比率。測定結(jié)果如下(表3)。表3:NT-proBNP重組蛋白穩(wěn)定性試驗(濃度單位pg/ml)測定樣品ld3d7d9dlld15d保存液<5<5<5<5<5<5Trx-NT-proBNP993598869703945093339158NT-proBNP-83124321236612309117921158910795NT-proBNP-76889276636946640256234709結(jié)果表明在相同的保存條件和測定條件下，Trx-NT-proBNP在4。C保存15天活性下降為7.8%;NT-proBNP-83下降了13.2%;而NT-proBNP-76下降了47.0%,Trx-NT-proBNP和NT-proBNP-83的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于NT-proBNP-76。由于NT-proBNP-83切除了標(biāo)簽蛋白，與天然存在的人NT-proBNP相比僅在N端多7個氨基酸，具有有相同或相近的結(jié)構(gòu)，能被現(xiàn)在的NT-proBNP的檢測試劑檢測，故認(rèn)為可以代替天然NT-proBNP多肽用于NT-proBNP免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品。雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動與改進，因此本發(fā)明的保護范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>—種用作NT-proBNP免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品的重組蛋白及制備方法與應(yīng)用<130>8P99004-CN<160>17<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>83<212>PRT<213>NT-proBNP重組蛋白氨基酸序列<400>1AlaMetAlaAsplieGlySerHisProLeuGlySerProGlySerAla151015SerAspLeuGluThrSerGlyLeuGinGluGinArgAsnHisLeuGin202530GlyLysLeuSerGluLeuGinValGluGinThrSerLeuGluProLeu354045GinGluSerProArgProThrGlyValTipLysSerArgGluValAla505560ThrGluGlylieArgGlyHisArgLysMetValLeuTyrThrLeuArg65707580AlaProArg<210>2<211>250<212>DNA<213>編碼NT-proBNP重組蛋白的核苷酸序列<400>2cgcggatcccacccgctgggcagcccgggtagcgccagcgacctggaaacgagcggcctgcaggagcagcgcaaccatctgcagggcaaactgagcgagctgcaggtggagcagaccagcctggagccgctgcaggagagcccgcgtccgaccggtgtctggaagagccgcgaggtggccaccgagggcatccgtggccaccgcaaaatggtcctgtacaccctgcgcgcaccgcgctaacagctgcgga60120180240250<210>3<211>228<212>DNA<213>GENEBANK中獲得的NT-proBNP編碼序列<400>3cacccgctgggcagccccggttcagcctcggacttggaaacgtccgggttacaggagcag60cgcaaccatttgcagggcaaactgtcggagctgcaggtggagcagacatccctggagccc120ctccaggagagcccccgtcccacaggtgtctggaagtcccgggaggtagccaccgagggc180atccgtgggcaccgcaaaatggtcctctacaccctgcgggcaccacga228<210>4<211>228<212>DNA<213>同義置換后的NT-proBNP編碼序列<400>4cacccgctgggcagcccgggtagcgccagcgacctggaaacgagcggcctgcaggagcag60cgcaaccatctgcagggcaaactgagcgagctgcaggtggagcagaccagcctggagccg120ctgcaggagagcccgcgtccgaccggtgtctggaagagccgcgaggtggccaccgagggc180atccgtggccaccgcaaaatggtcctgtacaccctgcgcgcaccgcgc228<210>5<211>20<212>DNA<213>擴增NT-proBNP基因的上游引物<400>5cgcggatcccacccgctggg<210>6<211>32<212>DNA<213>擴增NT-proBNP基因的上游引物<400>6ggatccgatgatgatgataagcacccgctggg<210>7<211>22<212>DNA<213>擴增NT-proBNP基因的下游引物<400>7aggcgtcgacttagcgcggtgc203222>DNA<213>人工合成的引物序列<400>8cacccgctgggcagcccgggtagcgccagcgacctggaaaeg42<210>9<211>40<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>9ctgctcctgcaggccgctcgtttccaggtcgctggcgcta40<210>10<211>42<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>10agcggcctgcaggagcagcgcaaccatctgcagggcaaactg42<210>11<211>40<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>11ccacctgcagctcgctcagtttgccctgcagatggttgcg40<210>12<211>40^212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>12agcgagctgcaggtggagcagaccagcctggagccgctgc40<210>13<211>47<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>13accggtcggacgc鵬ctctcctgcagcggctccaggctggtctgct47<210>14<211>45<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>14aggagagcccgcgtccgaccggtgtctggaagagccgcgaggtgg45<210>15<211>44<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>15tggccacggatgccctcggtggccacctcgcggctcttccagac44<210>16<21>48<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>16ccaccgagggcatccgtggccaccgcaaaatggtcctgtacaccctgc48<210>17<211>40<212>DNA<213>人工合成的引物序列<400>17ttagcgcggtgcgcgcagggtgtacaggaccattttgcgg40權(quán)利要求1.一種NT-proBNP重組蛋白，其特征在于具有選自于下列a)或b)的氨基酸序列a)SEQIDNO1所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后仍具有所述NT-proBNP重組蛋白活性的氨基酸序列。2.—種編碼權(quán)利要求1的NT-proBNP重組蛋白的核芬酸序列，其特征在于具有選自下列c)、d)或e)的核苷酸序列c)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQIDNO:2但編碼的氨基,列與SEQIDNO:2所編碼的氨基酸序列相同的核香酸序列；e)在嚴(yán)格雜交條件下與上述c)或d)中的序列雜交，并且編碼具有所述NT-proBNP重組蛋白活性的核香酸序列。3.—種權(quán)利要求1的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于包含以下步驟1)根據(jù)GENEBANK中提供的BNP編碼序列，獲得NT-proBNP的編碼序列SEQIDNO:3，將編碼序列SEQIDNO:3同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子獲得編碼序列SEQIDNO:4,進行NT-proBNP基因的克隆，獲得NT-proBNP基因；2)NT-proBNP基因與載體連接，構(gòu)建NT-proBNP重組質(zhì)粒，獲得NT-proBNP重組質(zhì)粒；3)NT-proBNP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行NT-proBNP重組蛋白的表達(dá)，獲得NT-proBNP重組蛋白；4)NT-proBNP重組蛋白的可溶性鑒定；5)NT-proBNP重組蛋白的純化；6)NT-proBNP重組蛋白的濃度、純度鑒定；7)NT-proBNP重組蛋白的活性鑒定。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟l)包括將編碼序列SEQIDNO:3中第41、54、69、73、76位氨基酸同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子，根據(jù)改造后的基因序列設(shè)計N端引物和C端引物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21。6.才艮據(jù)權(quán)利要求4所述的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于所述的N端引物為SEQIDNO:5或SEQIDNO:6所示的核香酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于所述的C端引物為SEQIDNO:7所示的核苷酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟1)還包括采用核心4莫板法，進行基因拼接PCR擴增所述的NT-proBNP基因。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟2)中使用的載體包括pET32a或pET42a。10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的NT-proBNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟5)包括以下步驟①將含目的NT-proBNP重組蛋白的破菌上清用快流速瓊脂糖凝膠初純化，采用連續(xù)洗脫并收集目的NT-proBNP重組蛋白蛋白峰；②初純化的NT-proBNP重組蛋白用快流速組氨酸標(biāo)簽親和層析柱再次純化，洗脫采用40mM和500mM咪唑階^殳洗脫收集后者；③用脫鹽柱脫鹽和去除咪唑，流動相緩沖為50mMTris-HCl,pH8.0;脫鹽后NT-proBNP重組蛋白內(nèi)加入帶有His標(biāo)簽的重組EK酶，重組EK酶與NT-proBNP重組蛋白量比為1:1000，置于4°C低速搖床24-48小時；⑤再次用快流速組氨酸標(biāo)簽親和層析柱純化及去除重組EK酶，洗脫采用40mM和500mM咪唑階段洗脫，40mM洗下蛋白即為所需NT-proBNP重組蛋白。11.權(quán)利要求1所述的NT-proBNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的NT-proBNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用，其特征在于所述的NT-proBNP重組蛋白用作NT-proBNP免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的NT-proBNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用，其特征在于所述的NT-proBNP重組蛋白用于制備NT-proBNP檢測試劑盒。全文摘要本發(fā)明涉及一種NT-proBNP重組蛋白，其具有選自于下列a)或b)的氨基酸序列a)SEQIDNO1所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后仍具有所述NT-proBNP重組蛋白活性的氨基酸序列；本發(fā)明還涉及編碼上述NT-proBNP重組蛋白的核苷酸序列及上述NT-proBNP重組蛋白的制備方法。上述的NT-proBNP重組蛋白具有與天然NT-proBNP蛋白相同的免疫原性，而且純度高，有更好的穩(wěn)定性，可代替天然NT-proBNP多肽，用作NT-proBNP免疫診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品，并為下一步研究開發(fā)NT-proBNP檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。文檔編號C12N15/16GK101230101SQ200810069299公開日2008年7月30日申請日期2008年1月25日優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日發(fā)明者易維京,鵬李,李淑慧,胡川閩,黃洪濤申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)