轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架及其制備方法

專利名稱：轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架，特別是一種抑制經(jīng)皮冠狀動脈成形 術(shù)或支架植入術(shù)后再狹窄的轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)再狹窄主要是由于介入手術(shù)對血管壁造成的機械性損傷(主要是內(nèi)皮層損傷) 引起內(nèi)皮細胞剝脫和功能紊亂，導(dǎo)致?lián)p傷部位長期暴露在血液環(huán)境中，誘發(fā)自身免疫應(yīng) 激和炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)血液中單核細胞和血管中膜平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移并增殖，最終形 成再狹窄。目前再狹窄問題已成為血管介入治療面臨的主要挑戰(zhàn)和研究熱點。血管內(nèi)皮細胞是一類功能復(fù)雜的細胞，分泌多種調(diào)節(jié)血管功能的活性物質(zhì),活躍參 與血小板的功能調(diào)節(jié)、血漿促凝因子激活、活化凝血因子清除及纖溶過程，與心血管疾 病密切相關(guān)。VanderGiessen等首先進行了血管內(nèi)支架內(nèi)皮化研究。隨后的部分研究表 明，金屬支架表面內(nèi)皮化可以防止急性血栓的形成，降低血栓的發(fā)生率，并通過早期修 復(fù)受損動脈的局部內(nèi)皮，抑制平滑肌細胞的增生和遷移，預(yù)防再狹窄的發(fā)生，因而可能 是一種較為理想的方法。目前對于血管內(nèi)支架再內(nèi)皮化研究較多，并且分別研究了支架再內(nèi)皮化的幾個關(guān)鍵技術(shù)(1)種子細胞的來源；(2)細胞的種植技術(shù)；(3)篩選適用于細胞與血管內(nèi)支架的粘附基質(zhì)。體外研究用內(nèi)皮細胞常取自牛主動脈，但在體內(nèi)實驗中，為了避免排斥反應(yīng)的發(fā)生， 自體內(nèi)皮細胞無疑是進行細胞種植的最佳選擇。在早期實驗研究中，血管內(nèi)皮細胞主要 取自大血管。但從大血管收集血管內(nèi)皮細胞有一定的危險性，臨床應(yīng)用有限，近來從表 淺靜脈收集血管內(nèi)皮細胞，取自自體的大隱靜脈或頸外靜脈，常采用胰蛋白酶或膠原酶 消化分離內(nèi)皮細胞。臨床上要求種植內(nèi)皮細胞操作越簡單，時間越短越好，因此僅靠從 體靜脈中獲取的原代血管內(nèi)皮細胞，尚不能滿足種植的要求。為了獲得足夠數(shù)量的內(nèi)皮細 胞，1990年Zilla等建立了快速、大規(guī)模擴增血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)技術(shù)，其方法是取自體 淺靜脈內(nèi)皮細胞進行原代培養(yǎng)后，以l : (30-40)的比例作單次傳代培養(yǎng)，在3周左右， 細胞數(shù)量激增300余倍，足以滿足種植的需要。隨著對干細胞研究的深入，人們開始從骨 髓中分離和培養(yǎng)內(nèi)皮細胞。Shattacharya等利用CD34+骨髓細胞可以分化成內(nèi)皮細胞的特 點，先用免疫磁珠技術(shù)富集CD34+骨髓細胞，然后種植到移植物上，與未種植的相比，內(nèi) 皮化的面積前者明顯大于后者。由于胚胎干細胞具有分化成人體內(nèi)任何細胞的潛能，干 細胞尤其是成體干細胞研究技術(shù)迅速發(fā)展和成熟，利用細胞克隆技術(shù)和胚胎干細胞定向 培養(yǎng)技術(shù)建立起基本上無免疫源性的內(nèi)皮細胞株也許能解決內(nèi)皮細胞來源問題且具有無 可比擬的優(yōu)點，值得探討。支架內(nèi)皮化的效果取決于種植的內(nèi)皮細胞數(shù)目、細胞的黏附率、貼壁細胞暴露于血 流后的保留率。其中如何提高內(nèi)皮細胞的黏附率，是目前最需要解決的問題。細胞在材 料上的黏附包括兩個過程貼附過程和黏附過程。貼附過程非常迅速，是細胞與材料之 間的一些物理、化學(xué)作用，如范德華力、離子力等所引起的，目前主要采取旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的 方法使細胞與血管內(nèi)支架表面充分接觸、貼附。黏附過程是由材料與一些生物活性分子 如細胞外基質(zhì)蛋白、細胞膜蛋白、細胞骨架蛋白等相互作用而引起，是十分關(guān)鍵的過程。 只有當細胞與材料發(fā)生適當?shù)酿じ?，才能在材料上進行鋪展生長，乃至分化、增殖。在 血管內(nèi)支架表面涂覆促細胞粘附的基質(zhì)，能夠增加細胞在支架表面的粘附和生長?；蛐揎椀膬?nèi)皮細胞在血管內(nèi)支架上接種是一種利用細胞作為傳遞藥物平臺的新技 術(shù)。所謂基因修飾就是向靶細胞內(nèi)引入外源基因，以糾正其基因缺陷或加強某基因表達。 研究表明，體外培養(yǎng)種植的內(nèi)皮細胞較體內(nèi)生長內(nèi)皮細胞在功能方面有所不足。基因工 程技術(shù)的迅速發(fā)展，使得研究者可以對內(nèi)皮細胞進行基因修飾，加強其分泌細胞因子和 黏附生長能力以及抗血栓功能。與支架表面吸附或交聯(lián)生長因子蛋白或抗血栓形成的藥 物相比，轉(zhuǎn)入的外源基因可持續(xù)表達目的蛋白，應(yīng)當具有更好的效果。目前主要從兩個 方面考慮目的基因的選擇， 一類是能夠促進內(nèi)皮細胞增殖如VEGF, FGF此類生長因子；另 一類是具備抑制平滑肌細胞增殖功效的基因，如eN0S， wtP53等基因。因此，我們將能夠促進內(nèi)皮細胞增殖和能夠抑制平滑肌細胞增殖基因分別轉(zhuǎn)染或共 同轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞或干細胞，再通過超聲霧化噴涂技術(shù)制備血管內(nèi)支架表面的粘附基質(zhì)涂 層，然后進行血管內(nèi)支架和轉(zhuǎn)基因細胞的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)制備細胞涂層，以提高支架植入術(shù)后 支架表面的再內(nèi)皮化速度，最終達到抑制血管內(nèi)再狹窄的目的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過加速內(nèi)皮細胞修復(fù)防治經(jīng)皮 冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)后或支架植入術(shù)后再狹窄，最終能達到消除血管內(nèi)再狹窄的效 果的轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架及其制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架，它具有金屬裸支架，在所述的金屬裸支架表面 有處理層，在處理層上有粘附基質(zhì)涂層，在粘附基質(zhì)涂層上有細胞涂層，細胞涂層是通過 目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞獲得。所述的金屬裸支架為不銹鋼支架、鎳鈦記憶合金支架、鈷基合金支架以及可降解的 鎂合金支架。所述的處理層為低溫等離子體涂層，其表面粗糙度為5 15陶。 所述的粘附基質(zhì)涂層為蛋白涂層、序列肽涂層中的一種。所述的蛋白為明膠、IV型膠原蛋白、多聚賴氨酸、纖維連接素等具有促進細胞粘附 功能的蛋白中的一種或多種。所述的序列肽為具有促進細胞粘附功能的序列肽，如RGD序列肽涂層。所述的細胞為內(nèi)皮細胞或具有向內(nèi)皮細胞分化潛能的干細胞。上述轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架的制備方法，包括以下步驟-a) 、獲取目的基因，采用提取基因組再PCR擴增出目的基因片段，或者是提取目的 基因的RNA再通過RT-PCR法擴增獲取中的 一種；b) 、目的基因的真核細胞表達載體的構(gòu)建與擴增；所述的目的基因的真核表達載 體為腺病毒、質(zhì)粒中的一種；所述腺病毒為AdEasyTM腺病毒載體系統(tǒng)，所述質(zhì)粒可以為 PcD2、 PcDNA3. l質(zhì)粒。c) 、獲取細胞，采用的細胞可以是內(nèi)皮細胞，也可以是干細胞。內(nèi)皮細胞可由消化 血管內(nèi)皮層獲得，干細胞可以來源于骨髓或者是外周血，具有向內(nèi)皮分化的潛能。d) 、金屬裸支架表面改性采用低溫等離子體技術(shù)對所用的金屬裸支架表面處理， 使表面形成5 15Mm粗糙度的處理層，更有利于粘附基質(zhì)涂層和細胞的粘附；e) 、制備粘附基質(zhì)涂層制備粘附基質(zhì)涂層的方法為超聲霧化噴涂法；將粘附基質(zhì)涂層中的蛋白或肽段用溶劑，制備成相應(yīng)濃度的溶液；支架轉(zhuǎn)動速率保 持在每分鐘30 — 60轉(zhuǎn)，噴涂時間為0.5 — 2分鐘，將涂層置于真空干燥箱里，干燥時間24 一48小時，干燥溫度30—50度干燥后重復(fù)噴涂，重復(fù)次數(shù)2 — 3次，每次噴涂時間O. 5 — l分鐘，控制涂層表面粗糙度在2 — 5納米，厚度為5 15微米左右；f) 、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)制備轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架 制備細胞涂層的方法為旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法；將血管內(nèi)支架固定于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管內(nèi)，與轉(zhuǎn)基因細胞共旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因細胞接種密 度為lXl()5個/毫升，旋轉(zhuǎn)速度為0.4轉(zhuǎn)每分鐘，旋轉(zhuǎn)時間為6小時。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)完成后，取 下支架，再靜態(tài)培養(yǎng)24-48小時，成品可用于進一步的研究或檢測。本發(fā)明旨在預(yù)先在血管內(nèi)i架表面涂覆一層轉(zhuǎn)基因細胞， 一方面通過對目的基因的 高水平表達來增強損傷的血管內(nèi)'皮層的修復(fù)和抑制平滑肌細胞增殖，另一方面通過外源 細胞的增殖達到加速血管內(nèi)支架表面內(nèi)皮化的目的。動物實驗結(jié)果可行、安全、有效， 能有效的抑制金屬支架或球囊損傷的再狹窄。所述的金屬支架涂層與金屬支架之間涂覆 緊密，生物相容性良好，最終達到抑制血管內(nèi)支架再狹窄的目的。


圖1是本轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細胞覆蓋血管內(nèi)支架的剖面結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細胞覆蓋血管內(nèi)支架的光學(xué)顯微鏡圖片(X400)。 圖3是轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細胞覆蓋血管內(nèi)支架的掃描電鏡圖片(XIOO)。 圖4是轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細胞覆蓋血管內(nèi)支架的免疫熒光染色圖片(X200)。 圖5是轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細胞覆蓋血管內(nèi)支架植入兔腹主動脈一周后掃描電鏡觀察支架表 面的再內(nèi)皮化情況(X50)。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例 范圍之中參見圖1:本轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架是在傳統(tǒng)的金屬裸支架4的金屬表面設(shè) 處理層1,在處理層1上設(shè)粘附基質(zhì)涂層2，在粘附基質(zhì)涂層上設(shè)細胞涂層3,細胞涂層3 是通過目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞獲得。其中，處理層1為低溫等離子體涂層，其表面粗糙度為5 15Wn。粘附基質(zhì)涂層2 為蛋白涂層、序列肽涂層中的一種。蛋白為明膠、IV型膠原蛋白、多聚賴氨酸、纖維連 接素等具有促進細胞粘附功能的蛋白中的一種或多種。序列肽為具有促進細胞粘附功能 的序列肽，如RGD序列肽涂層。細胞涂層的細胞為目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞或具有 向內(nèi)皮細胞分化潛能的干細胞。上述轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架按以下步驟制備1. 獲取目的基因VEGF^目的基因VEGF^采用逆轉(zhuǎn)錄法獲得人白血病細胞(HL-60)，用TRIZOL常規(guī)提取總 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行PCR反應(yīng)。取cDNA反應(yīng)液2ul，用VEGF^的上游引物為5' GGGGGATCCGCCTCCGAAACCATGAACTT 3',下游引物為5' CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGATCTGGTT 3'，設(shè)計有BaraH I和EcoR I酶切位點，通過PCR進行擴增。PCR條件為95'C預(yù)變性5分鐘， 94°C 45秒，55°C 40秒，72°C l分鐘，36個循環(huán)后，72'C繼續(xù)反應(yīng)5分鐘，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳分離,DNA膠回收純化試劑盒回收純化，獲得VEGF^ (分子量為550bp)基因片 段。2. 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建真核細胞表達載體以PcD2.0為載體，重組？002.0- VEGFm真核表達質(zhì)粒；應(yīng)用fcoWI 、歷'"Z m雙酶切 PcD2.0載體和純化的目的基因VEGF^，用T4 DNA連接酶4。C連接過夜,連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化 DH5a感受態(tài)細胞，冰浴30分鐘，置42'C水浴90秒，再冰浴1分鐘。然后加入LB培養(yǎng)液O. 8 ml，于37'C搖床上振搖1小時，離心后接種于氨卞青霉素選擇培養(yǎng)板中，37'C下培養(yǎng)16小 時。挑取細菌克隆，接種于氨卞青霉素選擇培養(yǎng)液中，置37t:振搖培養(yǎng)擴增。取5ml菌液， 培養(yǎng)后用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，DNA序列測定及酶切鑒定后，得到分子量為 5. 6kb重組質(zhì)粒PcD2. 0-VEGFm，重復(fù)用試劑盒抽提質(zhì)粒后無菌保存于無核酶水中，經(jīng)紫外 分光光度計檢測，0D260/0D280值為L8，其純度達到轉(zhuǎn)染要求，置于-20'C,備用。3. 內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)、鑒定及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細胞系)經(jīng)形態(tài)、表面抗原和功能的鑒定后進行 VEGFm的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗。用陽離子脂質(zhì)體2000進行轉(zhuǎn)染，實驗結(jié)果通過RT-PCR和免疫 細胞化學(xué)鑒定。4. 金屬支架表面改性，在表面形成低溫等離子處理層l;采用低溫等離子體技術(shù)、電鍍或者其他化學(xué)方法對本發(fā)明所用的金屬支架表面處理， 以利于涂層的緊密涂覆。本發(fā)明采用低溫等離子體技術(shù)進行金屬支架的表面改性。支架的表面改性是這樣進行的采用的裝置是一個鐘式的直流電源反應(yīng)體系。等離子體發(fā)生器是由MDX-1K磁電管驅(qū)使電源提供。兩塊平行放置的不銹鋼板(25.4 X 25.4 X 0.16 cm)構(gòu)成兩個陽極，磁電管安放于距兩板15.5cm處。 一個鐵環(huán)(外徑17. 5 cm， 內(nèi)徑13.8 cm，厚O. 16 cm)和一塊鐵盤(直徑5 cra，厚0. 16 cm)同軸放于2塊陽極板 的外側(cè)作為磁場分配器。八條永久磁鐵等距的環(huán)形放置于鐵板和鐵環(huán)上，南極指向鐵板 的中心。每塊磁鐵的磁場強度范圍是700—800高斯。不銹鋼和鎳鈦合金支架作為等離子 體反應(yīng)系統(tǒng)的陰極放置于兩塊平行的陽極之間。把已消毒的金屬支架放于等離子體反應(yīng)器中作為其陰極。先用真空泵將反應(yīng)室抽空 至低于1毫托。由于過程的類型不同，可以是一個單體或是氣體混合物進入反應(yīng)室，本 發(fā)明是以TMS (三甲基硅垸)和(U氧氣)為反應(yīng)氣體。MKS流量儀用于記錄和測量進入的 單體或混合氣體的流速，用壓力控制器來控制進入反應(yīng)室的氣體的壓力。待系統(tǒng)壓力穩(wěn) 定于25毫托后，啟動直流電源持續(xù)預(yù)先規(guī)定的時間(2-5分鐘)后在金屬支架上獲得低 溫等離子體涂層l，操作結(jié)束后，剩余的氣體被排出，系統(tǒng)壓力恢復(fù)。反應(yīng)器的真空狀態(tài) 消失，此時可將支架取出以用于進一步的實驗。5. 制備粘附基質(zhì)涂層2制備粘附基質(zhì)涂層2的方法為超聲霧化噴涂法。將明膠、多聚賴氨酸和水在室溫25-35 °C，充分混合，制備明膠濃度為2—6毫克/毫升，多聚賴氨酸為10微克/毫升的溶液。支 架轉(zhuǎn)動速率保持在每分鐘30—60轉(zhuǎn)，噴涂時間為0.5—2分鐘，將涂層置于真空干燥箱里， 干燥時間24—48小時，干燥溫度30—40度。6. 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)制備血管內(nèi)支架將血管內(nèi)支架固定于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管內(nèi)，與轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細胞共旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細 胞接種密度為"105個/毫升，旋轉(zhuǎn)速度為0.4轉(zhuǎn)每分鐘，旋轉(zhuǎn)時間為6小時。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)完 成后，取下支架，再靜態(tài)培養(yǎng)24-48小時，在光學(xué)顯微鏡下觀察，細胞在支架表面粘附生 長(見圖2)。并通過掃描電鏡檢測，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)后血管內(nèi)支架表面粘附的細胞數(shù)量多和鋪 展均勻(見圖3)，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)支架表面粘附的細胞能很好的表達代表內(nèi)皮細胞特 性的vWF因子(見圖4)。7. 動物實驗采用標準球囊導(dǎo)管技術(shù)，將本發(fā)明支架和對照支架植入兔腹主動脈，轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細 胞覆蓋的血管內(nèi)支架組和裸支架、明膠蛋白涂層支架對照組樣本容量均為10。 1周后處 死2只，剩下的分別于手術(shù)后4周后處死4只，12周后處死余下4只。將處死的動物體 內(nèi)病變處支架連同血管取出，制作掃描電鏡觀察樣本，觀察血管內(nèi)支架表面的再內(nèi)皮化 程度；制作透射電鏡觀察樣本，確定覆蓋于支架表面內(nèi)膜的細胞成分；制作病理切片， 觀察支架的再狹窄程度和增生內(nèi)膜的厚度。動物實驗結(jié)果證明基因支架安全、有效。結(jié)果顯示，與對照組相比，細胞支架表面內(nèi)皮層在一周時就覆蓋完全(見圖5)，而裸支架表面內(nèi)皮完全撕裂，平滑肌暴露，極少 部分發(fā)生再內(nèi)皮化，支架表面有血栓形成，蛋白涂層支架表面內(nèi)皮化不完整，有大量血 細胞和血小板聚集。說明轉(zhuǎn)基因內(nèi)皮細胞覆蓋的血管內(nèi)支架能顯著提高血管內(nèi)支架表面 內(nèi)皮化速度，具有抗血栓和抗再狹窄的功效。
權(quán)利要求
1、一種轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架，它以金屬裸支架(4)為基體，在所述金屬裸支架(4)的金屬表面有處理層(1)，在處理層(1)上有粘附基質(zhì)涂層(2)，在粘附基質(zhì)涂層上有細胞涂層(3)，細胞涂層(3)是通過目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞獲得，其特征為所述的金屬裸支架(4)為不銹鋼支架、鎳鈦記憶合金支架、鈷基合金支架或可降解的鎂合金支架；所述的處理層(1)為低溫等離子體涂層，其表面粗糙度為5～15μm；所述的粘附基質(zhì)涂層(2)為蛋白涂層、序列肽涂層中的一種；所述的細胞涂層上的細胞為目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞或具有向內(nèi)皮細胞分化潛能的干細胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架，其特征為所述蛋白涂層中的 蛋白為具有促進細胞粘附功能的明膠、IV型膠原蛋白、多聚賴氨酸、纖維連接素中的一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架，其特征為所述序列肽涂層中 的肽段為具有促進細胞粘附功能的肽段。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架，其特征為所述序列肽涂層為 RGD肽或其他序列肽涂層。
5、 一種制備權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架的方法，其特征在于， 該包括以下步驟1) 、獲取目的基因；2) 、目的基因的真核細胞表達載體的構(gòu)建與擴增；3) 、獲取細胞采用的細胞為內(nèi)皮細胞或干細胞；4) 、對金屬裸支架(4)進行表面改性，獲得處理層(1);5) 、在處理層(1)上制備粘附基質(zhì)涂層(2);6) 、通過旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)在粘附基質(zhì)涂層(2)制備轉(zhuǎn)基因細胞涂層(3)，覆蓋的血管內(nèi)支架。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述目的基因采用提取基因組再PCR 擴增出目的基因片段，或者是提取目的基因的RNA再通過RT-PCR法擴增獲取；目的基因的真 核表達載體為腺病毒、質(zhì)粒中的一種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述腺病毒為AdEasyTM腺病毒載 體系統(tǒng)，所述質(zhì)粒為PcD2或PcDNA3. 1真核表達質(zhì)粒載體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述金屬裸支架表面改性采用低溫等離子體技術(shù)對所用的金屬裸支架表面處理，使表面形成5 15陶粗糙度的處理層(1)。
9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，采用超聲霧化噴涂法制備所述的粘 附基質(zhì)涂層(2):將粘附基質(zhì)涂層中的蛋白或序列肽用溶劑制備成溶液；支架轉(zhuǎn)動速率保持在每分鐘30—60轉(zhuǎn)，噴涂時間為0.5—2分鐘，將粘附基質(zhì)涂層置于 真空干燥箱里，干燥時間24—48小時，干燥溫度30—40度；干燥后重復(fù)噴涂，重復(fù)次數(shù)2—3次，每次噴涂時間0.5—1分鐘，控制粘附基質(zhì)涂層表 面粗糙度在2 — 5納米，厚度為5 15微米。
10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，通過旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法制備細胞涂層(3)， 將血管內(nèi)支架固定于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管內(nèi)，與轉(zhuǎn)基因細胞共旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)基因細胞接種密度為IX 105個/毫升，旋轉(zhuǎn)速度為0. 4轉(zhuǎn)每分鐘，旋轉(zhuǎn)時間為6小時；旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)完成后，取下支架， 再靜態(tài)培養(yǎng)24-48小時，得成品。
全文摘要
本發(fā)明請求保護一種轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架，其在金屬裸支架表面依次設(shè)低溫等離子體處理層、粘附基質(zhì)涂層和細胞涂層。粘附基質(zhì)涂層為蛋白涂層、序列肽涂層中的一種，細胞涂層是通過目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞獲得。制備該血管內(nèi)支架包括以下步驟獲取目的基因；目的基因的真核細胞表達載體的構(gòu)建與擴增；獲取細胞；金屬支架表面改性；制備粘附基質(zhì)涂層；旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)制備轉(zhuǎn)基因細胞覆蓋的血管內(nèi)支架。本發(fā)明一方面通過對目的基因的高水平表達來增強損傷的血管內(nèi)皮層的修復(fù)和抑制平滑肌細胞增殖，另一方面通過外源細胞的增殖達到加速血管內(nèi)支架表面內(nèi)皮化的目的，涂層與支架之間涂覆緊密，生物相容性良好，能最終達到抑制血管內(nèi)支架再狹窄的目的。
文檔編號C12N15/79GK101269242SQ20081006925
公開日2008年9月24日 申請日期2008年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日
發(fā)明者雪 吳, 唐朝君, 怡 曹, 王貴學(xué), 麗 肖, 翔 謝, 才 邢 申請人:重慶大學(xué)